3 KLONING DAN EKSPRESI GEN PENYANDI ENDONUKLEASE G Toxoplasma gondii
(TgEndoG), KANDIDAT PROTEIN YANG BERPERAN DALAM MEKANISME
APOPTOSIS-LIKE CELL DEATH PARASIT
Ayu Dewi Ni Nyoman1 dan Carsten G.K. Lüder 2
1
Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Udayana
2
Institute for Medical Microbiology, Georg-August University Göttingen
ABSTRAK
Endonuklease G adalah protein yang ditranslokasi dari mitokondria menuju nukleus selama proses apoptosis, tidak tergantung pada caspase. Kematian sel (dalam hal ini apoptosis) telah diketahui berperan dalam berbagai fungsi pada organisme multiseluler. Namun dalam beberapa tahun terakhir, mekanisme ini juga ditemukan pada organisme uniseluler termasuk protozoa. Karena protozoa (termasuk Toxoplasma gondii) tidak memiliki genuine caspase, protein yang berperan penting dalam mekanisme apoptosis pada organisme multiseluler, maka diduga mekanismenya melalui jalur yang independen dari caspase. Oleh karena itu, EndoG merupakan kandidat protein yang berperan dalam mekanisme apoptosis-like cell death pada organisme uniseluler.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning dan mengekspresikan gen penyandi EndoG T. gondii (TgEndoG). Konstruk plasmid yang mengandung gen penyandi TgEndoG (pASK-IBA3 plus-TgEndoG) diekspresikan pada E. coli BL21 dan protein rekombinan yang dihasilkan dideteksi dengan metode immunoblotting.
Gen penyandi TgEndoG berhasil dikloning namun masih perlu dilakukan optimasi dalam metode ekspresi gen tersebut agar diperoleh protein dalam kadar yang cukup untuk dipurifikasi. Protein yang telah dipurifikasi nantinya dapat dipergunakan untuk eksperimen lebih lanjut dalam rangka mengetahui peranan EndoG dalam mekanisme apoptosis-like cell death pada T. gondii.
4 CLONING AND EXPRESSION OF GENE ENCODING Toxoplasma gondii
ENDONUCLEASE G (TgEndoG), A PROTEIN CANDIDATE THAT MAY PLAY A ROLE IN APOPTOSIS-LIKE CELL DEATH MECHANISM IN THE PARASITE
ABSTRACT
Endonuclease G is a protein that is translocated from mitochondria into nucleus during apoptosis, independently of caspases. Cell death (e.g. apoptosis) has been well-described in multicellular organisms. However, during recent years the mechanism has been also identified in unicellular organisms, including protozoan parasites. Because protozoans (including Toxoplasma gondii) do not possess genuine caspases, proteins that play critical roles in apoptosis pathway in multicellular organisms, it is likely that apoptosis-like mechanism in unicellular organisms occurs in caspases-independent fashion. Therefore, EndoG is a protein candidate that may play a role in apoptosis-like cell death mechanism in unicellular organisms.
This study aimed to clone and express the gene encoding T. gondii EndoG (TgEndoG). Plasmid construct containing full length sequence of TgEndoG (pASK-IBA3 plus-TgEndoG) was heterologously expressed in E. coli BL21. Recombinant protein was detected using immunoblotting method.
We successfully cloned the TgEndoG-coding gene; however, the gene expression method needs to be optimized to obtain an adequate amount for purification of the protein. Purified protein will be useful for downstream experiments to elucidate the role of EndoG in the apoptosis-like cell death mechanism in T. gondii.
5 PENDAHULUAN
Toxoplasma gondii adalah salah satu parasit yang dapat menginfeksi hewan dan manusia, dan menyebabkan masalah kesehatan di seluruh dunia (Innes, 2010). Dalam tahun-tahun terakhir kematian sel yang terprogram (apoptosis), suatu mekanisme organisme multiseluler yang penting dalam proses pertumbuhan maupun homeostasis, telah digambarkan pada organisme uniseluler termasuk parasit seperti Leishmania spp, Pla smodium spp, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, dan Gia rdia lamblia (Bruchhaus et al., 2007; Jiménez-Ruiz et al., 2010; Reece et al., 2011); mekanismenya disebut apoptosis-like cell death. Namun hanya sedikit informasi yang tersedia berkaitan dengan apoptosis-like pada parasit T. gondii.
Endonuklease G (EndoG) diketahui berperan dalam mekanisme apoptosis. Protein ini merupakan suatu endonuklease yang terdapat di mitokondria yang mengalami translokasi ke nukleus dan menyebabkan degradasi DNA kromatin. EndoG diketahui berperan dalam jalur apoptosis yang tidak tergantung caspase (Broker et al., 2005; Elmore, 2007; van Loo et al., 2001). Mengingat protozoa termasuk T. gondii tidak memiliki genuine caspases (Nedelcu, 2009), EndoG nampaknya merupakan protein penting yang terlibat dalam mekanisme apoptosis pada parasit ini. Oleh karena itu, penelitian untuk mengetahui struktur dan fungsi protein ini dalam metabolisme T. gondii, terutama dalam regulasi apoptosis pada parasit ini penting untuk dilakukan. Melalui penelitian ini, kami melakukan kloning dan ekspresi gen penyandi EndoG dari T. gondii (TgEndoG).
MATERI DAN METODE
Digesti plasmid
6 0.5 µg plasmid DNA, 10 U dari masing-masing enzim, buffer 1, dan 100 µg/ml BSA. Campuran ini diinkubasi pada suhu 37oC semalam.
Gel elektroforesis, ekstraksi DNA, dan defosforilasi vektor
Sebanyak 5-10 µ l plasmid yang telah didigesti dicampurkan dengan 6 x DNA loading dye (Fermentas) dan dirunning menggunakan 0.8-1 % gel dalam 1 x TAE (40 mM Tris base,1 % asam asetat glasial dan 1 mM EDTA) yang mengandung 1 µg/ml etidium bromide. Marker DNA (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Fermentas) dirunning secara paralel. Pita DNA divisualisasikan didokumentasikan menggunakan BioDoc II digital imaging system (Biometra). DNA diekstraksi dari gel mengikuti protokol dari QIAquick PCR Purification kit (Roche). Untuk menghindari resirkulasi plasmid, pASK-IBA3 plus yang dipurifikasi dari gel selanjutnya diinkubasi dengan 1 x buffer dan 10 U Antarctic phosphatase (New England Biolabs) selama 1 jam pada suhu 37oC. Enzim kemudian diinaktivasi selama 5 menit pada suhu 60oC.
Ligasi dan transformasi
Vektor yang telah difosforilasi dan insert (gen penyandi TgEndoG) dicampur dengan berbagai rasio (vektor:insert 1:1, 1:3, 1:5), dan diinkubasi dengan 1 µ l T4 DNA ligase (400 U; New England Biolabs), 2 x buffer dan ddH2O sampai volume 20 µ l. Campuran ini diinkubasi pada
thermocycler (Biometra) dengan menggunakan penurunan suhu sebagai berikut: 22oC selama 2 jam, 18oC selama 1 jam, 14oC selama 1 jam, 10oC selama 1 jam, 6oC selama 1 jam, dan pada 4oC semalam. Selanjutnya dilakukan transformasi ke E. coli BL21 menggunakan metode heat shock 42oC selama 90 detik. Setelah menambahkan 500 µ l of LB medium (5 g yea st extra ct, 10 g NaCl, 10 g tryptone dalam 1 L), sel diinkubasi pada 37oC selama 1 jam dan shaking 300 rpm. Sebanyak 50 µ l, 100 µ l, 150 µ l, dan 200 µ l sel disebar di atas LB plate (5 g yeast extract, 10 g NaCl, 10 g tryptone dan 15 g agar dalam 1 L serta mengandung ampisilin) dan diinkubasi pada 37oC semalam.
Skrining hasil transformasi dan ekpresi protein rekombinan
7 dan disentrifus pada 12.000 rpm selama 5 menit. Untuk reaksi PCR digunakan 1 x buffer, 1.5 mM MgSO4, 0.2 mM dNTP, 0.3 µM primer spesifik untuk TgEndoG, 5 % (v/v) DMSO, 1 µ l
plasmid, 0.02 U KOD DNA polimerase dan ddH2O sehingga volume final menjadi 25 µ l.
Koloni yang positif mengandung plasmid rekombinan selanjutnya diinokulasi ke dalam 2-5 ml LB medium mengandung ampisilin dan ditumbuhkan semalam pada 37ºC (shaking). Kultur semalam ini digunakan untuk menginokulasi 25-100 ml LB medium mengandung ampisilin dan ditumbuhkan pada suhu kamar dan sha king yang konstan sampai OD600= 0.4-0.6. Ekspresi
protein diinduksi dengan menambahkan 25 ng anhydrotetracycline; induksi dilakukan selama 2 jam. Sel kemudian disentrifus 4,500 x g selama 12 min pada suhu 4oC. Pelet bakteri disimpan pada suhu -20oC.
Untuk penyimpanan bakteri yang mengandung plasmid rekombinan, sebanyak 500 µ l kultur semalam (dalam LB medium mengandung ampisilin) dicampur secara perlahan dengan 500 µ l 87 % gliserol steril. Setelah sekitar 5 menit pada suhu ruang, sel disimpan pada -80oC.
Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Pemisahan protein dilakukan menggunakan metode SDS-PAGE dengan sistem Mini Protean 3 (Biorad); gel yang digunakan adalah 7.5% separating gel [0.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 % (w/v) SDS, 7.5 % acrylamide/bisacrylamide (30 %/ 0.8 % w/v), 0.1 % (w/v) APS dan 0.04 % TEMED] dan 4.4% stacking gels [0.125 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.2 % (w/v) SDS, 4.4 % acrylamide/ bisacrylamide (30 %/ 0.8 % w/v), 0.04 % (w/v) APS, 0.4 % TEMED, 0.004 % (w/v) bromophenol blue]. Setelah gel polimer, sampel dicampurkan dengan 2 x sample buffer 125 mM Tris-Hcl pH 6.8, 4 % (w/v) SDS, 20 % (v/v) gliserol, 65 mM DTT dan 0.002 % bromophenol blue) dan dipanaskan selama 5 menit pada suhu 99oC. Prestained protein marker dirunning secara paralel. Elektroforesis dijalankan dengan 1 x SDS running buffer (0.25 M Tris-HCl, 1.92 M glisin, 1 % (w/v) SDS), arus 25 mA per gel.
Immunoblotting
8 membran nitroselulosa, gel poliakrilamid, dan 9 Whatman filter paper direndam dengan 40 mM 6-aminocapronic acid (pH 7.6) dan 20 % metanol. Transfer dilakukan pada suhu ruang dan arus 0.8 mA/cm2 selama 1,5 jam.
Inkubasi dengan antibodi dan deteksi protein
Protein yang telah ditransfer ke membran nitroselulosa divisualisasi secara reversibel menggunakan 0.1 % (w/v) Ponceau S dalam 5 % (v/v) asam asetat (Sigma-Aldrich). Setelah itu, membran dicuci dengan H2O. Untuk deteksi Strep-tag fusion protein, membran dicuci 2 x 10
menit dengan TBS buffer pH 7.5 (10 mM Tris-Cl dan 150 mM NaCl) dan diblok menggunakan blocking solution (3 % BSA (w/v) in TBS) selama 1 jam pada suhu ruang. Setelah dicuci 2 x 10 menit dengan TBS-Tween/Triton pH 7.5 (20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, 0.05 % (v/v) Tween dan 0.02 % (v/v) Triton) dan 10 menit dengan TBS buffer, membran diinkubasi dengan mouse anti-Strep-tag antibody (pengenceran 1:2,000 dalam blocking solution) selama 1 jam pada suhu ruang (atau semalam pada suhu 4oC) dan dicuci lagi seperti sebelumnya; selanjutnya membran diinkubasi dengan anti-mouse IgG HRP-conjugated secondary antibody (pengenceran 1:2,000 dalam 10 % (w/v) dry skimmed milk dalam TBS) selama 1 jam dan membran kemudian dicuci 4 x 10 menit menggunakan TBS-Tween/Triton. Reagen ECL (GE Healthcare) dicampurkan 1:2 dan diinkubasi dengan membran selama 1 menit. Membran dilapisi plastik. Visualisasi protein dilakukan dengan alat enhanced chemiluminescence (Luminescent Image Analyzer LAS-4000, Fujifilm).
HASIL DAN DISKUSI
Analisis bioinformatika
9 Secara struktural, TgEndoG menyerupai struktur EndoG pada spesies lain. Sisi aktif dari EndoG pada mamalia ditandai dengan adanya motif DRGH, tetapi pada TgEndoG ditandai oleh motif SKGH (Gambar 1). Motif DRGH pada sisi aktif EndoG manusia atau SRGH pada Leishmania and Trypanosome digantikan oleh motif SKGH pada TgEndoG. Namun, hal yang penting adalah residu histidin dan asparagin yang memiliki peranan penting dalam aktivitas katalitik dan pengikatan ion divalent dipertahankan pada EndoG Leishmania dan Trypanosoma (Gannavaram et al., 2008) serta pada struktur TgEndoG.
Gambar 1. Alignment sekuen EndoG dari berbagai spesies. EndoG terdiri dari dua domain endonuclease non
spesifik. Motif DRGH (ditunjukkan dalam kotak merah) yang merupakan karakteristik EndoG mamalia dan yeast
digantikan oleh motif SKGH pada TgEndoG.
Kloning dan Ekspresi T. gondii Endonuclease G
[image:9.612.109.516.245.375.2]10 memiliki fusi dengan Strep-tag pada ujung karboksil dari protein rekombinan. Propagasi plasmid dilakukan menggunakan E. coli DH5α (data tidak ditampilkan). Skrining klon yang positif ditentukan dengan menggunakan metode colony PCR. Untuk tujuan ekspresi, plasmid rekombinan ditransformasikan ke E. coli BL21 codon plus. Strain ini dirancang untuk mengatasi bias penggunaan kodon karena E. coli BL21 codon plus mengandung extra copies dari gen pengkode tRNA yang jarang, yang seringkali menyebabkan hambatan translasi protein heterologous pada E. coli (Rosano and Ceccarelli, 2009). Kami telah melakukan optimasi metode ekspresi dengan memodifikasi konsentrasi anhydrotetracycline dari 25, 50, 100, dan 200 ng/ml dan mencoba beberapa suhu untuk menumbuhkan bakteri (30oC, 37oC dan suhu ruang) selama proses induksi ekspresi protein. Namun, sejauh ini kami menemukan ekspresi pada level yang menengah menggunakan immunoblotting. Kondisi terbaik untuk menginduksi ekspresi plasmid rekombinan pASK-IBA3plus-TgEndoG pada E. coli BL21 codon plus adalah menggunakan 25 ng/ml anhydrotetracycline pada suhu ruang selama 2 jam (Gambar 2B).
11 Gambar 2. Konstruk plasmid rekombinan dan deteksi ekspresi heterologous dari protein rekombinan menggunakan
immunoblotting. A, Konstruk plasmid rekombinan pASK-IBA3plus mengandung sekuen pengkode TgEndoG. B,
Protein rekombinan diekspresikan pada E. coli BL21 codon plus menggunakan 25 ng/ml anhydrotetracycline pada
suhu ruang. TgEndoG dideteksi menggunakan anti-Strep-tag antibody dengan immunoblotting dan divisualisasikan
menggunakan alat chemiluminescence imaging (Luminescent Image Analyzer LAS-4000, Fujifilm). Gambar
menunjukkan beberapa immunoblot dari kontrol negatif (hanya vektor) dan 3 klon positif mengandung plasmid
rekombinan. 0, 0 jam (sebelum diinduksi); 1, 2, 3, menunjukkan jam setelah induksi.
Pada sel mamalia, EndoG ditranslokasikan dari mitokondria ke nukleus mengikuti rangsangan apoptosis dan menyebabkan fragmentasi DNA secara independen terhadap caspase (Arnoult et al., 2003; Schafer et al., 2004). EndoG putative dari Leishmania dan Trypanosoma menunjukkan aktivitas pro-apoptotic nuclease; setelah kematian sel diinduksi, EndoG dilepaskan dari mitokondria menuju nukleus sehingga menyebabkan kematian sel (Gannavaram et al., 2008; Rico et al., 2009).
KESIMPULAN
pro-12 apoptotic nuclease pada protozoa dan prediksi struktur TgEndoG menunjukkan dipertahankannya domain aktif dari EndoG (residu histidin dan asparagin) seperti ditemukan pada metazoa.
DAFTAR PUSTAKA
Arnoult, D., Gaume, B., Karbowski, M., Sharpe, J.C., Cecconi, F., Youle, R.J., 2003. Mitochondrial release of AIF and EndoG requires caspase activation downstream of Bax/Bak-mediated permeabilization. The EMBO journal22, 4385-4399.
Broker, L.E., Kruyt, F.A., Giaccone, G., 2005. Cell death independent of caspases: a review. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research11, 3155-3162.
Bruchhaus, I., Roeder, T., Rennenberg, A., Heussler, V.T., 2007. Protozoan parasites: programmed cell death as a mechanism of parasitism. Trends in parasitology 23, 376-383.
Elmore, S., 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic pathology35, 495-516.
Gannavaram, S., Vedvyas, C., Debrabant, A., 2008. Conservation of the pro-apoptotic nuclease activity of endonuclease G in unicellular trypanosomatid parasites. Journal of cell science 121, 99-109.
Innes, E.A., 2010. A brief history and overview of Toxoplasma gondii. Zoonoses and public health57, 1-7.
Jiménez-Ruiz, A., Alzate, J.F., MacLeod, E.T., Lüder, C.G.K., Fasel, N., Hurd, H., 2010. Apoptotic markers in protozoan parasites. Parasites & Vectors 3.
Low, R.L., 2003. Mitochondrial Endonuclease G function in apoptosis and mtDNA metabolism: a historical perspective. Mitochondrion2, 225-236.
Nedelcu, A.M., 2009. Comparative genomics of phylogenetically diverse unicellular eukaryotes provide new insights into the genetic basis for the evolution of the programmed cell death machinery. Journal of molecular evolution68, 256-268.
Reece, S.E., Pollitt, L.C., Colegrave, N., Gardner, A., 2011. The meaning of death: evolution and ecology of apoptosis in protozoan parasites. PLoS pathogens 7, e1002320.
Rico, E., Alzate, J.F., Arias, A.A., Moreno, D., Clos, J., Gago, F., Moreno, I., Dominguez, M., Jimenez-Ruiz, A., 2009. Leishmania infantum expresses a mitochondrial nuclease homologous to EndoG that migrates to the nucleus in response to an apoptotic stimulus. Molecular and biochemical parasitology163, 28-38.
Rosano, G.L., Ceccarelli, E.A., 2009. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial cell factories8, 41. Schafer, P., Scholz, S.R., Gimadutdinow, O., Cymerman, I.A., Bujnicki, J.M., Ruiz-Carrillo, A.,
Pingoud, A., Meiss, G., 2004. Structural and functional characterization of mitochondrial EndoG, a sugar non-specific nuclease which plays an important role during apoptosis. Journal of molecular biology338, 217-228.
