III. BAHAN DAN METODE 3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Kebun Percobaan PG Djatiroto, PTPN XI, Kabupaten Lumajang, Jawa Timur (Lampiran 1), Laboratorium ICBB, Laboratorium Bioteknologi Tanah dan Laboratorium Kimia dan Kesuburan Tanah. Penelitian dimulai sejak bulan Februari 2011 sampai bulan September 2011.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 23 sampel daun tebu transgenik IPB 1 dan satu sampel daun tebu isogenik. Untuk analisis klorofil digunakan sampel daun ke-3 dari atas dari tiap rumpun dalam satu leng tanaman, H3BO3, ethanol, air, dan aquades. Untuk analisis N dan P digunakan sampel daun
ke-2 dari bawah dari tiap rumpun dalam satu leng tanaman.
Alat-alat yang dibutuhkan adalah pisau, gunting, penggaris/meteran, coolbox, kantung kertas, plastik klip, mortar, sentrifuse, cryotube, oven, tabung reaksi, vortex, spektrofotometer, neraca analitik ketelitian tiga desimal, tabung digestion dan blok digestion, tabung reaksi, alat destilasi, bulp, pipet dan pipet mikro, labu didih, erlenmeyer 100 ml, dan gelas ukur.
3.3. Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dengan menggunakan rancangan acak kelompok (RAK) dengan sumber keragaan yaitu perlakuan pemupukan, klon, dan ulangan. Ada empat perlakuan pemupukan yaitu a (pemupukan N 50% dan P 50%), b (pemupukan N 100% dan P 50%), c (pemupukan N 50% dan P 100%), d (pemupukan N 100% dan P 100%) dan diulang sebanyak tiga kali ulangan. Pengaruh perlakuan terhadap hasil analisis klorofil dan N dan P didasarkan atas hasil keragaman (ANOVA) dengan membandingkan nilai F hitung terhadap F tabel pada selang kepercayaan 95% (α 0,05).
3.4. Metode Penelitian 3.4.1. Perlakuan
Sebanyak 24 klon tebu transgenik IPB 1 ditanam secara acak di kebun Sumbersuko V9/10 PG Djatiroto kabupaten Lumajang, Jawa Timur dengan empat
perlakuan dan tiga kali ulangan (Lampiran 2). Berikut adalah denah tanam tebu transgenik IPB 1 dengan empat perlakuan dan tiga kali ulangan. Kode setiap perlakuan dan ulangan terdiri dari tiga digit. Digit pertama berupa huruf kapital menyatakan jenis klon, digit kedua berupa huruf kecil menyatakan perlakuan pemupukan, dan digit ketiga berupa angka menyatakan ulangan (Aa1 menunjukkan klon tebu trasngenik IPB 1-34 dengan perlakuan pemupukan N 50% dan P 50% ulangan 1).
La1 Ka1 Ja1 Ia1 Ha1 Ga1 Fa1 Ea1 Da1 Ca1 Ba1 Aa1 Xa1 Wa1 Va1 Ua1 Ta1 Sa1 Ra1 Qa1 Pa1 Oa1 Na1 Ma1 Kb1 Jb1 Ib1 Hb1 Gb1 Fb1 Eb1 Db1 Cb1 Bb1 Ab1 Lb1 Wb1 Vb1 Ub1 Tb1 Sb1 Rb1 Qb1 Pb1 Ob1 Nb1 Mb1 Xb1 Jc1 Ic1 Hc1 Gc1 Fc1 Ec1 Dc1 Cc1 Bc1 Ac1 Lc1 Kc1 Vc1 Uc1 Tc1 Sc1 Rc1 Qc1 Pc1 Oc1 Nc1 Mc1 Xc1 Wc1 Id1 Hd1 Gd1 Fd1 Ed1 Dd1 Cd1 Bd1 Ad1 Ld1 Kd1 Jd1 Ud1 Td1 Sd1 Rd1 Qd1 Pd1 Od1 Nd1 Md1 Xd1 Wd1 Vd1 La2 Ka2 Ja2 Ia2 Ha2 Ga2 Fa2 Ea2 Da2 Ca2 Ba2 Aa2 Xa2 Wa2 Va2 Ua2 Ta2 Sa2 Ra2 Qa2 Pa2 Oa2 Na2 Ma2 Kb2 Jb2 Ib2 Hb2 Gb2 Fb2 Eb2 Db2 Cb2 Bb2 Ab2 Lb2 Wb2 Vb2 Ub2 Tb2 Sb2 Rb2 Qb2 Pb2 Ob2 Nb2 Mb2 Xb2 Jc2 Ic2 Hc2 Gc2 Fc2 Ec2 Dc2 Cc2 Bc2 Ac2 Lc2 Kc2 Vc2 Uc2 Tc2 Sc2 Rc2 Qc2 Pc2 Oc2 Nc2 Mc2 Xc2 Wc2 Id2 Hd2 Gd2 Fd2 Ed2 Dd2 Cd2 Bd2 Ad2 Ld2 kd2 Jd2 Ud2 Td2 Sd2 Rd2 Qd2 Pd2 Od2 Nd2 Md2 Xd2 Wd2 Vd2 La3 Ka3 Ja3 Ia3 Ha3 Ga3 Fa3 Ea3 Da3 Ca3 Ba3 Aa3 Xa3 Wa3 Va3 Ua3 Ta3 Sa3 Ra3 Qa3 Pa3 Oa3 Na3 Ma3 Kb3 Jb3 Ib3 Hb3 Gb3 Fb3 Eb3 Db3 Cb3 Bb3 Ab3 Lb3 Wb3 Vb3 Ub3 Tb3 Sb3 Rb3 Qb3 Pb3 Ob3 Nb3 Mb3 Xb2 Jc3 Ic3 Hc3 Gc3 Fc3 Ec3 Dc3 Cc3 Bc3 Ac3 Lc3 Kc3 Vc3 Uc3 Tc3 Sc3 Rc3 Qc3 Pc3 Oc3 Nc3 Mc3 Xc3 Wc3 Id3 Hd3 Gd3 Fd3 Ed3 Dd3 Cd3 Bd3 Ad3 Ld3 Kd3 Jd3 Ud3 Td3 Sd3 Rd3 Qd3 Pd3 Od3 Nd3 Md3 Xd3 Wd3 Vd3
Gambar 2. Denah Tanam Tebu Transgenik IPB 1
Perlakuan pemupukan yang diberikan adalah pemupukan N sebanyak 50% dan P sebanyak 50% (a). Perlakuan kedua adalah pemupukan N sebanyak 100% dan P sebanyak 50% (b). Perlakuan ketiga adalah pemupukan N sebanyak 50% dan P sebanyak 100% (c). Dan perlakuan keempat adalah pemupukan N sebanyak
100% dan P sebanyak 100% (d). Masing-masing perlakuan diatas mengikuti dosis standar pemupukan yaitu pupuk ZA 8 kuintal/ha, SP-36 2 kuintal/ha, dan KCl 1 kuintal/ha.
3.4.2. Teknik Pengambilan Sampel
Sampel pengamatan ditetapkan dan ditandai secara acak pada tiap-tiap rumpun sehingga memudahkan pada saat pengukuran keragaan dan pengambilan sampel. Keragaan suatu klon tanaman adalah hasil pengukuran rata-rata dari setiap sampel pengamatan terpilih pada tiap rumpun dalam satu leng. Keragaan yang diukur meliputi panjang batang, diameter batang dan jumlah batang. Untuk analisis N dan P diambil daun ke-2 dari bawah yang berwarna hijau dari tiap-tiap sampel. Sedangkan untuk analisis klorofil diambil daun ke-3 dari atas.
3.4.3. Penanganan Sampel
Untuk analisis N dan P daun yang sudah terpilih diambil dan dipotong-potong dengan ukuran lebih kurang 20 cm. Daun yang sudah diambil dimasukkan ke dalam kantong kertas dan segera dikeringkan. Untuk analisis klorofil, daun yang sudah diambil dipotong lebih kurang 20 cm dan dimasukkan kedalam plastik klip kemudian dimasukkan dalam coolbox yang berisi es agar tetap segar.
3.4.4. Pemilihan Klon Terbaik Berdasarkan Keragaan
Pemilihan klon terbaik didasarkan atas hasil pengukuran yang dilakukan Rifki (2012). Setelah terpilih tujuh klon terbaik berdasarkan skoring keragaan (Lampiran 3), selanjutnya dilakukan analisis kandungan hara N dan P.
3.4.5. Analisis Tanaman di Laboratorium 3.4.5.1. Analisis Kandungan Klorofil
Analisis kandungan klorofil dilakukan di laboratorium dengan menggunakan metode Wintermans dan De Mots (1965):
1. 0,1 g sampel daun yang masih segar dicuci dengan air mengalir, kemudian dikeringkan dengan kertas pengering atau tissue. Daun dipotong menjadi bagian kecil untuk memudahkan dalam penggerusan.
2. 0,5 ml 10 mM asam borat (H3BO3) dingin ditambahkan pada daun di
atas mortar. Kemudian daun digerus sampai halus. Ketika melakukan penggerusan dilakukan di atas es agar klorofil tidak rusak.
3. Hasil gerusan (ekstrak) dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge polyethylene (cryotube) ukuran 1,5 ml.
4. Ekstrak kemudian disentrifuge dengan kecepatan 15000 rpm selama 5 menit.
Pengukuran Klorofil:
a. 40 µl ekstrak klorofil diambil dari cryotube, kemudian dimasukkan ke dalam cryotube yang baru. Etanol ditambahkan hingga volumenya mencapai 1,5 ml. kemudian dikocok dengan vortex agar tercampur rata.
b. Ekstrak klorofil diinkubasi pada suhu 4°C di dalam ruang gelap selama 30 menit.
c. Setelah itu disentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit. d. Ekstrak klorofil hasil dari sentrifuge (supernatant) dipindahkan ke
cuvette spektrofotometer ukuran 5 ml.
e. Absorban diukur pada panjang gelombang λ 649 nm dan λ 665 nm. Etanol 96% digunakan sebagai pembanding.
Perhitungan:
1. Klorofil a = (13,7 x A665) – (5,76 x A649) = µg klorofil/ml 2. Klorofil b = (25,8 x A649) – (7,60 x A665) = µg klorofil/ml 3. Kandungan Klorofil Total = Klorofil a + Klorofil b
3.4.5.2. Analisis Kandungan Nitrogen pada Tanaman
Penetapan unsur N pada tanaman menggunakan metode Pengabuan Basah: 1. Membuat larutan pereaksi:
a. Untuk destruksi: Asam sulfat pekat ( 95 – 97 % ) p.a. dan H2O2 pekat
(30 %) p.a.
b. Untuk destilasi: Larutan NaOH 50 %, HCl 0,1 N, Indikator Conway, Asam Borat 4 %
2. Mengerjakan destruksi contoh
a. Contoh tanaman sebanyak 0,5 g dimasukkan kedalam tabung
digestion, tambahkan asam sulfat pekat 5 ml dan H2O2 pekat 2 ml.
b. Contoh tanaman yang telah ditambahkan asam sulfat pekat dan H2O2
pekat dipanaskan dalam blok digestion pada suhu 235oC selama satu jam. Angkat dan biarkan mendingin, tambahkan lagi 2 ml H2O2 pekat.
c. Contoh tanaman dipanaskan kembali pada suhu yang sama selama satu jam. Destruksi selesai bila keluar uap putih dan didapat ekstrak jernih. Kerjakan blanko.
d. Angkat tabung, dinginkan dan kemudian ekstrak diencerkan dengan aquades hingga tepat 50 ml. Ekstrak digunakan untuk pengukuran N dan P.
3. Pengukuran N dengan cara destilasi
a. 20 ml ekstrak contoh dipipet ke dalam labu didih. Tambahkan air bebas ion (aquades) sebanyak 100 ml.
b. Penampung NH3 yang dibebaskan yaitu erlenmeyer yang berisi 10 ml
asam borat 4% yang ditambah lima tetes indikator Conway dan dihubungkan dengan alat destilasi disiapkan untuk proses selanjutnya. c. Dengan gelas ukur, 20 ml NaOH 50 % di tambahkan ke dalam labu
didih yang berisi contoh dan secepatnya ditutup.
d. Kemudian didestilasi hingga volume penampung mencapai 50-75 ml. Destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N. Catat volume titrasi (ml) Untuk contoh (Vc) dan blanko (Vb).
Perhitungan:
Keterangan :
Vc,b = ml titar contoh dan blanko
100 = konversi ke %
N = normalitas larutan baku HCl 14 = bobot setara N
3.4.5.3. Analisis Kandungan Fosfor pada Tanaman
Penetapan unsur P pada tanaman menggunakan metode Pengabuan Basah: 1. Membuat larutan pereaksi:
a. Untuk destruksi: Asam sulfat pekat ( 95 – 97 % ) p.a. dan H2O2 pekat
(30 %) p.a.
b. Untuk destilasi: Larutan NaOH 50 %, HCl 0,1 N, Indikator Conway, Asam Borat 4 %
2. Membuat larutan untuk spektrofotometer a. Larutan Pb
NH4 Molybdat sebanyak 3,8 g dilarutkan dalam 300 ml air pada suhu
60o C, dinginkan. Kemudian 5 gr H3BO3 dilarutkan dalam 500 ml air
dan ditambahkan 75 ml HCl pekat. Larutan Molybdat ditambahkan dan diencerkan menjadi 1 liter.
b. Larutan Pc
3. Mengerjakan destruksi contoh
a. 0,5 g contoh tanaman ditimbang dan dimasukkan kedalam tabung digestion, tambahkan Asam Sulfat pekat 5 ml dan H2O2 pekat 2 ml.
b. Kemudian dipanaskan dalam blok digestion pada suhu 235oC selama satu jam. Angkat dan biarkan mendingin, tambahkan lagi 2 ml H2O2
pekat.
c. Contoh tanaman dipanaskan kembali pada suhu yang sama selama satu jam. Destruksi selesai bila keluar uap putih dan didapat ekstrak jernih. Kerjakan blanko.
d. Tabung diangkat, dinginkan dan kemudian ekstrak diencerkan dengan aquades hingga tepat 50 ml. Ekstrak digunakan untuk pengukuran N dan P.
4. Pengukuran P dengan spektofotometer
a. Masing-masing 1 ml ekstrak contoh dipipet dan dimasukkan dalam deret standar PO4 ke dalam tabung kimia.
b. Kemudian 4 ml air bebas ion ditambahkan dan dikocok (pengenceran 10x). Masing-masing 5 ml dipipet dan diekstrak encer contoh dan deret standar ke dalam tabung reaksi.
c. Kemudian ditambahkan 5 ml larutan Pb, dan lima tetes Pc. P dalam larutan diukur dengan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm.
Perhitungan:
Buat deret standar P 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm (dalam labu ukur 50 ml), larutan standar P adalah 50 ppm.
Keterangan :
ppm kurva = kadar contoh yang didapat dari kurva hubungan antara kadar deret standar dengan pembacaannya setelah di koreksi blanko. 100 = faktor konversi ke %
1000 = faktor konversi ke ppm fp = faktor pengenceran (10)
