PEMBUATAN MEDIA
PEMBUATAN MEDIA
Oleh : Oleh : Nama
Nama : : MasrurohMasruroh NIM NIM : : B1J013046B1J013046 Rombongan Rombongan : : II Kelompok Kelompok : : 11 Asisten
Asisten : : Firman Firman Nur Nur FahmiFahmi
LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI ZAT PENGATUR TUMBUH LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI ZAT PENGATUR TUMBUH
TUMBUHAN TUMBUHAN
KEMENTERIAN
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI RISET, TEKNOLOGI DAN PDAN PENDIDIKAN TINGGENDIDIKAN TINGGII UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO PURWOKERTO 2017 2017
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Keberhasilan kultur in vitro ditentukan oleh media dan macam tanaman. Media mempunyai 2 fungsi utama, yaitu menyuplai nutrisi dan untuk mengarahkanj pertumbuhan melalui zat pengatur tumbuh. Adanya variasi media untuk tanaman
menimbulkan beberapa macam media yang digunakan yaitu Murashige dan Skoog (MS), Gamborg, Linsmaier, Nitsch dan Woody Plant Medium (WPM). Selain media, zat pengatur tumbuh juga memegam peranan juga memegang peranan penting dalam
melakukan teknik kultur. Zat pengatur tumbuh adalah kelompok hormone, baik hormone tumbuhan alami maupun sintetis (Elimasni, 2006).
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Media kultur fisiknya dapat berbentuk padat atau cair. Media berbentuk padat menggunakan pemadat media seperti agar. Media kultur yang memenuhi syarat adalah yang mengandung nutrient makro dan mikro dalam kadar dan perbandingan tertentu, sumber energy (sukrosa), serta mengandung berbagai macam vitamin dan ZPT (Tuhuteru, 2012).
B. Tujuan
II. TELAAH PUSTAKA
Media merupakan suatu bahan yang sangat penting dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf (Yusnita, 2003).
Media invitro yang biasa digunakan biasa berupa media padat sebab memiliki beberapa keuntungan antara lain penggunaan eksplan terkecil akan lebih muda terlihat,
eksplan berada di atas permukaan media sehingga tidak perlu memerlukan alat Bantu untuk aerasi, tunas dan akar akn lebih muda tumbuh pada media yang diam. Namun pada media cair juga terdapat beberapa keuntungan yang tidak dimiliki pada media padat yaitu antara lain tidak memerlukan tambahan bahan pemadat, tepat untuk proses kultur protoplasma maupun kultur sel, eksudat yang dikeluarkan oleh eksplan tidak terakumulasi disekitar eksplan, kontak ekslan dengan media lebih besar (George and Sherington, 1984).
Dalam prosesnya, keberhasilan kultur jaringan selain dikarenakan oleh kondisi lingkungan yang terkendali juga ditentikan oleh media kultur. Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan. Media kultur merupakan komponen faktor lingkungan yang menyediakan unsure pertumbuhan tanaman seperti unsure hara makro, unsure hara mikro, karbohidrat, vitamin dan zat pengatur tumbuh, param-garam organic, persenyawaan komplek alamiah, arang aktif dan bahan pemadat (George and
Sherington, 1984).
Media kultur yang biasa digunakan adalah media dengan formulasi Murashige and Skoog (MS). Media MS merupakan media dasar yang mempunyai formulasi yang sangat lengkap. Komposisi media MS ini pada umumnya dapat digunakan pada hampir semua jenis tanaman (Wattimena,1992). Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. Resep media dasar adalah resep
kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar pada umumnya diambil dari nama penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama kali dalam kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya. Beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain:
1) Media dasar Murhasige dan skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur, terutama pada tanaman herbaceous.
2) Media Knop dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. 3) Media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain.
4) Media dasar White (1934) yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat. 5) Media dasar Vacin dan Went yang biasa digunakan untuk kultur jaringan
anggrek.
6) Media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel.
7) Media dasar Schenk dan Hildebrandt (1972) atau media SH yang cocok untuk kultur jaringan tanaman-tanaman monokotil.
8) Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM) 9) Media N6 untuk serealia terutama padi.
III. MATERI DAN METODE
A. Materi
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu gelas ukur, magnetic stirrer, pH meter, beaker glass, botol kultur, LAF, kompor, mikropipet and tip dan panci.
Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu larutan stok, gula, agar, HCl, NaOH, ZPT BAP dan IAA.
B. Metode
1. Siapkan alat dan bahan yang digunakan
2. Larutan stok A, B, C, D, E dicampurkan kemudian dihomogenkan dengan magnetic stirrer
3. Gula ditambahkan dan dihomogenkan kembali
4. Setelah ditambahkan gula, ditambahkan agar sebagai pemadat 5. Aquades ditambahkan hingga volume nya 1000 ml
6. pH diukur dengan pH meter jika <5,83 ditambahkan NaOH dan bila >5,83 ditambahkan HCl
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Gambar 3.1. Bahan yang digunakan pada pembuatan media MS
B. Pembahasan
Media merupakan suatu bahan yang penting untuk pertumbuhan kultur. Media untuk pertumbuhan kultur dapat berupa media padat dan media cair. Media padat biasanya digunakan untuk mengkulturkan kalus kemudian diinduksi menjadi tanaman lengkap, sedangkan media cair biasanya digunakan untuk kultur sel. Komponen yang penting dalam suatu media adalah senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan suplemen organik (Yuwono 2008). Media Dasar Murashige Skoog (MS) yang digunakan pada praktikum ini termasuk media kultur yang komposisi unsurnya lebih lengkap dibandingkan media dasar lainnya,walaupun demikian perlu ditambah suplemen seperti air kelapa untuk mendorong pertumbuhan jaringan, akan tetapi pada praktikum ini tidak dilakukan penambahan air kelapa. Keistimewaan media MS adalah kandungan nitrat, kalium, dan amoniumnya yang tinggi (Wetter dan Constabel 1991).
Media murashige and skoog merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali
lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur (Hadioetomo, 1993). Media MS
mengandung hara makro dan mikro seperti NH4NO3, KNO3, CaCl3, 2H2O, MgSO4,
7H2O, KH2PO, FeSO4, NA2EDTA, MNSO4, CuSO4, CoCl2 dan CuSO4. Medium ini
umumnya menggunakan bahan bahan dengan tingkat kemurnian yang tinggi (pro-analis) (Shintiavira et al., 2012).
Menurut Nugroho dan Sugianto (1997), unsur hara di dalam media kultur tersusun atas beberapa komponen, sebagai berikut
2. Hara mikro selalu digunakan. Ada beberapa komposisi media yang hanya menggunakan besi atau besi-kelat.
3. Vitamin-vitamin dan asam-asam amino serta N organik, umumnya ditambahkan dalam jumlah yang bervariasi. Vitamin, asam amino dan bahan organic lain seperti myo inositol merupakan komponen media yang berpengaruh baik terhadap pertumbuhan kultur. Kelompok vitamin yang sering digunakan dalah dari golongan vitamin B yaitu Thiamin-HCL (B1), Pyrodoxin-HCL (B6), ASAN Nikotinat dan Riboflavin (B2).
4. Sumber energi dan karbon berupa gula, merupakan keharusan, kecuali untuk tujuan yang sangat khusus. Konsentrasi optimum sukrosa tergantung dari jenis jaringan yang dikultur. Pada kultur kalus dan pucuk, konsentrasi sukrosa yang digunakan adalah antara 2-4 % yang merupakan konsentrasi optimum. Namun dalam kultur embrio, konsentrasi gula dapat mencapai 12 %.
5. Zat Pengatur Tumbuh (ZPT): ada beberapa jenis, antara lain: auxin, sitokinin, geberelin, asam absisat, etilin dan sebagainya. ZPT merupakan komponen penting dalam media kultur jaringan. Jenis dan konsentrasi ZPT yang digunakan sangat tergantung pada jenis taman dan tujuan dari kultur tersebut.
6. Buffer (chelating agent). Penambahan asam amino seringkali juga bersifat sebagai buffer organik. Penambahan KH2PO4 sendiri tidak efektif sebagai buffer. Banyak peneliti terdahulu seperti Tausson dan Kordan (George & Sherringtone, 1984) menyarankan untuk menambahkan Fe SO4 dan Na-EDTA dalam media untuk bertindak sebagai buffer.
7. Bahan Pemadat. Bahan ini digunakan untuk membuat media padat, yang biasa digunakan adalah agar. Keuntungan dari pemakain agar adalah Agar membeku pada temperatur ≤ 45o C dan mencair pada temperature 100o C, sehingga dalam kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil. R Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman. R Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media.
8. Faktor penting lain adalah pH yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain
memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor :
a. Kelarutan dari garam-garam penyusun media
b. Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain c. Efisiensi pembekuan agar.
Salah satu komponen yang juga menentukan keberhasilan kultur jaringan dalah jenis dan konsentrasi ZPT yang digunakan Jenis dan konsenyrasi ZPT yang digunakan
tergantung pada tujuan dan tahap pengkulturan. Pengakulturan untuk merangsang pembentukan akar biasanya menggunakan ZPT Auksin. Jenis auksi yang sering digunakan adalah IBA dan NAA. (Nugroho dan Sugianto, 1997). Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam media MS adalah auksin (IAA) dan sitokinin (kinetin). Kedua homon ini mempengaruhi pertumbuhan akar, tunas, dan kalus berdasarkan keseimbangan konsentrasi dari kedua
ZPT tersebut yang terkandung dalam media. Pada konsentrasi yang hampir tepat sama antara auksin dan sitokinin akan menghasilkan kalus. Apabila sitokinin lebih besar dari auksin akan menginduksi tunas, sedangkan konsentrasi auksin lebih besar dari sitokinin akan menginduksi perakaran yang lebi cepat (Trigiano and Gray 2000).
Hasil media yang telah dituang ke dalam tabung atau botol kultur selanjutnya disterilkan dengan menggunakan autoklaf selama 20 menit dengan suhu 1210c tekanan 15 psi hal ini bertujuan untuk bekerja secara aseptik dan media tidak terkontaminasi selama proses pembuatannya. Sterilisasi sendiri dapat dilakukan dengan beberapa cara yang umum digunakan adalah dengan autoklaf, pemanasan kering dalam oven, penyaringan, dan sterilisasi dengan bahan kimia. Pemilihan cara sterilisasi dipertimbangkan dari sifat bahan yang akan disetrilisasi. Media MS yang telah disterilkan kemudian didingikan, setelah itu disimpan dalam kulkas dengan suhu 40c agar komposisi bahan dalam media tidak rusak. Media MS yang telah dibuat diperoleh
dalam keadaan steril artinya tidak terkontaminasi, dan digunakan dalam praktikum selanjutnya.
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa pembuatan media MS berhasil dilakukan dengan tidak adanya kontaminasi atau dapat
dikatakan pekerjaan yang dilakukan telah aseptik. Media MS yang digunakan ini terdiri atas garam-garam anorganik, vitmin ZPT,asam amino, larutan hara makro dan mikro media.
B. Saran
Lebih diperhatikan lagi dalam masalah waktu agar praktikum bisa dikerjakan sampai selesai oleh praktikan.
DAFTAR REFERENSI
George, E.F. & P.D. Sherrington. 1984. Plant propagation by tissue culture. Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd ., Basingstoke, England. Hadioetomo,R.S. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi.
Gramedia: Jakarta.
Nugroho, A dan H. Sugianto. 1997. Pedoman Pelaksanaan Tehnik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya, Jakarta.
Mahmad,N. Rosna M.T.Othman,R.Saleh, A. Hasbullah, N.A and H. Elias. 2014.Effects of NAA and BAP, Double-Layered Media, and Light Distance on In Vitro Regeneration of Nelumbo nucifera Gaertn. (Lotus), an Aquatic Edible Plant. The Scientific World Journal , 1-8.
Sinthiavira, H. Soedarjo, M. Suryawati dan Winarto, B. 2012. Studi Pengaruh Substitusi Hara Makro Dan Mikro Media Ms Dengan Pupuk Majemuk Dalam Kultur In Vitro Krisan. J Hort , 21(4): 334-341.
Trigiano, RN and Gray DJ. 2000. Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises. Boca Raton: CRC Press.
Wetter LR and Constabel F. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman. Diterjemahkan oleh Widianto MB. Bandung: ITB Press.
Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien. AgroMedia Pustaka. Jakarta.
