Uji Mikrobiologi untuk
Produk Non‐steril
Marlia Singgih Wibowo Sekolah Farmasi ITB
• Pembahasan mencakup : “microbial enumeration tests” dan “tests for specified micro‐organisms” • Untuk uji , gunakan campuran dari beberapa
bagian yang di sampling : bulk bahan baku atau dari beberapa isi wadah yang jumlahnya cukup • Jika sample diencerkan dengan fluid medium, uji
harus dilakukan secepat mungkin, secara hati2 untuk mencegah biohazard.
Acuan
• USP • EP
Microbial Enumeration Tests
• Uji kuantitatif untuk menghitung jumlah mesophilic bacteria dan fungi , yang tumbuh dibawah kondisi aerob.
• Uji ini dilakukan terutama untuk menentukan apakah suatu senyawa atau produk memenuhi syarat atau comply dengan persyaratan kualitas mikrobiologi.
• Jumlah sampel dan interpretasi hasil nya harus sesuai dengan instruksi pada acuan yang digunakan.
• Metode yang digunakan tidak dapat digunakan untuk sediaan atau produk yang mengandung mikroorganisme viabel sebagai active ingredients.
• Metode Alternative , termasuk metode instrumentasi dan
otomatis, dapat digunakan sepanjang ekuivalen dengan metode Pharmacope.
• Jika produk yang diuji memiliki aktivitas antimikroba, maka harus dilakukan penambahan larutan penetral (hrs di neutralized)
• Jika inactivator digunakan utk tujuan tersebut, maka efektivitas nya dan ke “tidak toksik” an nya harus diuji terhadap mikroorganisme.
• Jika senyawa aktif‐permukaan digunakan dalam menyiapkan sampel, bahan tersebut harus diuji ke
“tidak toksik” an nya, dan harus diuji kompatibilitas nya dengan bahan inaktivator yang digunakan.
Enumeration Methods
• Dapat menggunakan membrane filtration method, atau the plate‐count methods. Metode most probable number (MPN)
biasanya kurang akurat, namun untuk sampel yang rendah bioburden nya, dapat pula
digunakan.
• Pemilihan metode berdasarkan : nature of the product , dan batas mikroorganisme yang
dipersyaratkan .
• The suitability of the chosen method harus established.
Growth Promotion Test, Suitability of the
Counting Method and Negative Controls
• Kemampuan metode uji untuk mendeteksi
mikroorganisme dengan adanya produk harus diuji.
• Suitability harus dikonfirmasi jika ada
perubahan dalam kinerja uji, yang dapat mempengaruhi hasil uji
Persiapan mikroorganisme uji
• Gunakan standardised stable suspensions of test strains atau lihat dalam tabel yang
disiapkan pada Farmakope
• Gunakan buffered sodium chloride‐peptone solution pH 7.0 atau phosphate buffer
solution pH 7.2 untuk suspensi mikroorganisme ;
• Untuk spora Aspergillus niger spores, gunakan 0.05 % Polysorbate 80 ke dalam buffer.
Negative control
• Gunakan biakan mikroorganisme untuk inokulasi tidak lebih dari 5 passages dari master seed‐lot.
• Gunakan suspensi dalam waktu 2 jam atau 24 jam jika disimpan dalam suhu 2 – 8°C. Sebagai alternatif,
encerkan fresh suspension dari vegetative cells A. niger atau B. subtilis, lalu simpan pada 2 –8°C untuk periode waktu tertentu
• Untuk verifikasi kondisi uji, gunakan negative control dengan pengenceran yang sama, harusnya tidak akan ada pertumbuhan setelah inkubasi.
• Jika negative control menunjukkan pertumbuhan, maka perlu dilakukan inverstigasi.
Growth Promotion Test untuk media
• Lakukan uji untuk “ready‐prepared “medium dan setiap batch medium, baik yang dehydrated
medium atau dari ingredients described.
• Inokulasi pada media casein soya bean digest broth dan casein soya bean digest agar dengan sejumlah mikroorganisme (tidak lebih dari 100 CFU) untuk setiap media
• Inokulasi cawan berisi Sabouraud‐dextrose agar dengan sejumlah mikroorganisme (tidak lebih
dari 100 CFU) untuk setiap media
• Untuk media padat, pertumbuhan yang
diperoleh tidak boleh berbeda lebih dari 2x nilai perhitungan yang diperoleh dari
inokulum standar.
• Untuk inokulum segar, pertumbuhan
mikroorganisme harus sebanding dengan yang diperoleh pada uji sebelumnya.
• Untuk media cair, pertumbuhan
mikroorganisme harus dibandingkan dengan hasil uji sebelumnya.
Suitability of the counting method in
the presence of product
• Persiapan sampel
• Cara penyiapan sampel tergantung pada sifat fisik sampel yang akan diuji. Jika tidak ada cara yang disarankan dapat digunakan
untuksampel yang akan diuji,maka metode alternatif harus dikembangkan.
Inokulasi dan pengenceran
• Inokulasikan ke dalam sampel sejumlah
mikroorganisme (tidak lebih dari 100 CFU). Volume suspensi inokulum tidak boleh lebih dari 1 % dari volume produk yang diencerkan .
• Jika sampel itu sendiri telah memberikan efek inhibisi terhadap mikroorganisme, suspensi mikroba dapat ditambahkan setelah proses netralisasi, peengenceran atau filtrasi.
Neutralization/menghilangkan
aktivitas antimikroba
• Jumlah mikroorganisme yang muncul dari treatmen sampel yang telah diencerkan, dibandingkan dengan kontrol
• Jika pertumbuhan mikroorganisme terhambat (jumlah berkurang 2x nya) , modifikasi
prosedur untuk validasi hasilnya. Misalnya : (1) Meningkatkan volume pengencer atau
medium biakan
(2) Gabungkan bahan penetraldengan bahan pengencer (
(3) Filtrasi membran atau
• Neutralizing agents dapat digunakan untuk me netralisasi aktivitas antimikroba senyawa
sampel
• Zat tersebut dapat ditambahkan ke dalam pengencer atau medium sebaiknya sebelum proses sterilisasi
• Jika tidak ada metode netralisasi yg sesuai, maka dapat dipastikan adanya aktivitas
mikrobisida dari produk.
• Informasi ini menunjukkan bahwa produk tersebut tidak mungkin terkontaminasi oleh mikroba uji,
• Namun mungkin saja produk dapat
terkontaminasi dengan mikroba lain selain mikroba uji. Untukhal ini maka lakukan
Rekoveri mikroorganisme
di dalam produk
1 Membrane filtration 2 Plate‐count methods : ‐ Pour‐plate method, ‐ Surface‐spread method 3 Most‐probable‐number (MPN) methodHasil dan interpretasi hasil
• Saat melakukan verifikasi suitability
membrane filtration method atau Plate‐count method, rata2 perhitungan ada uji
mikroorganisme tidak berbeda lebih dari 2x nilai kontrol
• Saat verifikasi suitability MPN method, nilai yang dihitung dari inokulum, harus berada di dalam rentang 95 per cent confidence limits dari hasil kontrol .
• If the above criteria cannot be met for one or more of the organisms tested with any of the described methods, the method and test
conditions that come closest to the criteria are used to test the product.
Uji terhadap Products
• Jika tidk dinyatakan lain, gunakan 10 g or 10 mL produk yg akan diuji
• Untk cairan atau padatan dlam aerosol gunakan 10 containers.
• Untuk transdermal patches, sample 10 patches.
• Jumlah sampel yg diuji dapat dikurangi pada kondisi sbb :
• jumlah per dosage unit (mis. tablet, kapsul, injeksi ) kurang atau sama dengan 1 mg atau
jumlah per gram atau milliliter (for preparations not presented in dose units) kurang dari 1 mg. • Dalam kasus ini, jumlah sampel tidak kurang dari
jumlah 10 dosis(dosage units) atau 10 g atau 10 mL dr produk.
• Untuk bahan aktif yang digunakan dalam
produk yang sangat kecil (i.e. lebih kecil dari 1000 mL atau 1000 g), maka jumlah yg diuji harus 1 % dari batch kecuali jumlah nya
• Untuk jumlah produk total kurang dari 200
(mis. Utk sampel clinical trials), ukuran sampel dapat dikurangi jadi 2 unit saja
• Untuk sampel yg kurang dari 100, maka sampel dapat digunakan 1 saja.
• Select the sample(s) at random from the bulk material or from the available containers of the preparation. To obtain the required
quantity, mix the contents of a sufficient
Examination of the product
• Membran filter method • Pour Plate method
• Spread‐surface method
Interpretasi hasil
• The total aerobic microbial count (TAMC) is considered to be equal to the number of CFU found using casein soya bean digest agar; if colonies of fungi are detected on this
medium,they are counted as part of TAMC. The total combined yeasts/mould count (TYMC) is considered to be equal to the number of CFU
found using Sabouraud‐dextrose agar; if colonies of bacteria are detected on this medium, they are counted as part of TYMC. When the TYMC is
expected to exceed the acceptance criterion due to the bacterial growth, so>>>
Sabouraud‐dextrose agar containing antibiotics may be used. If the count is carried out by the MPN method the calculated value is the TAMC. • When an acceptance criterion for microbiological quality is prescribed it is interpreted as follows: ‐10 CFU: maximum acceptable count=20, ‐101 CFU: maximum acceptable count=200, ‐102 CFU: maximum acceptable count=2000, and so forth. • The recommended solutions and media are described in Tests for specified 3 micro‐ organisms.
