• Tidak ada hasil yang ditemukan

Abstrak. Abstract. Key words: Endothelial cells, VCAM-1, ICAM-1, LDL, curcuminoids

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Membagikan "Abstrak. Abstract. Key words: Endothelial cells, VCAM-1, ICAM-1, LDL, curcuminoids"

Copied!
25
0
0

Teks penuh

(1)

90 RESPON EKSPRESI MOLEKUL ADHESI PADA PERMUKAAN SEL

ENDOTEL OLEH KURKUMINOID EKSTRAK TEMU MANGGA (Response of Adhesion Molecule Expression on Surface of Endothelial Cells by

Curcuminoid of Temu Mango Extract)

Abstrak

Molekul adhesi seperti Vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1) dan Interceluler adhesion molecule-1(ICAM-1), adalah protein yang diekspresikan ke permukaan sel endotel apabila fungsi endotel terganggu. Molekul adhesi merupakan tanda-tanda awal terjadinya atesosklerosis yang dapat disebabkan oleh meningkatnya konsentrasi kolesterol yang beredar di pembuluh darah. Penelitian bertujuan mengkaji potensi kurkuminoid ekstrak dalam menghambat ekspresi molekul adhesi coronary pulmonary arterial endothelial (CPAE) in vitro. Dalam percobaan, sel endotel dipra-inkubasi dengan kurkuminoid ekstrak selama 48 jam. Kultur sel endotel diinkubasikan kembali dengan LDL dan dioksidasi dengan CuSO4 selama 24 jam. Molekul VCAM-1 dan ICAM-1 diamati secara imunohistokimia yang direaksikan dengan antibodi anti VCAM-1 atau antibodi anti ICAM-1 lalu divisualisasikan dengan3,3-diaminobenzidin tetrahydro chloride (DAB). Hasil penelitian menunjukkan VCAM-1 tidak terekpresikan. Sedangkan ICAM-1 terekspresi ke permukaan, berwarna kuning kecoklatan setelah divisualisasikan dengan DAB. Kurkuminoid ektrak 8 ppm mampu menurunkan respon ekspresi molekul ICAM-1. Partikel LDL teroksidasi dapat menginduksi ekspresi ICAM-1 disamping terbentuk juga sel-sel busa.

Abstract

The adhesion molecule such as vascular cell adhesion molecules-1 (VCAM-1) and Interceluler adhesion molecule-1 (ICAM-(VCAM-1), is a protein that is expressed to the cell surface when disturbed endothelial function. The adhesion molecules is early signs of atherosclerosis which can be caused by the increase of cholesterol circulating in blood vessels. The study aims to assess the potential of the curcuminoids extract in inhibiting the expression of adhesion molecules on cells pulmonary arterial endothelial (CPAE) in vitro. In the reseach, endothelial cells pre-incubated with curcuminoids of temu mangga extracts for 48 hours, then washed with PBS. The cell culture pre-incubated with LDL that has been oxidized with CuSO4 for 24 hours. The VCAM-1 and ICAM-1 were observed stained by immunohistochemistry and reacted with anti VCAM-1 antibody or anti ICAM-1 antibody so visualized with 3.3 diamino benzidine tetrahydro-chloride (DAB).

The results showed that VCAM-1 did not expression to endothelial surface cells but ICAM-1 expression vizualized by DAB is brown yellow. The curcuminoids of temu mangga extract eight ppm reduces induction of ICAM-1 response. Induction of ICAM-1 expression by oxidized LDL caused ICAM-1 expressed addition foam cells accumulation.

(2)

91

PENDAHULUAN

Interaksi antara sel-sel dan matrik ekstraseluler sel memegang peranan penting dalam bermigrasinya sel dan teraktivasinya sel darah putih selama peradangan. Ekspresi molekul adhesi pada sel endotel dan jaringan ekstra vaskular merupakan tanda awal terjadinya patogenesis aterosklerosis. Dalam proses radang, sel akan mengeluarkan sitokina kepermukaan vaskular sehingga akan menstimuli pembentukan molekul adhesi, protease dan mediator lainnya yang terlarut dan dapat masuk ke sirkulasi darah (Packard & Libby, 2008; Hansson 2009). Peradangan pada arteria merupakan suatu respon nonspesifik yang dapat disebabkan oleh virus, toksin, kompleks imun, produk-produk yang dilepaskan oleh sel darah putih maupun platelet yang teraktivasi serta stress fisik yang tidak lazim. Selain itu, dapat juga disebabkan oleh peningkatan konsentrasi lipoprotein dalam darah. Keadaan iniakan meningkatan permeabilitas endotel yang memicu terjadinya peradangan.

Menurut Hansson (2009), peradangan berperan penting di dalam penyakit patogenesis aterosklerosis. Sel imun mendominasi lesi awal aterosklerosis, dimana pengaruh molekul ini mempercepat perkembangan lesi. Libby (2002); Packard & Libby, (2008) menyatakan, bahwa proses peradangan pada arteri dapat dipicu oleh meningkatnya produksi sitokina. Sitokina primer akan menginduksi dan meghasilkan messenger sitokina IL-6 untuk merangsang hati memproduksi C reaktive protein (CRP) pada fase akut. Platelet dan jaringan adiposa dapat menghasilkan mediator peradangan yang sama dengan aterotrombosis sehingga terjadi aterosklerosis.

Darah pada radang, sisa pembuluh darah, sel otot polos, dan konstituen sel imun merupakan bagian penting dari ateroma. Ateroma di awali dengan pembentukan garit lemak dan merupakan kumpulan lipid dibawa oleh endotel. Pada umumnya garit lemak berisi makrofag bersama-sama sel T (Hansson, 2005). Pusat ateroma berisi sel busa, droplet lipid ekstraseluler membentuk bagian dari inti dikelilingi oleh sel-sel otot polos yang kaya matrik kolagen. Sel-sel T, makrofag dan mast sel berinfiltrasi ke lesi untuk berkembangnya ateroma, sel-sel imun yang teraktivasi akan memproduksi sitokina radang (Hansson, 2005;

(3)

92 Hansson 2009). Sel busa merupakan metabolit aktif yang dapat mensekresikan berbagai sitokina dan mediator radang, yang pada akhirnya akan merekrut sel otot polos untuk berproliferasi (Crowther 2005).

Makrofag yang bergabung dengan limfosit sel T pada intima pembuluh darah, dapat beradaptasi langsung dan mensekresikan kemokina; sitokina proinflamasi seperti IL-1, IL-6 dan TNF-α; oksigen reaktif dan spesies nitrogen: penyebab LDL teroksidasi dan kerusakan sel; ekspresi faktor jaringan (trombogenositas); menangkap LDL teroksidasi (pembentuk sel busa); dan mensekresikan protease untuk degradasi sel otot (Robetson & Hansson 2006). Molekul TNF-α secara biologis mengaktivitasi gen dari sel-sel endotel dalam mengatur berinteraksinya sel endotel dengan leukosit, seperti VCAM-1, ICAM-1, P-selektin, faktor jaringan, sitokina radang dan kemokina (Inoue et al. 2006).

Secara normal, sel endotel resisten terhadap adhesi leukosit. Rangsangan awal pada peradangan, seperti diet tinggi asam lemak jenuh, hiperkolsterolemia, obesitas, resisten insulin, hipertensi dan merokok akan menstimuli molekul adhesi seperti P-selektin, VCAM-1 dan ICAM-1 sehingga monosit dan limfosit yang ada pada peredaran darah dapat menempel pada permukaan endotel (Packard & Libby, 2008). Molekul VCAM-1dan ICAM-1 merupakan suatu bentuk protein yang muncul pada permukaan endotel apabila terjadi rangsangan. Monosit yang melekat pada permukaan sel endotel, berpenetrasi ke intima menjadi makrofag lalu mengekspresikan macrophage colony stimulating factor (M-CSP). Molekul M-CSP berfungsi merangsang terjadinya radang. mengekspresikan reseptor skavenger yang dapat mengenali LDL termodifikasi sehingga membentuk sel busa. Dalam waktu bersamaan, proliferasi makrofag memperkuat respon radang dengan mensekresikan sejumlah faktor pertumbuhan dan sitokina, termasuk faktor tumor nekrosis-ά (TNF-α) dan IL-1β (Hansson 2009; Linton & Fazio, 2003).

Sel imun sel T yang dapat menyesuaikan diri pada lesi aterosklerosis, berperan penting dalam pengaturan aterogenesis, termasuk lesi dalam merespon monokin yang diinduksi oleh interferon-γ (IFN-γ) dan IFN. Sub tipe CD4+, akan mengenali antigen yang dibawa oleh Major histocompatibility complex clas II (MHC-II) yang merupakan prediposisi terjadinya lesi. Lesi yang berisi CD4+ sel T sebagai antigen reaktif dalam mengikat LDL teroksidasi yang telah di klon dari

(4)

93 lesi manusia. Pengaktifan CD8+ sel T pada mencit yang apoE dikeluarkan dapat menyebabkan kematian dinding arteri dan mempercepat aterosklerosis. Ada dua tipe sel Th yaitu Th-1 dan Th-2, tipe Th-1 mengaktifkan respon makrofag dan menginisiasi hipersensitivitas terhadap patogen intraseluler. Sedangkan tipe Th-2 berespon pada alergi. Aterosklerosis yang berisis sitokina akan meningkatkan respon T helper-1 (Th1) sehingga sel T teraktivasi untuk berdeferensiasi menjadi sel-sel Th1 efektor. Sel efektor akan memproduksi macrophage activating colony interferon-γ. Interferon γ meningkatkan efisiensi penyajian antigen dan sintesis sitokin peradangan TNF dan IL-1 (Hansson, 2009; Linton & Fazio 2003; Packard & Libby, 2008).

Menurut Keaney (2004), kejadian oksidatif terlibat dalam pengaturan molekul adhesi seluler sel endotel. Sitokina akan menginduksi ekspresi molekul VCAM-1 sel endotel. Sedangkan senyawa O‾2 intraseluler memproduksi efek dalam mengaturan induksi sitokina. Pada kondisi yang sama, O‾2 merupakan signal dalam pengaturan ICAM-1 sel endotel akibat dari osilator shear stress. Sitokina yang menginduksi VCAM-1 dapat juga meningkatkan oksidasi LDL atau oksidasi asam lemak. Sel arteri endotel manusia yang diinduksi dengan LDL teroksidasi dapat mengekpresikan VCAM-1, ICAM-1dan E-selektin. Kondisi ini semua menandakan adanya gangguan oksidatf yang mengekspresikan molekul adhesi sel endotel.

Penelitian ini dimaksudkan untuk mengkaji dan mendapatkan informasi tentang potensi kurkuminoid ekstrak temu mangga, dalam menghambat ekspresi molekul adhesi dari sel endotel yang diinkubasi dengan LDL teroksidasi secara in vitro. Diharapkan, data yang diperoleh dapat dibuat suatu rekomendasi tentang manfaat kurkuminoid temu mangga yang dapat mengobatan penyebab awal aterosklerosis.

(5)

94

Bahan dan Alat

Bahan penelitian yang digunakan antara lain line cell coronary pulmonary arterial endothelial (CPAE) yang diperoleh dari laboratorium mikrobiologi dan virologi PSSP LPPM-IPB. DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), monoclonal mouse anti human ICAM-1(CD 54) cat. No: C 2969; antibodi primer mouse anti VCAM-1 cat. No: V9263, PBS, 3,3-diaminobenzidine tetrahydro chloride (DAB, sigma, cat. No. D-5905), Avidin-Biotin- conjungated (Elite Vecta StainR, Vector Lab. Cat. No: PK 6100), PBS, penisilin dan streptomisin.

Alat yang digunakan antara lain laminar flow hood, inkubator CO2, mikroskop, kultur flask, pipet mikro, spektrofotometer, sentrifugasi, kultur slide chamber, dan alat gelas lainnya.

Metode Penelitian

Respon Ekspresi Molekul Adhesi pada Permukaan Sel Endotel terhadap Efek Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga.

Kultur sel lestari CPAE pra-inkubasi dengan penambahan ekstrak kurkuminoid temu mangga (2 ppm/ml dan 8 ppm/ml) pada suhu 370C selama 48 jam dalam DMEM yang mengandung 20% FBS (v/v), sehingga diperkirakan 50% sel konfluen. Sebagai kontrol, dibuat tanpa menambahkan kurkuminoid ekstrak temu mangga. Kemudian sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam sehingga sel konfluen. Setelah 24 jam, molekul adhesi ditentukan dengan reaksi antibodi anti VCAM-1 danantibodi anti ICAM-1(imunohistokimia).

Respon Ekspresi Molekul Adhesi pada Permukaan Sel Endotel yang Diinduksi dengan Ion Cu2+.

Kultur sel lestari CPAE pra-inkubasi pada suhu 370C selama 48 jam dalam DMEM yang mengandung 20% FBS (v/v), dengan penambahan ekstrak kurkuminoid temu mangga (2 ppm/ml dan 8 ppm/ml) sehingga diperkirakan 50% sel konfluen. Sebagai kontrol dibuat tanpa kurkumioid ekstrak temu mangga. Kemudian sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali, lalu diberi ion Cu2+ 5 μM

(6)

95 dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam sehingga sel konfluen. Setelah 24 jam molekul adhesi ditentukan dengan reaksi antigen antibodi (imunohistokimia).

Respon Ekspresi Molekul Adhesi Permukaan Sel Endotel yang Diinkubasi dengan LDL

Kultur sel endotel diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam dalam DMEM yang mengandung 20% FBS (v/v), dengan atau tanpa penambahan ekstrak kurkuminoid temu mangga (2 ppm/ml dan 8 ppm /ml) dan diperkirakan 50% sel konfluen. Sebagai kontrol dibuat kultur sel tanpa kurkuminoid ekstrak temu mangga. Setelah itu sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali lalu masing masing ditambahkan LDL 200 μg dan diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 24 jam hingga sel konfluen. Molekul adhesi ditentukan dengan reaksi antigen antibodi (imunohistokimia).

Respon Ekspresi Molekul Adhesi pada Permukaan Sel endotel yang diinkubasi dengan LDL teroksidasi

Kultur sel endotel dipra-inkubasi pada suhu 370C selama 48 jam dalam DMEM yang mengandung 20% FBS (v/v), dengan penambahan ekstrak kurkuminoid temumangga (2 ppm/ml dan 8 ppm/ml) sehingga diperkirakan 50% sel konfluen. Sebagai kontrol sel dikultur tanpa ditambahkan kurkuminoid ekstrak temu mangga. Kemudian kultur sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali, diinkubasi dengan 200 ug LDL dan ion Cu2+ 5 μM pada suhu 370C selama 24 jam sehingga sel konfluen. Setelah 24 jam, molekul adhesi ditentukan dengan reaksi antigen antibodi (imunohistokimia).

Pewarnaan Imunohistokimia terhadap VCAM-1 dan ICAM-1 (Ramos 2005 & Danskey et al. 2002). Preparat monolayer dicuci dengan larutan DMEM dan difiksasi dengan larutan aseton selama 2-3 menit lalu dikeringkan. Preparat dicuci dengan 0,1 M buffer fosfat salin pH 7,4 (3x selama 10 menit), lalu diinkubasi dengan protainase-K (10 ug/ml) selama 30 menit pada suhu 370C, kemudian dibilas dengan 0,1M PBS sebanyak 3 kali, masing-masing 10 menit. Aktivitas endogenous peroksidase pada sel diblok dengan 0,3% hidroksi peroksida (H2O2) selama 15 menit, kemudian dibilas dengan akuades sebanyak 3 kali masing-masing 10 menit. Preparat kemudian diinkubasi dalam 2%

(7)

non-96 immune goat serum pada suhu kamar selama 60 menit dan dikeringkan (udara) tanpa dibilas. Preparat diinkubasi kembali selama 24 jam dalam refrigenerated, dengan antibodi primer monoclonal mouse anti human ICAM-1(CD 54) cat. No: C2969 yang diencerkan 100 kali dan antibodi primer mouse anti VCAM-1 cat. No: V9263 dengan pengenceran 1:25. Pada kontrol tidak ditambahkan antibodi primer, hanya diberi antibodi sekunder dan slide dibiarkan pada suhu kamar selama 10 menit lalu dibilas dengan 0,1M PBS masing-masing sebanyak 3 kali selama 15 menit. Preparat diinkubasi dengan antibodi sekunder biotinylated goat anti-mouse (1:200) (Vector Elite, Vector Labs) dalam PBS pada suhu kamar selama 30 menit. Selanjutnya preparat dibilas sebanyak 3 kali masing-masing 10 menit dengan 0,1 M PBS lalu diinkubasi dalam Avidin-Biotin- conjungated (Elite Vecta StainR, Vector Lab. Cat. No: PK 6100) (1:200) dalam PBS selama 60 menit. Preparat dibilas kembali dengan fosfat bufer sebanyak 3 kali masing-masing 15 menit.

Segera setelah selesai dibilas, preparat diinkubasi dengan larutan 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB, sigma, cat. No. D-5905) selama 5 menit dan dilanjutkan dengan 3% H2O2 yang dipersiapkan dalam DAB selama 20 menit. Slide dicuci beberapa kali sampai bersih dalam bufer fosfat, lalu dikeringkan dalam inkubator selama satu malam.

Peubah yang Diamati

Peubah yang diamati meliputi perbedaan intensitas warna terhadap ICAM-1 dan VCAM-1. Cara mengamati perbedaan warna sel pada preparat dalam satu bidang pandang.

Analisis Data

Sel endotel dapat menghasilkan protein molekul adhesi yang akan bereaksi membentuk ikatan dengan antibodi terhadap anti ICAM-1 dan anti VCAM-1. DAB digunakan untuk memvisualisasikan warna coklat kekuningan terhadap sel endotel yang imunoreaktif terhadap antibodi anti ICAM-1 dan antibodi anti VCAM-1. Hasil pewarnaan molekul adhesi dianalisis secara diskriptif.

(8)

97

Respon Ekspresi Molekul Adhesi VCAM-1 pada Permukaan terhadap Efek Kurkuminoid Ekstrak Temu mangga

Percobaan ini bertujuan menentukan respon ekspresi VCAM-1 pada permukaan sel endotel terhadap kurkuminoid ekstrak temu mangga dan divisualisasikan dengan DAB (Gambar 21). Kultur sel endotel dalam percobaan ini tanpa diberi perlakuan apapun seperti pada preparat 21a dan 21b, kecuali pada preparat 21c dan 21d diinkubasi dengan kurkuminoid 2 ppm dan 6 ppm. Hasil percobaan tidak memperlihatkan terekspresinya VCAM-1. Kondisi ini sesuai dengan harapan karena sampel tanpa perlakuan.

Gambar 21 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia VCAM-1 sel endotel (SE), perbesaran 160x. (a) SE + Ab 40 µg, (b) SE tanpa Ab, (c) SE + Ab1 40 µg + ET 2 ppm (d) SE + Ab1 40 µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).

Antibodi anti VCAM-1 akan bereaksi dengan antigen (VCAM-1) yang diekspresikan ke permukaan sel endotel, apabila terjadi reaksi antigen antibodi yang bersifat monoklonal. Dalam percobaan ini, antibodi yang digunakan bersifat monoklonal dan reaksi ikatan antigen-antibodi (Ag-Ab) dapat terlihat apabila diwarnai dengan pewarnaan imunohistokimia. Ikatan antigen-antibodi yang terbentuk dapat divisualisasikan dengan pewarnaan DAB. Intensitas warna yang terjadi dipengaruhi oleh kondisi ikatan antigen antibodi pada saat pewarnaan.

b

c d

(9)

98 Molekul VCAM-1 merupakan gejala awal yang dapat muncul ke permukaan sel apabila terjadi gangguan terhadap membran sel (Silverman et al. 2001). Dalam percobaan ini, sel endotel yang dikultur tidak diberi perlakuan kimia apapun, kecuali medium pertumbuhan yang telah sesuai untuk pertumbuhan sel. Pada preparat 21a, 21b dan 21d, sel masih terlihat jelas dan utuh tanpa ada kerusakan, sedangkan untuk preparat 21c tampak jelas telah terjadi kerusakan. Kerusakan ini kemungkinan terjadi secara teknis saat pencucian, pewarnaan, atau ketika sel dikultur dalam medium pertumbuhan. Atau disebabkan reaksi antigen - antibodi tidak terjadi setelah preparat diwarnai dengan pewarnaan imunohistokimia meskipun telah divisualisasikan dengan DAB.

Pada percobaan selanjutnya, sel endotel diinkubasi dengan kurkuminoid ekstrak temu magga dan diinduksi dengan 5 µM Cu2+, dengan harapan dapat memunculkan molekul VCAM-1(Gambar 22). Namun hasil percobaan tidak menunjukkan terekspresinya molekul VCAM-1. Dari masing-masing preparat pada Gambar 22a, 22b, 22c dan 22d, tidak memperlihatkan adanya perbedaan intensitas warna yang jelas sebagai tanda terekspresinya molekul VCAM-1. Hal ini kemungkinan disebabkan dosis ion Cu2+ yang ditambahkan saat sel dikultur terlalu kecil, sehingga tidak cukup membuat tekanan dan merusak sel membran sel ketika dikultur. Kemungkinan lain ikatan antibodi antigen tidak terjadi ketika preparatsel dilakukan imunohistokimia, meskipun preparat telah direaksikan dengan antibodi primer (anti VCAM-1 antibody) dan divisualisasikan dengan DAB.

Secara normal sel dapat menghasilkan berbagai senyawa kimia yang dapat merusak sel apabila diberi senyawa ion logam. Ion logam Cu2+ merupakan salah satu senyawa kimia yang dapat menyebabkan sel menjadi stres. Menurut Halliwel et al. (1992), berbagai logam berat dan logam transisi diketahui sebagai katalis radikal bebas. Radikal bebas inilah yang menyebabkan gangguan pada sel, sehingga sel akan mengekspresikan berbagai senyawa kimia. Namun demikian sel dapat mempertahankan diri dari rangsangan yang mempunyai aktivitas tinggi, dengan cara mengekspresikan antibodi untuk melawan rangsangan yang datang. Dalam percobaan ini, logam Cu2+ sebanyak 5 µM yang dikultur ke dalam sel

(10)

99 endotel tidak cukup mempengaruhi perubahan dan menggoyah struktur dari sel endotel.

Gambar 22 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia VCAM-1 sel endotel (SE) dengan 5 µM Cu2+, perbesaran 160x. (a) SE + Ab1 40 µg, (b) SE tanpa Ab, (c) SE + Ab 40 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab 40 µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).

Gambar 23 memperlihatkan efek LDL terhadap sel endotel yang dinkubasi dalam medium pertumbuhan. Dalam percobaan ini diharapkan terjadi reaksi oksidasi LDL di dalam sel endotel yang di kultur, sehingga molekul VCAM-1 dapat diekspresikan kepermukaan sel. Dari hasil percobaan molekul VCAM-1 tidak terekspresikan. Pada Gambar 23c dan 23d, sebelum dilakukan pewarnaan imunohistokimia telah dipra-inkubasikan terlebih dahulu dengan kurkuminoid ekstrak 2ppm dan 6 ppm. Kurkuminoid ekstrak yang ditambahkan diharapkan mampu mencegah reaksi oksdasi LDL di dalam sel endotel sehingga sel yang dikultur tetap stabil. Molekul LDL merupakan senyawa lipoprotein yang dapat mengalami oksidasi di dalam sel apabila diinkubasikan dan dikondisikan sesuai dengan kehidupan sel. Kondisi yang demikian ini dapat meningkatkan aktivitas permukaan sel sehingga permebialitas sel menjadi tidak normal.

Molekul VCAM-1 yang diharapkan muncul kepermukaan sel endotel, ternyata tidak juga terekspresikan meskipun telah direaksikan dengan antibodi anti VCAM-1 dan didivisualisasikan dengan DAB (Gb 23a, 23b, 23 c dan 23d). Hal

a

d c

(11)

100 ini kemungkinan tidak terbentuk reaksi antigen antibodi, atau antibodi primer (anti VCAM-1 antibody) yang digunakan diisolasi dari manusia dan bersifat monoklonal (kit). Sedang sel endotel yang digunakan dalam percobaan berasal dari endotel yang diisolasi dari paru-paru sapi (sel lestari CPAE). Antibodi primer (kit) tidak bereaksi dengan antigen yang berasal dari kultur sel endotel, karena epitop yang dimiliki oleh antibodi primer tidak sesuai dengan paratop dari antigen.

Gambar 23 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia VCAM-1 sel endotel (SE) dengan LDL 200 ug, perbesaran 160x. (a) SE + Ab40 µg, (b) SE tanpa Ab1, (c), SE + Ab40 µg + ET 2 ppm, (d) SE +Ab 40 µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).

Partikel LDL dapat teroksidasi apabila LDL terakumulasi dan menempel pada permukaan sel endotel, yang mengakibatkan sel endotel teraktivasi. Partikel LDL yang menempel pada permukaan pembuluh darah dapat masuk ke dalam intima dan ditangkap oleh reseptor scavenger dari makrofag (Packard & Libby, 2008). Kondisi ini merangsang sel menghasilkan molekul adhesi, namun kenyatannya, dalam percobaan VCAM-1 tidak terekspresikan baik yang diberi perlakuan dengan LDL, ion Cu2+ maupun LDL yang ditambahkan ion Cu2+, serta kontrol reagen. Keadaan ini diduga LDL yang diinkubasikan dalam kultur tidak menggoyah permukaan pembuluh sel endotel yang dikultur, atau antibodi anti VCAM-1 tidak bereaksi tidak sesuai dengan antigen yang muncul ke permukaan

c d

b

(12)

101 sel yang dikultur setelah dilakukan pewarnaan imunohistokimia (Gambar 23a, 23b dan 23c, 23d).

Percobaan yang sama terjadi pada kultur sel yang diinkubasi dengan LDL teroksidasi. Partikel LDL sebelumnya telah direaksikan dengan Cu2+ 5µM. Secara in vitro, oksidasi LDL dapat diinisisasi oleh ion logam seperti ion Cu2+ yang akan memecah ikatan lipid peroksida dan menginisiasi reaksi propagasi (Gambar 24).

Gambar 24 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia VCAM-1 sel endotel (SE) dengan LDL 200 µg, 5µM Cu2+, VCAM-1 perbesaran 160x. (a) SE + Ab 40 µg, (b) SE tanpa Ab, (c), SE+ Ab 40 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab40 µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).

Dalam percobaan ini, sebelum sel endotel yang diinkubasikan dengan LDL teroksidasi, sel pada Gambar 24 d dan 24c telah dipra-inkubasikan selama 48 jam dengan kurkumminoid ekstrak 2 ppm dan 8 ppm. Kurkuminoid ekstrak yang diinkubasikan ke dalam kultur, diharapkan mampu mencegah/ menghambat reaksi oksidasi LDL di dalam sel endotel. Dalam percobaan ini memperlihatkan hasil yang sama seperti pada percobaan sebelumnya, yaitu VCAM-1 tidak terekspresikan.

Molekul VCAM-1 tidak tervisualisasikan dalam percobaan ini meskipun sel endotel yang dikultur telah diinduksi dengan LDL dan diinkubasi dengan Cu2+ 5µM. Adanya kerusakan sel terlihat pada preparat perlakuan pada preparat Gambar 24a dan. 24c sedangkan pada preparat 24b dan 24d bentuk sel masih

b a

d

(13)

102 terlihat utuh. Molekul LDL yang teroksidasi dan diinkubasi dengan sel endotel dalam percobaan in, seharusnya membuat permukaan sel menjadi tidak stabil, sehingga sel memproduksi antibodi (antigen/VCAM-1). Antibodi ini merupakan molekul protein yang diproduksi oleh sistem imun pada sel apabila sel yang dikultur mendapatkan rangsangan/ gangguan dari luar. Sesuai dengan pendapat (Packard & Libby 2008), yang menyatakan bahwa LDL teroksidasi dapat merangsang sel endotel untuk menghasilkan molekul adhesi.

Konsentrasi LDL yang tinggi dan terakumulasi pada permukaan sel, merupakan antigen yang seharusnya dapat bereaksi dengan sel imun yang disekresikan oleh sel. Ini menandakan ada radang pada permukaan sel dan menyebabkan aktivitas sel meningkat. Meningkatnya aktivitas sel menyebabkan perubahan dan intergritas fungsional sel menjadi terganggu. Akibatnya memudahkan lipoprotein masuk ke subendotel. Keadaan ini memicu proses peradangan, sehingga sel akan mengekspresikan berbagai tipe molekul adhesi sel darah putih. Hansson (2005) menyatakan, sel endotel dapat mengekspresikan berbagai molekul adhesi sebagai akibat adanya hiperkolesterolemia yang dapat mengaktifkan permukaan sel endotel.

Protein antibodi akan bereaksi dengan antibodi primer yang sesuai dengan epitop yang ada, ketika preparat diwarnai dengan pewarnaan imunohistokimia. Sel lestari CPAE yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari arteri koronaria pulmonaris sapi, sedangkan antibodi primer ( kit, anti VCAM-1 antibody) yang digunakan berasal dari manusia bersifat monoklonal. Antara antigen dengan antibodi primer tidak klop reaksinya sehingga tidak terbentuk reaksi antigen-antibodi. Keadaan inilah yang menyebabkan molekul adhesi VCAM-1 sel lestari tidak terekspresikan. Meskipun biotinylated horse anti-mouse Ig G sebagai antibodi sekunder telah digunakan untuk memperkuat ikatan antigen antibodi primer secara enzimatis (Ramos, 2005). Karena tidak ada ikatan antigen antibodi, maka molekul adhesi VCAM-1 tidak tervisualisasikan meskupun diberi substrat avidin biotin kompleks horseradish peroksidase dan diwarnai dengan DAB. Kemungkinan juga antibodi primer yang digunakan tidak bekerja secara optimal dengan dosis yang diberi

(14)

103

Ekspresi Molekul Adhesi ICAM-1 pada Permukaan Sel Endotel terhadap Efek Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga.

Gambar 25 memperlihatkan ekspresi molekul adhesi ICAM-1 pada permukaan sel endotel yang di kultur dalam medium pertumbuhan secara in vitro. Dalam percobaan ini, semua kultur sel endotel yang diinkubasikan tanpa diberi perlakuan senyawa kimia apapun, kecuali pada preparat 25c dan 25d yang terlah diinkubasi dengan kurkuminoid ekstrak 2ppm dan 6ppm. Hasil percobaan menunjukkan bahawa, molekul ICAM-1 dapat diekspresikan ke permukaan sel endotel. Terekspresikannya molekul ICAM-1 ditandai dengan munculnya warna kuning kecoklatan pada sel endotel setelah dilakukan imunohistokimia dan diwarnai dengan 3,3-diaminobenzidin tetrahydro chloride (DAB).

Gambar 25 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia ICAM-1 sel endotel (SE), perbesaran 160x: (a) SE + Ab 20 µg, (b) SE tanpa Ab, (c) SE + Ab 20 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab 20 µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).

Masing-masing preparat memperlihatkan intensitas warna molekul adhesi yang cukup jelas. Intensitas warna molekul adhesi yang diekspresikan berwarna coklat kekuningan dan lebih pekat yang ditunjukkan Gambar 25a, 25c, 25d dibandingkan dengan Gambar 25b yang tidak menunjukkan warna. Pada Gambar 25a, sebagai kontrol positif sel tanpa diberi ekstrak kurkuminoid tetapi dalam pewarnaan imunohistokimia perlakuannya sama seperti Gambar 25c dan 25d.

c d

(15)

104 Pada Gambar 25d terjadi reduksi warna dan jumlah sel bila dibandingkan dengan Gb.25c, kaadaan ini disebabkan efek dari pemberi ekstrak kurkuminoid 8ppm, sedangkan Gb. 25c hanya diberi kurkuminoid ekstrak sebanyak 2ppm tanpa terlihat jelas dibandingkan dengan kontrol sel tanpa ekstrak. Kondisi ini menandakan bahwa ekstrak kurkuminoid temu mangga 8 ppm, mampu mengurangi oksidasi sel endotel yang dikultur dalam medium pertumbuhan.

Secara in vitro, sel yang diinkubasi dapat melepaskan radikal bebas sehingga meningkatkan aktivitas permukaan sel. Aktivitas permukaan sel akan memicu terekspresinya molekul adhesi ICAM-1. Antibodi anti ICAM-1 akan bereaksi dengan molekul ICAM-1 yang muncul pada permukaan sel endotel. Radikal bebas merupakan produk yang dihasilkan oleh sel secara in vitro, sebagai akibat gangguan oksidatif sehingga akan terbentuk peradangan (Keaney 2004). Selama peradangan sel akan memproduksi sitokina maupun sel imun sehingga sel dapat mengekspresikan molekul adhesi leukosit.

Menurut Sadikin (2001) serangan radikal bebas terhadap molekul sekelilingnya akan menyebabkan terjadinya reaksi berantai, kemudian menghasilkan senyawa radikal baru. Dampak reaktivitas senyawa radikal bebas dapat bermacam-macam dimulai dari kerusakan sel atau jaringan, penyakit autoimun, penyakit degeneratif hingga kanker. Pada patogenesis aterosklerosis, ekspresi molekul adhesi pada sel endotel mengawali datang dan menempelnya sel radang ke permukaan lumen pembuluh darah, aktivasi sel radang dan pembebasan sitokina serta menumpuknya lipid pada plak aterosklerosis (Crowther 2005). Berbagai rangsangan yang dapat menimbulkan terjadinya radang (pro-inflammatory) adalah hiperkolesterolemia, hipertensi, obesitas, merokok, hiperglikemia. Semua rangsangan ini dapat menginduksi ekpsresi molekul adhesi seperti P-selektin dan VCAM-1(Packard & Libby 2008). Secara lebih spesifik lagi karena radikal bebas ROS akan mengaktifkan sel endotel sehingga memproduksi sitokina yang selanjutnya akan menginduksi terbentuknya molekul adhesi (Libby dan Ridker 2006). Molekul adhesi VCAM-1 dilaporkan dapat terekspresi secara berlebihan melalui induksi pakan aterogenik pada hewan coba (Li 1993). Demikian pula LDL teroksidasi juga dapat meningkatkan ekspresi molekul adhesi pada sel endotel (Libby & Ridker 2006).

(16)

105 Efek logam transisi berupa ion Cu2+ pada permukaan sel endotel dapat menyebabkan kerusakan pada komponen penyusun membran sel (Caterina et al.200; Pakard & Libby 2006). Kerusakan terjadi pada asam lemak tak jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid penyusun membrane sel. Membran merupakan barier penting agar sel dapat berfungsi normal, demikian juga dengan sistem membran sel imun untuk berbagai antigen. Respon ekspresi molekul adhesi ICAM-1 pada permukaan sel endotel yang diinduksi dengan ion Cu2+5 µM dalam medium pertumbuhan, menunjukkan terekspresinya molekul ICAM-1 (Gambar 26).

Gambar 26 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia ICAM-1 sel endotel (SE) dengan Cu2+ 5 µM: (a) SE + Ab 20 µg, (b) SE tanpa Ab, (c) SE + Ab 20 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab 20 µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).

Preparat sel endotel yang dikultur dalam medium pertumbuhan mampu mengekspresikan molekul adhesi ICAM-1 yang ditandai dengan munculnya warna kuning kecoklatan pada sel endotel. Masing-masing preparat memperlihatkan warna yang cukup jelas. Intensitas warna kekuningan coklat yang diekspresikan oleh molekul adhesi warnanya lebih pekat ditunjukkan Gambar 26a; 26c; dan 26d. Jika dibandingkan dengan Gambar 26b yang tidak menunjukkan adanya molekul ICAM-1. Pada Gambar 26a, sebagai kontrol positif sel tanpa diberi ekstrak kurkuminoid tetapi dalam pewarnaan imunohistokimia perlakuannya sama seperti Gambar 26c dan 26d. Dalam pewarnaan

b

(17)

106 imunohistokimia, Gambar 26a 26c 26d masing-masing dereaksikan dengan antibodi primer dan anti bodi sekunder. Sedangkan pada preparat Gambar 26 b digunakan sebagai kontrol reagen tanpa diberi antibodi primer, tetapi hanya diinkubasikan dengan antibodi sekunder.

Pada Gambar 26d , sel endotel yang dikultur dengan ion Cu2+ sebelumnya telah dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid ekstrak 8ppm. Hasil pewarnaan imunohistokimia terhadap preparat tersebut terjadi reduksi ekspresi ICAM-1, bila dibandingkan dengan preparat Gambar 26c yang diinkubasi dengan kurkuminoid ekstrak 2 ppm. Hal ini disebabkan ion Cu2+ yang digunakan dalam percobaan dapat menginduksi oksidasi lipid pada membran sel endotel yang dikultur. Efek yang ditimbulkan pada proses oksidasi lipid oleh ion Cu2+ adalah, sel akan mengekspresikan ICAM-1 ke permukaan. Namun demikian , efek ion Cu2+ ini dapat dihambat oleh kurkuminoid ekstrak temu mangga 8 ppm dengan cara yang menghambat laju oksidasi lipid pada sel endotel sehingga ekspresi ICAM-1 berkurang.

Ion Cu2+ merupakan senyawa kimia yang dapat mengaktifkan sel radang, sehingga sel akan melepaskan sitokina yang dapat merangsang terbentuknya molekul adhesi ICAM-1 maupun VCAM-1. Antibodi anti ICAM -1 dapat bereaksi dengan molekul adhesi ICAM-1 yang diekspresikan oleh permukaan sel endotel yang dikultur. Sesuai pendapat yang dikemukan oleh Halliwell et al.(1992), berbagai logam berat dan logam transisi diketahui sebagai katalis radikal bebas. Radikal bebas merupakan molekul kecil yang dapat merusak dan mengoksidasi sel, sehingga sel menjadi tidak stabil yang mengakibatkan aktivitas sel jadi terganggu. Dalam kondisi patologis, keseimbangan normal antara produksi senyawa oksigen reaktif dengan kemampuan pertahanan antioksidan akan mengalami gangguan. Keadaan ini akan mengganggu rantai oksidasi- reduksi normal sehingga terjadi kerusakan oksidatf jaringan yang disebut sebagai stress oksidatif (Halliwell & Chirico1993). Dalam penelitian ini, molekul ICAM-1 terekspresi ke permukaan sel sebagai akibat pengaruh Cu2+ yang mengoksidasi sel endotel sehingga ICAM-1 dapat terekspresikan.

Garbacki et al. (2005) melakukan pewarnaan imunohistokimia terhadap jaringan paru-paru. Hasil yang diperoleh menunjukkan terekspresinya VCAM-1

(18)

107 dan ICAM-1 pada permukaan sel. Pewarnaan yang sama dilakukan sel endotel LT2 yang diinduksi dengan TNF-ά secara in vitro, ternyata molekul adhesi (ICAM-1) dapat dieksperesikan ke permukaan sel endotel. Sedangkan secara, in vivo proses aterosklerosis diawali dengan adanya gangguan fungsi endotel Hewan yang diberi pakan aterogenik, akan memicu terekspresinya molekul adhesi (VCAM-1) pada permukaan sel endotel dan merupakan tahap awal kejadian aterosklerosis. Sesuai pendapat yang dikemukan oleh Crowther (2005), peningkatan adhesi seluler berhubungan dengan adanya disfungsi endotel dan pada tahap selanjutnya terjadi pengambilan sel-sel radang, pelepasan sitokina dan pengambilan lipid yang pada akhir menjadi plak aterosklerosis .

Hal yang sama terjadi pada kultur sel endotel yang diinkubasikan dengan LDL. Data yang diperoleh menunjukkan terekspresiknya molekul ICAM-1 berwarna kuning kecoklatan pada permukaan sel endotel. (Gambar 27). Molekul ICAM-1 yang terekspresikan memberikan warna yang cukup mencolok seperti pada Gambar 27a, 27c dan 27d. Ekspresi ICAM-1 yang sangat mencolok terlihat pada Gambar 27a, 27c dibandingkan dengan preparat pada Gambar 27b dan 27d. Namun tidak demikian dengan Gambar 27b sebagai kontrol reagen, molekul ICAM-1 tidak terekpresi kepermukaan sel endotel. Molekul adhesi yang terekpresi desebabkan adanya reaksi oksidasi LDL di dalam sel endotel yang dikultur. Oksidasi LDL ini memicu molekul adhesi terekpresikan ke permukaan sel endotel sehingga menarik monosit untuk menempel pada permukaan sel dan infiltrasi ke dalam intima. Pada Gambar 27d terlihat penurunan ekspresi ICAM-1 pada permukaan sel endotel dibandingkan Gambar 27c. Penurunan ekspresi ICAM-1 kemungkinan dipengaruhi dengan pemberian kurkuminoid 2 ppm dan 8 ppm sebelum sel diikubasikan dengan LDL.

Kurkuminoid ekstrak 8 ppm yang diinkubasikan (27d) memperlihatkan reduksi/penurunan ekspresi ICAM-1, jika dibandingkan dengan preparat pada Gambar 27a (kontrol positif) tanpa kurkuminoid ekstrak. Pada Gambar 27c, preparat yang dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid ekstrak 2 ppm, menunjukkan ekspresi ICAM-1 lebih dominan dari Gambar 27d. Namun demikian ekspresi ICAM-1 berkurang (Gambar 27 c) dibandingkan dengan kontrol positif (27a) tanpa diberi kurkuminoid ekdtrak temu mangga.

(19)

108 Gambar 27 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia ICAM-1 sel endotel (SE) dengan LDL 200 µg, perbesaran160x: (a) SE + Ab 20 µg, (b) SE tanpa Ab, (c) SE + Ab 20 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab20 µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).

Terekspresinya ICAM-1 pada permukaan sel endotel tentu saja dapat terjadi. Molekul LDL sebagai inisiator yang dapat memicu munculnya molekul adhesi ke permukaan sel. Sesuai pendapat yang dikemukan oleh Packard dan Libby (2008), kolesterol terutama LDL merupakan agen yang dapat menstimuli senyawa-senyawa radang kepermukaan sel sebagai lesi awal dari ateroskleroisi. Hal yang sama dikemukan oleh Hansson (2008) bahwa LDL yang menempel pada permukaan sel endotel dapat memicu sel memproduksi sitokina maupun radikal bebas. Molekul kimia yang diproduksi sel ini menandakan adanya reaksi peradangan sehingga molekul adhesi terekpresikan.

Pewarnaan imunohistokimia memperkuat hasil penelitan yang diperoleh Reaksi antigen-antibodi (ag-ab1) pada pewarnaan ini, menunjukan bahwa sel endotel yang dikultur dan diinduksi dengan ion Cu2+, LDL dan LDL teroksidasi dapat mengekspresikan ICAM-1. Adanya biotinylated horse anti-mouse Ig G sebagai antibodi sekunder memperkuat ikatan ag-ab1 secara enzimatis. Ikatan ag-ab1, menyebabkan molekul ICAM-1 tervisualisasikan setelah diberi substrat avidin biotin kompleks horseradish peroksidase dan diwarnai dengan DAB (Danskey et al. 2002, Ramos 2005). Pada kontrol reagen dalam penelitian ini, molekul ICAM-1 tidak tervisualisasikan meskipun telah diberi substrat avidin biotin kompleks horseradish peroksidase dan diwarnai dengan DAB

b

c d

(20)

109 Molekul LDL yang teroksidasi merupakan salah satu penyebab terjadinya ateroskleroriss yang ditandai dengan pembentukan awal plak ateroma. Plak ateroma terbentuk sebagai akibat proses oksidasi yang terjadi di dalam tubuh. Kondisi ini mengakibatkan radikal bebas yang ada di dalam tubuh akan mengoksidasi lipid lebih lanjut menghasilkan produk oksidasi lipid seperti malonaldehid. Adanya kerusakan pada permukaan sel pembuluh darah akan mengakibatkan perubahan struktur sel dan aktivis sel menjadi tidak stabil. Apabila kondisi ini berjalan terus menerus maka akan menimbulkan pembentukan kumpulan sel membentuk sel busa. Sel busa yang terbentuk merupakan tahap awal terjadinya proses aterosklerosis.

Gambar 28 memperlihatkan ekspresi molekul adhesi ICAM-1 dan pembentukan sel busa pada permukaan sel endotel yang diinduksi dengan LDL teroksidasi (LDL+ ion Cu2+).

Molekul ICAM-1 terekspresi dengan jelas dan terjadi pembentukan kumpulan sel sel busa. Kondisi diduga terjadi oksidasi LDL pada sel endotel yang dikultur (Gambar 278a, 28c dan 28d). Molekul LDL yang teroksidasi, kecuali merangsang teraktivasinya permukaan sel endotel, juga dapat merusak permukaan sel itu sendiri. Hasil uji terhadap kontrol positif (Gambar 28a), kultur sel endotel tanpa dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid dan hasil yang diperoleh terlihat jelas adanya pembentukan sel-sel busa maupun ekspresi ICAM-, dibandingkan dengan kontrol reagen (28b). Pada kontrol reagen, ketika sel endotel dikultur tanpa ditambahkan kurkuminoid, dan ketika dilakukan pewarnaan imunohistokimia tanpa diinkubasikan dengan antibodi anti ICAM-1. Demikian juga hal yang sama terjadi pada perlakuan (Gambar 28c dan 28d), menunjukkan adanya kumpulan sel-sel busa disamping terekspresinya molekul ICAM-1, bila dibandingkan dengan kontrol reagen (Gambar 28c). Tidak adanya perbedaan yang terjadi pada Gambar 28a,28c dan 28d (kontrol positif dan perlakuan), mengindikasikan pada permukaan sel endotel yang dikultur akativitasnya meningkat.

(21)

110 Gambar 28 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia ICAM-1 sel endotel (SE), dengan 200µg LDL & 5µM Cu2 +, perbesaran 160x: (a) SE + Ab20 µg, (b) SE tanpa Ab, (c) SE + Ab 20 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab 20 µg + ET 8 ppm (ET: ekstrak temu mangga). Menurut pendapat yang dikemukan oleh Crowther (2005), sel busa merupakan metabolit aktif yang dapat mensekresikan berbagai sitokina dan mediator radang, dan pada akhirnya akan menyebabkan sel otot polos untuk berproliferasi sebagai akibat dari meningkatnya aktivitas sel.

Dalam percobaan ini, molekul adhesi ICAM-1 dan kumpulan sel-sel busa nampak yang terbentuk sangat jelas. Semua ini terjadi setelah preparat sel endotel (sel line CPAE) direaksikan dengan antibodi anti ICAM-1, sehingga terbentuklah ikatan antigen antibodi (ag-ab). Terbentuknya reaksi ag-ab merupakan tanda awal ada gangguan pada permukaan sel yang dikultur. Antibodi primer (kit, anti-ICAM-1 antibody) yang digunakan berasal dari manusia bersifat monoklonal. Antara antigen dengan antibodi primer klop reaksinya karena epitop dari antibodi primer sesuai dengan paratop dari ICAM-1 antigen. Antibodi sekunder digunakan dalam pewarnaan imunohistokimia memperkuat ikatan antigen - antibodi secara enzimatis. Sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Ramos (2005), bahwa biotinylated horse anti-mouse Ig G merupakan antibodi sekunder yang akan memperkuat ikatan antigen antibody secara enzimatis. Selanjunya dikatakan bahwa, reaksi warna ini semakin jelas setelah diberi substrat avidin biotin kompleks horseradish peroksidase dan diwarnai dengan DAB.

b

a

(22)

111 Molekul LDL yang diinkubasi pada sel endotel dapat mengoksidasi sel sehingga merangsang pembentukkan molekul adhesi. Menurut Hansson (2005) dan Libby (2002), molekul LDL teroksidasi sebagai akibat dari reaksi oksidasi maupun bereaksi secara enzimatis terhadap intima pembuluh darah sehingga akan terjadi pelepasan fosfolipid yang dapat mengaktifkan sel-sel endotel dalam mengekspresikan molekul adhesi. Sedangkan menurut Packard & Libby (2008), menyatakan bahwa LDL teroksidasi merupakan antigen yang akan merangsang permukaan sel sehingga terjadi radang. Peradangan ini akan menghasilkan sitokina maupun limfosit sel T, sehingga memproduksi molekul adhesi. Dalam percobaan ternyata LDL terakumulasi pada permukaan sel, yang merupakan penyebab utama terekspresinya molekul ICAM-1.Molekul ICAM-1 adalah imunoglobulin (Ig) seperti sel molekul adhesi yang diekspresikan oleh beberapa tipe sel yang melibatkan leukosit dan sel endotel pada perkembangan lesi aterosklerosis (Lawson & Wolf 2009).

Adhesi leukosit pada sel dinding endotel merupakan mekanisme utama yang merespon pembentukan oksigen radikal bebas (ROS), dan pada akhirnya akan menghasilkan oksidan sitotoksik dan mediator peradangan yang mengaktifkan sistem komplemen. Dalam kondisi normal, sel leukosit bergerak bebas di sepanjang sel endotel. Selama iskemik dan peradangan, sel endotel akan memebebaskan berbagai mediator. Kondisi ini menyebabkan molekul adhesi leukosit muncul pada permukaan sel sehingga akan memobilisasi dan merangsang granula-granula leukosit. Oksidan yang dihasilkan dapat menyebabkan kerusakan jaringan sehingga terjadi radang (Caterina et al. 2000; Hoorn et al. 2003; Joris et al.1983)

Sesuai dengan teori yang dikemukan oleh Steinberg (1993), lesi aterosklerotik diawali oleh teroksidasinya LDL sehingga mengakibatkan endotel mengekspresikan perlekatan monosit dan menghasilkan monocyte chemotatic protein (MCP) dan macrophage colony stimulating factor (M-CSF). Induksi tersebut mengakibatkan monosit berubah menjadi makrofag dan menempel pada endotel. Selanjutnya makrofag akan memfagositose LDL teroksidasi, kemudian akan terakumulasi pada dinding pembuluh darah membentuk sel busa dan berakhir dengan terbentuknya lesi awal yang dikenal sebagai lempeng kolesterol.

(23)

112 Dalam penelitian yang telah dilakukan, ekstrak kurkuminoid temu mangga (ET) yang ditambahkan ke dalam kultur pada sel lestari endotel (2 ppm dan 8 ppm) tidak dapat menahan reaksi oksidasi LDLterhadap sel, sehingga kerusakan pada sel lestari tetap terjadi.

Pada Gambar 21 - 24, terlihat jelas bawa molekul VCAM-1 tidak terekspresikan walaupun telah direaksikan dengan antibodi primer dan divisualisasikan dengan DAB. Sedangkan molekul ICAM-1 (Gambar 25-28) terekpresikan pada permukaan sel setelah divisualisasikan dengan DAB. Pada Gambar 28 selain molekul ICAM-1 yang terbentuk, juga adanya kumpulan sel busa. Hal ini disebabkan oleh akumulasi LDL teroksidasi pada sel endotel yang dikultur. Akumulasi LDL teroksidasi ini akan ditangkap oleh reseptor scavenger dari makrofag sehingga terbentuk sel busa. Molekul LDL teroksidasi merupakan agen penyebab abnormalnya permukaan sel endotel, namun belum tentu merupakan penyebab awal terjadinya aterosklerosis. Molekul adhesi seperti VCAM-1 dapat terekspresi pada permukaan sel, tetapi tidak hanya dipengaruhi oleh LDL teroksidasi maupun ion ligam transisi, dan juga banyak faktor yang menentukan seperti faktor internal sel, lama waktu inkubasi, antigen yang dapat meninduksi ekspresi VCAM, jenis antibodi primer yang digunakan, maupun dosis efektif obat yang diberikan.

Pada prinsipnya pewarnaan imunohistokimia merupakan suatu metode yang didasarkan atas reaksi antigen antibodi. Sel endotel (sel lestari CPAE) ditumbuhkan dalam medium pertumbuhan dan diinkubasi dengan LDL teroksidasi. Molekul adhesi dapat terekspresikan apabila sel lestari mengalami gangguan akibat pemberian LDL oksidasi. Antibodi primer yang digunakan adalah monoclonal anti VCAM-1 dan monoclonal antibody Human ICAM-1 (CD54). Biotinylated horse anti-mouse Ig G digunakan sebagai antibodi sekunder. Antibodi skunder memperkuat ikatan antigen (molekul adhesi yang muncul ke permukaan sel) dengan antibodi primer secara enzimatis, sehingga apabila molekul ini diberi substrat avidin biotin kompleks horseradish peroksidase akan tervisualisasikan dengan jelas. Slide preparat diwarnai dengan larutan 3,3-diaminobenzidin tetrahydro chloride (DAB).

(24)

113

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan yang telah dilakukan dapat di tarik beberapa simpulan sebagai berikut: Dalam percobaan ini, molekul VCAM-1 tidak terekspresikan, sedangkan ICAM-1 dapat terekspresikan ke permukaan sel endotel. Kurkuminoid ekstrak temu mangga 8 ppm mampu menekan efek ion Cu+2, LDl dan LDL teroksidasi pada permukaan sel endotel. Selain itu kurkuminoid 8 ppm mampu mereduksi ekspresi molekul ICAM-1. Secara in vitro, efek ion logam transisi Cu2+ dan LDL teroksidasi dapat meningkatkan gangguan permukaan pada sel endotel sehingga terbentuk sel-sel busa dan terekspresinya ICAM-1.

Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengkaji mekanisme kerja kurkuminoid ekstrak temu mangga dalam menekan ekpresi molekul adhesi (ICAM-1, VCAM-1) secara in vitro. Selain itu, diperlukan orientasi konsentrasi antibodi primer maupun konsentrasi kurkuminoid ekstrak temu mangga yang digunakan.

DAFTAR PUSTAKA

Caterina DR, Liao JK, Libby P. 2000. Fatty acid modulation of endothelial activation. http://www.ajcn.org/cgi/content/full/71/1/213 [23 maret 2001]. Crawther MA. 2005. Pathogenesis of atherosclerosis. The American Society of

hematology, 1-11.

Danskey HM, Barlow CB, Lominska C, Sikes JL, Kao C, Weinsaft J, Cybulsky MI, Smith JD. 2002. Adhesion of monocyte to arterial endothelium and initiation of atherosclerosis are critically dependent on vascular cell adhesion molecule-1 gene dosage. Arterioscler Thromb Vasc Biol 21:1662-1667.

(25)

114 Garbacki N, Kinet M, Nusgens B, Desmecht D, Darr J. 2005. Proanthocyanidins from Ribes nigrum leaves, reduce endothelial adhesion molecule ICAM-1 and VCAM-1. http://www.Journal-Inflammation.com/content/2/1/9 [9 Juni 2006].

Hansson GK. 2005. Inflamation, atherosclerosis and coronary atery disease. Atheroscler Thromb Vasc Biol. 352:1685-1695.

Hansson GK. 2009. Atherosclerosis-an immune disease: the Atnitschove lecture 2007. Atheroscler, 202(1):2:10.

Halliwell B, Chirco S. 1993. Lipid peroxidation: its mechanisms, measurement and significance. Am. J. Clin. Nutr. 57: 715S-715S.

Halliwell B, Gutteridge JMC, Cross CE. 1992. Free radicals, antioxidants and human disease. J. Lab Clin Med. 119(6):598-620.

Hoorn van DE , Norren vK , Boelens PG, Nijveldt RJ, Leeuwen van PAM .2003. Biological activities of flavonoids. Sci & Med 9(3):152-161.

Inoue K, Kobayashi M, Yano K, Miura M, Izumi A, Mataki C, Doi T, Hamakubo T, Reid PC, Hume DA, Yoshida M, Aird WC, Kodama T, and Minami T. 2006. Histon deacetylase inhibitor reduce monocyte adheresion to endothelium through the suppression of vascular cell adhesion molecule-1 expression. Ateriolscler, Thrombosis, and vascular biology. 26:2652. Joris IT, Zand T, Nunnari TJJ, Krolokowski FJ, Majno G. 1983. Studies on the

pathogenesis of atherosclerosis. I. adhesion of mononuclear cells in the aorta of hypercholesterolemic rats. Ams J. Pathol.113:341-358.

Lawson C & Wolf S. 2009. ICAM-i signalling in endothel cells. Pharmacology Reports. 61:22-32.

Keaney JF et al. 2004. Vitamin E and vascular homeostasis: implication for atherosclerosis. Faseb J. 13:965-972.

Li H, Cybulsky MI, Gimbrone MA, Libby P. 1993. An atherogenic diet rapidly induces VCAM-1, a ytokine-regulatable mononuclear leukocyte adhesion molecule, in rabbit aortic endothelium. Arterioscler Thromb.: 13(2):197-204.

Libby P, Ridker PM. 2006. Inflammation and atherothrombosis: from population biology and bench research to clinal practice. J Am Coll Cardiol 2006; 48:A33-46

Libby P. 2002. Inflamation in atherosclerosis. Nature 42:868-874.

Linton NF & Fazio. 2003. Macrophage, inflammation, and atherosclerosis. Int.J. obesity. 27, 335-540.

Gambar

Gambar  21  Gambaran  mikroskopis  pewarnaan  imunohistokimia  VCAM-1  sel  endotel (SE),  perbesaran 160x
Gambar  22  Gambaran  mikroskopis  pewarnaan  imunohistokimia  VCAM-1  sel  endotel (SE)  dengan 5 µM Cu 2+ , perbesaran  160x
Gambar  23  Gambaran  mikroskopis  pewarnaan  imunohistokimia  VCAM-1  sel  endotel (SE)  dengan LDL 200 ug, perbesaran 160x
Gambar  24  Gambaran  mikroskopis  pewarnaan  imunohistokimia  VCAM-1  sel  endotel (SE) dengan LDL 200 µg, 5µM Cu 2+ , VCAM-1  perbesaran  160x
+3

Referensi

Dokumen terkait

BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Dari hasil kerja praktik yang telah dilakukan dan juga proses analisis, perancangan, pembuatan dan implementasi aplikasi absensi siswa pada SMP

Pengelolaan missed abortion perlu diutarakan kepada pasien dan keluarganya secara baik karena risiko tindakan operasi dan kuretase ini dapat menimbulkan komplikasi

Undang-Undang Nomor 15 tahun 2001 tentang Merek khususnya Pasal 6 ayat (3) huruf (b) memberikan perlindungan terhadap lambang Palang Merah karena termasuk lambang milik

M eteorologi mengenal sistem skala dalam melakukan sebuah analisis. Skala global merupakan skala meteorologi yang paling luas. Skala global dapat mempengaruhi fenomena meteorologi

memberikan persepsi nilai yang baik terhadap keempat merek sepeda motor tersebut. Nilai rata-rata yang berhasil didapatkan merek sepeda motor Suzuki

Konsekuensi yang diharapkan klien dapat memeriksa kembali tujuan yang diharapkan dengan melihat cara-cara penyelesaian masalah yang baru dan memulai cara baru untuk bergerak maju

• Orang di dunia kerja Tidak dapat Serohani dengan mereka yang full-time di gereja. • Fungsi utama dari

Pertumbuhan anak-anak hasil persilangan memiliki komposisi 3 jenis ayam lokal (kampung, pelung, dan sentul) serta ayam ras pedaging, dengan harapan dapat menjadi model untuk