TINJAUAN PUSTAKA
Taksonomi dan Morfologi
Handeuleum (Graptophyllum pictum L. Griff), merupakan tanaman asli Papua berbentuk perdu yang tumbuh lurus, tingginya dapat mencapai 1.5 - 8 m. Handeuleum ditemukan tumbuh di daerah Jawa mulai dari dataran rendah hingga ketinggian 1 250 m di atas permukaan laut (dpl), sering ditanam sebagai tanaman hias atau tanaman pagar, dan banyak digunakan sebagai tanda batas di perkebunan teh. Tanaman ini diperbanyak dengan cara stek (Heyne 1987).
Menurut United States Department of Agriculture (USDA) (2008), taksonomi handeuleum sebagai berikut:
Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Superdivisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Dicotyledonae Subkelas : Asteridae Ordo : Scrophulariales Family : Acanthaceae
Genus : Graptophyllum Nees
Spesies : Graptophyllum pictum (L.) Griff
Menurut Heyne (1987), handeuleum dikenal di luar negeri sebagai -Caricature plant (Inggris), Gertenschriftblatt (Jerman). Indonesia sendiri memiliki berbagai macam nama daerah: handeuleum, daun temen-temen (Sunda), daun putri (Ambon), temen (Bali), kabi-kabi (Ternate) dan dongo-dongo (Tidore). daerah Madura menyebutnya karoton dan karotong. Daerah Jawa mengenal daun ini dengan nama demung, tulak, dan wungu. Berdasarkan hasil eksplorasi dan observasi oleh Khumaida et al. (2008), diketahui bahwa masyarakat di desa Snaimboy Manokwari-Papua Barat menggunakan handeuleum sebagai obat tradisional, mereka menyebut handeuleum sebagai brendek, dimanfaatkan untuk mengatasi berak darah. Lebih lanjut hasil eksplorasi ini berhasil mengumpulkan
38 aksesi handeuleum yang tersebar di berbagai tempat di Indonesia, dimana 13 di antaranya memiliki kandungan bioaktif yang tinggi.
Handeuleum memiliki kulit dan daun berlendir, serta baunya kurang enak. Ciri-ciri batang adalah sebagai berikut: aerial, berkayu, silindris, tegak, warna ungu kehijauan, bagian dalam solid, permukaan licin, percabangan simpodial (batang utama tidak tampak jelas), arah cabang miring ke atas. Daunnya tunggal, tersusun berhadapan (folia oposita), warna ungu tua, panjang 15 - 25 cm, lebar 5 - 11 cm, helaian daun tipis tegar, bentuk bulat telur, ujung runcing, pangkal meruncing (acuminatus), tepi rata, pertulangan menyirip (pinnate), permukaan mengkilat (nitidus). Sedangkan bunganya majemuk, muncul dari ujung batang (terminalis). Buah: kotak sejati (capsula), lonjong, warna ungu kecoklatan, bentuk biji bulat-berwarna putih, dan akarnya tunggang. Keragaan tanaman handeuleum ditampilkan pada Gambar 2.
Gambar 2 Keragaan handeuleum. Tanaman utuh (kiri) dan bunga (kanan) aksesi Bogor.
Menurut BPPT (2008) handeuleum cocok tumbuh di daerah dataran rendah sampai ketinggian 1 250 meter di atas permukaan laut. Wibowo (2000)
menambahkan handeuleum mampu tumbuh pada ketinggian di bawah 800 meter dpl, dimana semakin tinggi dataran maka daun handeuleum akan
semakin berwarna ungu yang disebabkan oleh adanya peningkatan senyawa flavonoid yang dikandungnya. Kristina dan Mardaningsih (2008) menyebutkan
bahwa handeuleum dapat tumbuh di tempat terbuka, beriklim kering, dan lembab. Handeuleum umumnya dikembangbiakkan menggunakan stek batang karena buah dan biji sulit terbentuk (Djazuli & Fathan 2000).
Kandungan Kimia dan Manfaat
Graptophyllum pictum L. Griff telah lama dikenal sebagai tanaman obat, terutama sebagai obat wasir karena bersifat anti inflamasi, sehingga mampu mengurangi pembengkakan atau peradangan yang disebabkan oleh wasir, membantu proses melahirkan, serta dapat dipakai sebagai pelembut kulit. Tanaman ini juga dipakai untuk mengobati bisul, luka-luka, radang, dan melancarkan datang bulan.
Beberapa pustaka menyebutkan bahwa handeuleum mengandung metabolit sekunder alkaloid, tanin, saponin, flavonoid, glikosida, dan steroid. Isnawati dan Soediro (2003) mengemukakan bahwa handeuleum juga mengandung antosianin, leukoantosianin, tannin galat, asam protokatekuat, flavon, dan flavanol. Menurut Wahyuningtyas (2005) ekstrak handeuleum 40% dapat menghambat pembentukan plak pada gigi. Berdasarkan uji klinis pada kelinci menunjukkan bahwa infus handeuleum dengan kadar 1.56 - 100% mempunyai efek sebagai laksansia ringan, yaitu dengan menaikkan amplitude kontraksi otot polos jejunumnya (Sumastuti 2000). Mu’minah (2007) melaporkan bahwa ekstrak etanol pada daun handeuleum dalam serum darah dapat menurunkan kadar kolesterol LDL dan total lipid, selain itu juga dapat menurunkan berat badan mencit yang digunakan pada penelitian.
Kultur Kalus
Menurut Gamborg dan Shyluk (1981), kultur jaringan merupakan sejumlah teknik untuk menumbuhkan organ, jaringan, dan sel tanaman. Jaringan dapat dikulturkan secara aseptik dalam medium hara. Kemudahan dalam melakukan kultur tergantung pada jenis tanaman dan asal jaringan.
Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan, dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi akseptik yang kaya akan nutrisi serta Zat
Pengatur Tumbuh (ZPT) dalam wadah tertutup yang tembus cahaya agar bagian-bagian tersebut memperbanyak diri dan beregenerasi kembali menjadi tanaman lengkap. Teknik kultur jaringan merupakan salah satu metode perbanyakan secara in vitro. Awalnya teknik kultur jaringan ini dilakukan untuk membuktikan kebenaran teori totipotensi sel, lalu berkembang untuk penelitian di bidang fisiologi tanaman dan biokimia (Gunawan 1992). Totipotensi didefinisikan sebagai kemampuan dari sebuah sel untuk tumbuh dan berkembang bila tersedia lingkungan luar yang sesuai (Mantell et al. 1985).
Menurut George dan Sherrington (1984) ada 2 (dua) kemungkinan pertumbuhan tanaman secara in vitro yaitu pertumbuhan terorganisasi dan tidak terorganisasi. Pertumbuhan terorganisasi terjadi pada bagian-bagian tanaman (organ) seperti titik tumbuh (meristem) pucuk atau akar, daun yang baru/mulai muncul, kuncup bunga, dan buah-buah kecil yang dikulturkan. Pertumbuhan tidak terorganisasi jarang terjadi di alam, seringkali terjadi ketika potongan-potongan tanaman yang dikulturkan secara in vitro. Jaringan-jaringan yang kemudian terbentuk, kekurangan beberapa struktur khas yang dapat dikenali dan hanya berisi sejumlah sel berbeda jenis yang ditemukan pada tanaman lengkap yang selanjutnya disebut kalus. Regenerasi tanaman dapat dilakukan secara langsung atau melalui dua tahap yaitu media induksi kalus dan media induksi tunas adventif.
Kultur kalus dapat dihasilkan dari sejumlah besar organ tanaman yang beragam seperti akar, tunas, dan daun, atau tipe spesifik sel seperti endosperm dan polen. Untuk inisiasi kalus, secara aseptik eksplan ditransfer ke dalam media semi solid dan secara halus merendam eksplan ke dalam medium agar sehingga tercipta suatu kontak yang baik.
Media, jenis, dan konsentrasi ZPT adalah faktor utama dalam pembentukan kalus. Berdasarkan konsep yang dikemukakan oleh George dan Sherrington (1984), untuk induksi kalus tanaman dikotil diperlukan auksin dengan konsentrasi tinggi dan tetap memerlukan sitokinin pada konsentrasi sangat rendah. Induksi tunas diperlukan sitokinin dengan konsentrasi tinggi dan auksin pada konsentrasi rendah, ada juga induksi tunas dapat dihasilkan dengan penggunaan sitokinin tunggal tanpa auksin. Eksplan yang telah dipilih dan diisolasi dari
tanaman induk dikulturkan dalam media semi padat yang ditambahkan auksin dengan konsentrasi yang relatif cukup tinggi, dengan atau tanpa sitokinin. Kalus yang terbentuk selanjutnya dipindahkan ke media dengan auksin rendah untuk merangsang pembentukan struktur yang terorganisir. Tunas dan akar akan terbentuk dari bagian meristemastik, pada bagian permukaan dari kalus.
Faktor genotipe secara keseluruhan mempengaruhi pola pembentukan organ adventif dari kalus. Kemampuan membentuk tunas dan akar secara terpisah atau embriogenesis dari kalus berbeda antar famili maupun genus tanaman. Pembentukan embrio (embriogenesis) dan pengembangan dari embrio pada umumnya memerlukan taraf auksin yang berbeda. Embrio terbentuk dari sel meristemastik yang mempunyai isi sitoplasma yang penuh (tanpa vakuola). Hasil penelitian Sondahl dan Sharp pada tahun 1977 memaparkan bahwa eksplan daun Coffea arabica ditanam pada medium MS + Kinetin 22 µM (≈ 0.43 mg/L) + 2.4-D 2 µM (≈4.862 mg/L) dapat membentuk kalus dan pada medium MS + Kinetin 2.5 µM (≈0.538/L) + NAA 0.5 µM (≈0.09 mg/L) dapat membentuk tunas dan embrio genesis somatik (Ammirato 1982; Tisserat 1985).
Iradiasi Sinar Gamma
Iradiasi ialah pemberian sinar radio aktif pada suatu objek dengan dosis tertentu selama periode tertentu (Ismachin 2007). Salah satu sifat dari unsur radioaktif tersebut adalah kemampuannya untuk menghasilkan iradiasi pengion, yaitu iradiasi dengan energi tinggi yang dapat bereaksi dengan objek yang dikenai iradiasi dengan cara pengionan. Molekul objek akan mengalami ionisasi dan tereksitasi. Elektron yang terlepas akibat ionisasi akan ditangkap oleh molekul lain yang kemudian dapat membentuk radikal bebas yang sangat reaktif. Pembentukan radikal bebas tersebut akan mempengaruhi air yang merupakan komponen terbesar di dalam sel atau dalam sistem biologi. Hal tersebut akan sangat menentukan terhadap kerusakan di dalam sistem biologi.
Briggs dan Constantin (1977) melaporkan bahwa iradiasi elektromagnetik dapat menimbulkan keragaman genetik, karena pengaruh iradiasi dapat menimbulkan perubahan struktur gen, struktur kromosom ataupun jumlah kromosom. Mutagen dapat dikelompokkan menjadi mutagen fisika dan kimia.
Mutagen fisik yang sering digunakan adalah sinar ultraviolet dan beberapa tipe radiasi pengion seperti sinar x, sinar gamma, partikel alfa, partikel beta, proton, dan neutron.
Van Harten (1998) menyatakan bahwa sinar gamma merupakan mutagen yang paling banyak digunakan, hal ini dikarenakan sinar gamma memiliki panjang gelombang yang pendek (lebih pendek dari sinar X) sehingga memiliki level energi tertinggi. Level energi yang tinggi membuat sinar gamma mampu untuk menembus lebih ke dalam jaringan dibandingan dengan mutagen fisika lainnya, sehingga frekuensi mutasi yang terjadi menjadi lebih besar. Selain itu, sinar gamma tidak meninggalkan residu radioaktif seperti yang dihasilkan oleh partikel alpha dan beta. Lebih jauh van Harten (1998) menjelaskan bahwa sinar gamma dapat dihasilkan oleh radioisotop 137Cs atau 60Co. Cobalt-60 memiliki dua puncak spektrum energi radiasi pada 1.33 MeV dan 1.17 MeV, dengan masa paruh 5.27 tahun, dan cobalt menjadi hilang terhadap stanium yang stabil. Caesium-137 merupakan mono-energetic dengan puncak energi pada 0.66 MeV.
Menurut Crowder (1997) iradiasi dapat menyebabkan patahnya kromosom, dan pada dosis yang rendah dapat menyebabkan terjadinya delesi, semakin tinggi dosis akan menimbulkan duplikasi, inversi, dan translokasi. Ionisasi dari basa di dalam molekul DNA menyebabkan basa-basa tersebut salah berpasangan. Tiamin akan berpasangan dengan adenin dalam keadaan normal, namun apabila tiamin kehilangan satu proton akibat ionisasi maka tiamin akan berpasangan dengan guanin. Hal demikian akan menimbulkan terjadinya mutasi gen. Apabila iradiasi pengion memutuskan rantai kromosom pada tempat-tempat tertentu, maka dapat mengubah struktur kromosom. Apabila kerusakan terjadi pada benang-benang gelendong (spindle fibre) yang berfungsi menarik kromosom ke kutub-kutubnya pada fase anafase saat pembelahan mitosis, maka akan mengubah jumlah kromosom dan menyebabkan euploidi dan aneuploidi. Oleh karena itu ionisasi dapat menyebabkan terjadinya mutasi kromosom dan aberasi kromosom.
Mandal et al. (2000) menyatakan pemberian perlakuan iradiasi pada tunas krisan dengan dosis 1.5 krad, 2.0 krad, dan 2.5 krad telah didapatkan hasil bahwa dengan iradiasi 2.5 krad telah memperlihatkan hasil yang lebih baik dibandingkan
dengan perlakuan yang lain dimana 55% daun varigata dan 5% lainnya mengalami mutasi. Menurut Handayanti et al. (2001), tanaman mini varietas Romantica meilandina yang diiradiasi 1 krad sampai 10 krad bunga berubah dari
warna pink menjadi warna putih. Eksplan Prince meilandina yang diiradiasi 1 krad sampai 8 krad dari merah tua berubah menjadi merah agak muda.
Pemberian iradiasi sinar gamma dan kolkisin pada kultur in vitro menyebabkan terjadinya keragaman dalam bentuk dan ukuran daun, serta warna bunga dari tanaman Crossandra infundibuliformis var Danica (Hewawasam et al. 2004). Penelitian iradiasi sinar gamma pada kultur kalus nodular manggis yang dilakukan oleh Qosim et al. (2007) mengemukakan bahwa respon daya regenerasi kalus nodular menurun dan variabel waktu pembentukan tunas meningkat secara linier seiring dengan meningkatnya dosis iradiasi. Selain itu jaringan bunga karang dan jumlah berkas pembuluh dari regeneran mutan pada umumnya lebih tebal dan lebih banyak daripada regeneran kontrol yang tidak mendapat perlakuan sinar gamma.
Induksi Mutasi In Vivo dan In Vitro
Ibrahim (1999) menyatakan bahwa mutasi adalah perubahan genetik, dan merupakan sumber pokok dari semua keragaman genetik. Mutasi merupakan satu-satunya sumber pencipta keragaman pada tanaman yang pada tanaman yang steril dan tanaman apomiktik obligat. Poespodharsono (1996) menambahkan bahwa secara molekuler mutasi terjadi karena adanya perubahan urutan (sekuen) nukelotida DNA kromosom, yang mengakibatkan terjadinya perubahan pada protein yang dihasilkan.
Van Harten (1998) menyebutkan induksi mutasi sinar gamma dapat diterapkan pada materi tanaman in vivo dan in vitro. Micke dan Donini (1993) menyatakan bahwa bagian tanaman yang dapat dimutasi dengan cara diiradiasi adalah dengan biji dan tepung sari, dan untuk tanaman yang diperbanyak secara vegetatif bagian yang dapat dimutasi adalah umbi, stek stolon, dan rimpang. Micke dan Donini (1993) menyebutkan pada tanaman yang diperbanyak secara vegetatif, mutasi dapat terjadi pada sel-sel somatik, kimera sektoral yang mungkin terjadi akibat iradiasi pada tanaman yang diperbanyak secara vegetatif harus dapat
dihilangkan. Maluszynski et al. (1995) mengemukakan pada kondisi in vivo sulit untuk mengisolasi mutan dari kimera sektorial dan membutuhkan waktu yang lama, sedangkan kondisi in vitro mengisolasi mutan dari kimera dapat dilakukan dengan mudah dan membutuhkan waktu yang cepat. Van Harten (1998) menambahkan bahwa meski mutan utuh dapat diperoleh secara langsung dari kalus, akan tetapi kalus memiliki daya regenerasi yang rendah.
Chaudhari (1971) menyatakan bahwa pengaruh iradiasi pada tanaman yang diperbanyak secara vegetatif ada empat macam, yaitu: (1) perubahan genetik, (2) pertumbuhan terhambat, (3) perkembangan morfologi yang abnormal, dan (4) kematian tanaman.
Radiosensitivitas
Menurut van Harten (1998) radiosensitivitas adalah tingkat sensitifitas tanaman terhadap iradiasi. Radiosensitifitas adalah perhitungan relatif yang mengindikasikan kuantitas efek iradiasi pada objek yang diiradiasi (tanaman, bagian tanaman, perbedaan tahap pertumbuhan, tahap meiosis dan mitosis, tahap bibit muda dengan tanaman dewasa, atau fungsi molekuler yang spesifik). Sel yang aktif membelah lebih sensitif terhadap iradiasi bila dibandingkan dengan sel yang tidak aktif membelah. Radiosensitifitas dapat diukur dengan menentukan dosis iradiasi yang menghasilkan persentase tertentu dari sel yang bertahan hidup. Kriteria lain untuk mengukur radiosensitifitas adalah jumlah sel yang membelah, penundaan mitotik, penghambatan pertumbuhan, dan sterilitas dari polen. Seringkali ditemukan hubungan antara ukuran nukleus (atau ICV = Volume kromosom interfase) dengan radiosensitifitas, tapi hal ini tidak terdapat pada mayoritas spesies poliploidi.
Terdapat dua faktor utama yang mempengaruhi radiosensitivitas, yaitu: (1) faktor lingkungan, seperti oksigen, kandungan air, suhu, dan penyimpanan paska iradiasi; (2) faktor biologi, seperti volume inti, volume kromosom saat interfase, dan faktor genetik. Keragaman yang timbul akibat iradiasi mutasi fisik, sangat tergantung pada tingkat radiosensitivitas.
Secara visual tingkat sensitivitas ini dapat diamati dari respon yang diberikan tanaman baik dari sterilitas tanaman, morfologi, maupun Growth
Reduction 50 (GR50) (Akgun & Tosun 2004). GR50 ialah dosis yang menyebabkan penurunan pertumbuhan 50% dari populasi yang diiradiasi, pada umumnya mutasi yang diinginkan berada pada kisaran GR50.
Analisis Isozim
Menurut Taiz dan Zeiger (2002) isozim adalah suatu enzim yang terdiri dari beberapa molekul aktif yang mempunyai struktur kimia berbeda dan dikode oleh gen berbeda, akan tetapi mengkatalisis reaksi yang sama. Sastra (1996) menyatakan bahwa isozim terdiri atas rantai polipeptida, sehingga memperlihatkan sifat-sifat umum seperti protein. Strukturnya terdiri dari asam-asam amino yang mengandung gugus karboksil dan gugus amino. Asam amino akan terionisasi di dalam larutan, dan dapat bersifat asam atau basa (amfoter). Adanya perbedaan konstanta ionisasi (pK), bila diberi medan listrik akan menyebabkan asam amino bermigrasi menuju ke kutub yang berlawanan muatannya.
Keragaman tanaman dapat dilakukan secara morfologi, sitologi, biokimia, dan molekuler. Analisis morfologi paling umum dilakukan untuk mendeteksi keragaman, hanya saja analisis ini sangat dipengaruhi oleh lingkungan. Simpson dan Whiters (1986) menyatakan bahwa protein termasuk isozim merupakan produk primer ekspresi gen, karenanya keragaman protein atau isozim dapat dipakai untuk menduga keragaman genetik tanaman atau organisme yang lain. Molekul-molekul protein atau isozim dapat dipisahkan dengan teknik elektroforesis, setelah pewarnaan akan tampak pita-pita protein pada gel sehingga dapat ditelaah perbedaan dan persamaannya. Alel-alel kodominan umumnya mengontrol pola pita tersebut dan diwariskan sesuai dengan hukum mendel. Simpson dan Whiters (1986) mengemukakan bahwa sekuen-sekuen asam amino pada dasarnya ditentukan oleh sekuen nukleotida pada gen, maka analisis genetika yang berlandaskan isozim dapat digunakan sebagai pendekatan bagi analisis gen yang mengkodenya.
Menurut Azrai dan Kasim (2003) isozim memiliki kelebihan yaitu bersifat stabil, hal ini dikarenakan isozim tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan, lebih cepat dan akurat karena tidak menunggu tanaman sampai berproduksi. Wendel
dan Weeden (1989) menyebutkan bahwa bagian tanaman yang digunakan untuk analisis isozim adalah bagian vegetatif tanaman yang masih muda, yang biasanya mempunyai aktifitas enzim yang tinggi, sehingga akan mudah diamati. Aisyah (2006) mengemukakan bahwa aktivitas isozim yang dapat diuji pada tanaman sangat beragam karena masing-masing tanaman memiliki isozim utama. Peroksidase (PER) dan esterase (EST) banyak dijumpai pada tanaman. Peroksidase merupakan enzim tanaman yang terlibat dalam sintesis lignin, dan dijumpai juga pada vakuola tanaman. Boumann dan Klerk (1997) mengingatkan untuk mempertimbangkan adanya pengaruh fisiologi dan fase perkembangan tanaman terhadap keberadaan enzim, sehingga disarankan untuk menggunakan enzim yang bersifat stabil terhadap perubahan fisiologi maupun fase perkembangan tanaman. Contohnya enzim malat dehidrogenase (MDH), alkohol dehidrogenase (ADH), asam fosfatase (ACP), fosfoglukoisomerase (PGA), dan fosfoglukomutase (PGM).
INDUKSI KERAGAMAN PADA STEK PUCUK
HANDEULEUM (Graptophyllum pictum L. Griff) AKSESI
BOGOR MELALUI IRADIASI SINAR GAMMA
Abstrak
Salah satu cara untuk meningkatkan keragaman tanaman membiak vegetatif adalah dengan induksi mutasi dengan iradiasi sinar gamma pada stek pucuk. Penelitian ini bertujuan mengetahui pengaruh dosis iradiasi sinar gamma terhadap pertumbuhan, morfologi, anatomi daun, kandungan fitokimia, isozim, serta keragaman fenotipik stek pucuk handeuleum aksesi Bogor. Dosis sinar gamma yang digunakan adalah 0 Gy, 15 Gy, 30 Gy, 45 Gy, 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy. Hasil penelitian menunjukkan bahwa iradiasi sinar gamma mempengaruhi semua peubah pertumbuhan, morfologi, anatomi daun handeuleum, mempengaruhi kandungan fitokimia, aktifitas enzimatis, dan keragaman fenotipik pada beberapa perlakuan dosis iradiasi sinar gamma. Iradiasi sinar gamma menghasilkan GR50 pada peubah tinggi tanaman, jumlah daun, panjang daun, dan lebar daun. Dosis 15 Gy, 30 Gy, dan 45 Gy menghasilkan klorofil total, antosianin, dan karotenoid yang lebih besar dibandingkan perlakuan lain. Terdapat korelasi yang erat antara jumlah daun dengan panjang daun, lebar daun, dan antosianin; antosianin dengan indeks warna hijau relatif daun dan klorofil total; karotenoid dengan klorofil total; palisade dengan bunga karang. Terdapat perbedaan pola pita enzim peroksidase (PER), esterase (EST), dan asam fosfatase (ACP) bila dibandingkan dengan kontrol menunjukkan adanya perubahan genetik handeuleum yang diiradiasi. Iradiasi sinar gamma menimbulkan keragaman fenotipik pada semua peubah pertumbuhan, morfologi dan anatomi daun handeuleum kecuali pada peubah indeks stomata. Iradiasi sinar gamma dosis 45 Gy menghasilkan variasi dan jumlah mutan putatif yang paling banyak, masing-masing sebesar 9 (sembilan) variasi dan 10 mutan putatif.
Kata kunci: daun ungu, dosis iradiasi, isozim, keragaman fenotipik.
Abstract
One methode way to increase plant variability is to induce mutation by gamma ray irradiation. This research was conducted to study the effect of gamma ray irradiation dose to the growth, morphology, leaves anatomy, phytochemical content, isozymes, and phenotypic variability of handeuleum accession Bogor.
The gamma ray doses used were 0 Gy, 15 Gy, 30 Gy, 45 Gy, 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, and 105 Gy. The results showed that gamma-ray irradiation affected all
variables of plant growth, morphology and anatomy of handeuleum leaves, phytochemical content, enzymatic activity and phenotypic. Gamma irradiation produced GR50 on plant height, total of leaves, leaves lenght, and leaves width. The doses of 15 Gy, 30 Gy, and 45 Gy caused the increase of total chlorophyll, anthocyanins, and carotenoids. There was a close correlation between the number of leaves with other variables including leaf length, leaf width, and anthocyanin; anthocyanins with green leaf index and total chlorophyll; carotenoids to total
chlorophyll; palisade with sponge tissue. There were some differences in enzyme banding pattern of peroxidase (PER), esterase (EST), and acid phosphatase (ACP) indicating changes of irradiated handeuleum. Gamma ray irradiation caused phenotypic variability in all variables of plantgrowth, morphology and anatomy leaves of handeuleum.Gamma irradiation 45 Gy produced number of variation and putative mutant the most, 9 (nine) variation with 10 putative mutant respectively.
Key words: daun ungu, irradiation dose, isozyme, phenotypic variability
Pendahuluan
Perbaikan sifat genetik tanaman dapat dilakukan pemuliaan konvensional dan induksi mutasi menggunakan mutagen fisika dan kimia. Induksi mutasi dilakukan guna meningkatkan peluang terjadinya mutasi, dan seringkali diterapkan pada tanaman yang tidak dapat diperbaiki melalui persilangan. Menurut van Harten (1998) metode induksi mutasi banyak digunakan karena memiliki keuntungan dapat merubah satu karakter tanpa merubah seluruh susunan gen secara signifikan, selain itu kombinasi metode mutasi dengan pembiakan secara vegetatif dapat menurunkan resiko kehilangan karakter mutan akibat segregasi.
Handeuleum merupakan tanaman yang belum dibudidayakan secara khusus dan biasanya diperbanyak secara vegetatif yaitu dengan cara distek, hal ini dikarenakan handeuleum bijinya tidak berkembang dengan sempurna. Perbanyakan secara vegetatif menghasilkan tanaman yang seragam akan tetapi tingkat keragamannya sempit, keragaman pada tanaman dapat dilakukan dengan induksi mutasi. Menurut Broertjes dan van Harten (1998), sinar gamma sering digunakan sebagai mutagen untuk induksi mutasi karena merupakan radiasi elektromagnetik dengan panjang gelombang yang pendek, sehingga dapat menghasilkan radiasi elektromagnetik dengan tingkat energi yang tinggi. Hal ini menyebabkan daya tembus ke dalam jaringan sangat dalam, bisa mencapai beberapa sentimeter dan bersifat merusak jaringan yang dilewatinya.
Sinar gamma bereaksi dengan atom atau molekul untuk memproduksi radikal bebas dalam sel, contohnya: OH- dan H2O2. Radikal bebas ini dapat merusak atau memodifikasi komponen yang penting dari sel tanaman (DNA) dan telah dilaporkan menyebabkan efek yang berbeda secara morfologi, anatomi,
biokimia, dan fisiologi dari tanaman tergantung dari level iradiasi (Wi et al. 2007).
Khumaida et al. (2008) dalam penelitiannya menyebutkan dari 38 aksesi tanaman handeuleum yang diteliti menunjukkan karakter morfologi yang tidak berbeda nyata, sedangkan kandungan fitokimianya (alkaloid, saponin, tanin, flavonoid, steroid, triterpenoid, dan glikosida) memiliki nilai yang bervariasi. Sebanyak 13 aksesi yang memiliki kandungan fitokimia yang tinggi, di antaranya adalah aksesi Bogor, Kalimantan, dan Papua.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengetahui pengaruh dosis iradiasi sinar gamma terhadap pertumbuhan, morfologi, anatomi daun, kandungan fitokimia, karakter isozim, serta keragaman fenotipik stek pucuk handeuleum aksesi Bogor.
Hipotesis
Iradiasi sinar gamma dapat mengakibatkan perubahan terhadap pertumbuhan, morfologi, anatomi daun, kandungan fitokimia, serta dapat meningkatkan keragaman stek pucuk handeuleum aksesi Bogor.
Metodologi Penelitian Waktu dan Tempat
Percobaan dilakukan pada bulan Nopember 2009 hingga Juni 2010. Aplikasi iradiasi dilakukan di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi (PATIR) BATAN Pasar Jumat Jakarta. Pengamatan karakter pertumbuhan tanaman dan morfologi dilakukan di kebun percobaan Cikabayan, University Farm (UF), IPB. Pengujian fitokimia dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO), Bogor. Analisis kandungan pigmen dilakukan di Laboratorium Spektrofotometrik, Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB, sedangkan pengamatan karakter anatomi daun dilakukan di Laboratorium Microtechnique Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB. Analisis isozim
dilakukan di laboratorium Hayati, Pusat Studi Bioteknologi dan Sumberdaya Hayati IPB.
Metode Percobaan
Rancangan lingkungan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan 1 (satu) faktor yaitu dosis iradiasi sinar gamma yang terdiri atas 8
(delapan) taraf yaitu 0 Gy, 15 Gy, 30 Gy, 45 Gy, 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy. Setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan, dengan 1 (satu) stek pucuk untuk
setiap ulangan, sehingga secara keseluruhan terdapat 80 stek pucuk.
Model linier RAL adalah sebagai berikut: Yij = µ + αi + εij
Keterangan:
Yij : Nilai pengamatan perlakuan dosis iradiasi ke-i, dan ulangan ke-j µ : Rataan umum
αi : Pengaruh perlakuan dosis iradiasi ke-i
εijk : Pengaruh galat percobaan perlakuan dosis iradiasi ke-i ulangan ke-j. i : 1, 2, 3...8.
j : 1, 2, 3..10.
Persiapan Bahan Tanam
Tanaman yang digunakan berasal dari perbanyakan stek handeuleum aksesi Bogor yang mempunyai kandungan fitokimia yang tinggi (Khumaida et al. 2008). Stek dengan panjang 3 (tiga) ruas ditanam pada polibag dengan media tanam menggunakan tanah : kompos dengan perbandingan 2 : 1 (v/v). Stek pucuk yang sudah berakar dan memiliki daun baru dengan tinggi sekitar 15 cm digunakan sebagai bahan percobaan yang akan diiradiasi. Stek kemudian dicabut dengan hati-hati dari media, dibersihkan dari tanah, lalu akarnya dibungkus dengan aluminium foil. Stek diiradiasi menggunakan sinar gamma dari ionisasi Cobalt 60, memakai alat irradiator gamma chamber 4000A, tipe Irpasena buatan India.
Stek yang telah diiradiasi langsung ditanam pada media baru, ditumbuhkan di bawah kubung kecil selama kurang lebih dua bulan. Stek berumur dua bulan selanjutnya dipindah tanam ke polibag yang lebih besar berdiameter 15 cm dan dipelihara di lapang dengan naungan paranet 55%. Penyemprotan pestisida dilakukan untuk menghindari serangan hama dan penyakit. Selama perawatan tanaman disiram 2 (dua) kali sehari, dan diberi pupuk daun setiap satu minggu sekali, dan dipupuk dengan NPK sebulan sekali sebanyak 4 g/polibag dengan perbandingan komposisi N:P:K = 15:15:15.
Pengamatan
Karakter Pertumbuhan Tanaman dan Morfologi
Pengamatan dilakukan pada karakter yang diduga berkaitan dengan keragaman tanaman yang diinduksi oleh iradiasi sinar gamma, meliputi
1. Tinggi tanaman, diukur mulai dari permukaan media sampai pucuk dengan menggunakan penggaris.
2. Jumlah daun, dihitung jumlah semua daun yang terdapat pada tanaman.
3. Panjang dan lebar daun, sampel diambil dari daun kedua dari ujung, panjang daun diukur mulai dari pangkal sampai ujung daun, sedangkan lebar daun diukur pada area terlebar daun.
4. Indeks warna hijau relatif daun, diamati menggunakan klorofilmeter Minolta SPAD 502. Sebelum digunakan alat dikalibrasikan terlebih dahulu dengan standar warna hijau yang telah disertakan pada alat tersebut.
5. Warna daun, warna batang, dan tekstur daun, diukur berdasarkan nilai skoring. Skoring warna daun dan batang: 5=ungu, 3=ungu kehijauan, 1=hijau. Skoring tekstur daun: 3=lembut, 1=keras/kaku.
Karakter Anatomi Daun
Pengamatan karakter anatomi daun dilakukan pada irisan transversal dan paradermal menggunakan metode sediaan utuh menggunakan bahan segar, meliputi:
1. Jumlah sel epidermis dan stomata, diamati jumlahnya di bawah mikroskop dengan pembesaran 400x dengan luas bidang pandang 0.038 mm2.
2. Kerapatan stomata didapat dari perhitungan berikut: Kerapatan stomata = Σ Stomata / Luas bidang pandang ( mm2).
3. Indeks stomata didapat dari perhitungan berikut: Indeks stomata = (Σ Stomata / (Σ Stomata + Σ Sel epidermis)) x 100.
4. Tebal daun, tebal kutikula, tebal epidermis atas, panjang palisade, tebal bunga karang, dan tebal epidermis bawah. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop digital molekuler.
Analisis Kandungan Fitokimia Daun
Analisis dilakukan terhadap kandungan fitokimia daun handeuleum untuk kandungan alkaloid, saponin, triterpenoid, steroid, flavonoid, tanin, dan glikosida; serta pada kandungan pigmen seperti klorofil total, karotenoid total, dan antosianin total.
Tabel 1 Kriteria penilaian kandungan metabolit sekunder secara kualitatif dengan uji fitokimia
Senyawa Dasar Penilaian Penilaian
Alkaloid Jumlah pereaksi 1 tetes
4+ 2 tetes 3+ 3 tetes 2+ 4 tetes 1 + Steroid Perubahan warna biru/hijau 1 tetes
4+ 2 tetes 3+ 3 tetes 2+ 4 tetes 1 + Triterpenoid Perubahan warna merah/ungu Tua
3+
Sedang 2+
Muda 1+ Saponin Pembentukan lapisan busa 3 cm
3+
2 cm 2+
1 cm 1+
Flavonoid Jumlah pereaksi 1 tetes
4+ 2 tetes 3+ 3 tetes 2+ 4 tetes 1 +
Tanin Jumlah pereaksi 1 tetes
4+ 2 tetes 3+ 3 tetes 2+ 4 tetes 1 + Keterangan : 1+ = positif lemah, 2+ = positif, 3+ = positif kuat, 4+ = positif kuat sekali
(Mualim 2009).
Analisis kandungan alkaloid, saponin, triterpenoid, steroid, tanin, dan glikosida dilakukan secara kualitatif (Harborne 2000) dengan data berupa skoring yang berdasarkan standar laboratorium pengujian Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO). Kandungan metabolit sekunder dalam sampel diketahui berdasarkan jumlah pereaksi (reagen), pembentukan warna, dan busa
yang terbentuk (Tabel 1). Kegiatan analisis kandungan fitokimia daun dapat dilihat pada Lampiran 1.
Analisis kandungan pigmen seperti klorofil total, karotenoid total, dan antosianin total dilakukan dengan metode Sims dan Gamon (2002), menggunakan alat spektrofotometer yang teknis pelaksanaannya dapat dilihat pada Lampiran 2. Setiap pigmen diidentifikasi konsentrasinya pada panjang gelombang yang berbeda-beda, dimana panjang gelombang 663 nm untuk klorofil a, 647 nm untuk klorofil b, 537 nm untuk antosianin, dan 470 nm untuk karotenoid. Data kemudian dibaca menggunakan UV spektrofotometer, dan hasilnya dikonversi ke dalam satuan mol/m2 dengan tahapan perhitungan sebagai berikut:
Antosianin = 0.01373*A537 – 0.00697*A647 – 0.002228*A663 Klorofil a = 0.01373*A663 – 0.000897*A537 – 0.003046*A663 Klorofil b = 0.02405*A647 – 0.004305*A537 – 0.005507*A663 Klorofil total dapat dihitung dengan persamaan berikut:
Klorofil total 7.15*A633 – 18.71*A647
Karotenoid = (A470 – (17.1*(Chl a + Chl b) – 9.479*antosianin))/119.26 Keterangan: A(x) merupakan data hasil pembacaan pada panjang gelombang x. Konsentrasi pigmen per satuan luas dikonversi menggunakan perhitungan sebagai berikut:
Pigmen/area = (pigmen*6/1000)/(Luas area daun total dalam m2)
Analisis Isozim
Kegiatan analisis isozim terdiri atas beberapa tahapan, cara penyiapan bahan untuk analisis bahan dapat dilihat pada Lampiran 3. Interpretasi pola pita isozim dilakukan dengan cara meletakkan gel di atas plastik bening kemudian diletakkan di atas lampu pengamatan untuk diambil data dan difoto. Pola pita isozim yang tampak digambar pada plastik transparan, hasil foto diamati dan diukur jarak pergerakan pita dari titik awal. Hasil pengukuran jarak pergerakan ditentukan pola pada Rf (relative electrophoresis mobility) dengan perhitungan (Sastrosumarjo et al. 2006).
Rf = Jarak pergerakan pita dari tempat awal Jarak pergerakan warna pelacak dari awal
Analisis Data
Data pertumbuhan, morfologi dan anatomi daun diuji menggunakan analisis ragam (uji F) pada taraf nyata (α) 1% dan 5% dengan menggunakan program SAS. Apabila hasil uji nyata, dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan (Duncan’s Multiple Range Test-DMRT). Nilai Growth Reduction 50 (GR50) didapatkan dengan menggunakan program curve-fit, yaitu suatu program analisis statistik yang dapat digunakan untuk mencari model persamaan terbaik terhadap persentase penurunan pertumbuhan dari suatu populasi (Aisyah 2006). Uji korelasi antar peubah dilakukan berdasarkan persamaan Pearson. Analisis perbandingan nilai varian antar populasi dengan uji F. Keragaman fenotipik (σ2f) dihitung menurut Steel dan Torrie (1995): σ2f=∑ X2i–(∑ Xi )2/(n-1). Standar deviasi ragam fenotipik (Sdσ2f) dihitung menurut Anderson dan Brancot (1952) dalam Darajat (1987): Sdσ2f = √σ2f. Kriteria penilaian terhadap luas atau sempit keragaman fenotipik: Apabila σ2f ≥ 2* Sdσ2f Æ keragaman fenotipik luas
Apabila σ2f < 2* Sdσ2f Æ keragaman fenotipik sempit. Keterangan: σ2f = ragam fenotipik; Xi = nilai rata-rata ke-i; n = jumlah yang diuji; Sdσ2f = standar deviasi keragaman fenotipik.
Hasil dan Pembahasan Morfologi Tanaman
Pengamatan terhadap karakter morfologi tanaman dapat mendeteksi pertumbuhan dari tanaman. Penelitian ini menggunakan karakter pertumbuhan (tinggi tanaman, jumlah daun, panjang daun, dan lebar daun) dan karakter morfologi (warna daun, tekstur daun, dan warna batang) sebagai peubah untuk melihat perubahan pertumbuhan tanaman akibat perlakuan dengan iradiasi sinar gamma.
Berdasarkan pengamatan terhadap karakter-karakter tersebut di atas terlihat bahwa terdapat kecenderungan pengelompokkan tanaman hasil iradiasi berdasarkan dosis iradiasi menjadi dua kelompok. Tanaman yang mendapat dosis iradiasi 15 Gy, 30 Gy, dan 45 Gy pada umumnya pertumbuhannya normal sama dengan tananaman kontrol (0 Gy) dengan daun yang berwarna ungu, sedangkan tanaman yang mendapat iradiasi dosis 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy dan 105 Gy pada
umumnya pertumbuhannya terhambat, tidak menghasilkan tunas yang baru, dan daun tetap berwarna hijau.
Gambar 2 Bentuk daun handeuleum pada berbagai dosis iradiasi; (a) ovate, (b) obovate, (c) lancoleate, (d) kotrol (0 Gy), (e) 15 Gy, (f) 30 Gy, (g) 45 Gy, (h) 60 Gy, (i) 75 Gy, (j) 90 Gy, (k) 105 Gy.
Gambar 3 Keragaan daun handeuleum aksesi Bogor tanpa dan yang diiradiasi dengan berbagai dosis sinar gamma; ovate (a), obovate (b), lancoleate (c), kontrol (0 Gy) (d), 15 Gy (e), 30 Gy (f), 45 Gy (g), 60 Gy (h), 75 Gy (i), 90 Gy (j), dan 105 Gy (k).
Awal-awal pertumbuhan (3 MST, 4 MST) pada tanaman yang diiradiasi terbentuk daun-daun baru yang mengalami perubahan baik dari segi bentuk,
(a) (b) (c)
(d) (e) (f) (g)
(h) (i) (j) (k)
warna serta tekstur yang lebih tebal, meskipun bisa dikatakan bahwa respon yang timbul bersifat individual. Morfologi pada tanaman kontrol pada umumnya adalah ovate dan sebagian kecil lanceolate. Sedangkan pada tanaman yang diiradiasi terdapat penambahan bentuk elliptical selain kedua bentuk di atas.
Handeuleum pada stadia awal pertumbuhan umumnya memiliki warna daun hijau muda dan ketika beranjak dewasa warna daun berubah menjadi berwarna ungu merah kecoklatan. Tanaman yang diiradiasi sinar gamma dosis 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy, warna daunnya tetap hijau sampai daun tersebut mati. Seterusnya daun-daun baru yang terbentuk kembali normal. Variasi bentuk dan warna daun terbanyak terdapat pada handeuleum yang diiradiasi sinar gamma 45 Gy, yaitu sebanyak 9 (sembilan) variasi, dengan jumlah tanaman mutan putatif yang terbentuk sebanyak 11 tanaman.
Gambar 4 Keragaan tanaman handeuleum pada berbagai perlakuan iradiasi sinar gamma: kontrol (0 Gy) (a), 15 Gy (b), 30 Gy (c), 45 Gy (d), 60 Gy (e), 75 Gy (f), 90 Gy (g), dan 105 Gy (h). Terlihat bahwa daun pada perlakuan 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy memiliki warna yang berbeda dengan kontrol.
(h) (g) (f) (e) (d) (c) (b) (a)
Bentuk morfologi dan warna daun serta keragaan tanaman pada penelitian ini disajikan pada Gambar 3 dan 4. Berdasarkan analisis ragam, Fhitung sumber variasi dosis iradiasi (perlakuan) pada semua peubah yang diamati menunjukkan berbeda nyata, yang berarti bahwa dosis iradiasi berpengaruh terhadap peubah-peubah pengamatan.
Hal yang sama dijumpai pada penelitian Datta et al. (2005), dikatakan bahwa mutasi somatik pada warna bunga dan bentuk floret dideteksi pada populasi tanaman yang diberi perlakuan dengan sinar gamma. Wi et al. (2007) menunjukkan bahwa gejala awal tanaman labu yang diiradiasi oleh sinar gamma
tingkat tinggi (1 kGy) adalah daun yang menjadi keriting dan menguning (data tidak ditunjukkan), keduanya merupakan indikasi dari terjadinya
ketidakseimbangan zat pengatur tumbuh pada tanaman. Penelitian yang dilakukan Badignnavar dan Murty (2007), menunjukkan bahwa warna daun tanaman kacang tanah yang diberi iradiasi sinar gamma berubah menjadi hijau dan penampilan tanaman secara keseluruhan menjadi normal kembali setelah 80 HST. Mutan selalu tersegregasi ke dalam mutan dan tanaman tetua dengan frekuensi yang lebih tinggi untuk tipe tanaman tetua bila dibandingkan dengan tanaman mutan.
Menurut Micke dan Donini (1993), kerusakan pada struktur genetik akibat mutasi dapat berubah normal kembali (diplontic atau haplontic selection), hal ini dikarenakan sel-sel yang normal pertumbuhannya mengalahkan sel-sel yang termutasi. Bahkan terkadang terjadi mutasi balik, yaitu mutan yang sudah terekspresi dapat kembali menjadi fenotip tetuanya pada generasi berikutnya. Menurut Wi et al. (2007), tanaman memiliki sistem perlindungan alami terhadap kerusakan oksidatif yaitu salah satunya dengan cara mengaktifkan perlindungan enzimatik endogen, seperti: peroksidase (POD), superoksida dismutase (SOD), dan katalase (CAT), yang aktif selama tanaman mengalami luka.
Growth Reduction 50 (GR50)
Sensitivitas iradiasi dapat diketahui dengan Growth Reduction 50 (GR50) (Akgun & Tosun 2004). Pertumbuhan tanaman kontrol didefinisikan pada GR100, sedangkan GR50 didefinisikan sebagai penurunan 50% dari pertumbuhan tanaman kontrol. Penelitian ini menghitung nilai GR50 untuk peubah pertumbuhan tinggi
tanaman, jumlah daun, panjang daun, dan lebar daun. GR50 dihitung pada akhir pengamatan, yaitu pada minggu ke-10 setelah tanam.
Gambar 5 Pengaruh dosis iradiasi sinar gamma terhadap GR50 tinggi tanaman handeuleum aksesi Bogor.
Nilai koefisien determinasi (R2) persamaan ini adalah sebesar 0.998, hal ini menunjukkan persamaan yang digunakan sangat sesuai (andal) (Gambar 5). Berdasarkan analisis curve fit di atas diketahui GR50 peubah tinggi tanaman diperoleh pada dosis 42 Gy.
Gambar 6 menunjukkan hubungan persentase penurunan jumlah daun dengan dosis iradiasi sinar gamma, dan dapat diperoleh menggunakan persamaan regresi Sinusodial Fit, yaitu Y = 55.48 + 58.59 cos (0.03 X + 0.72), dimana Y adalah persentase penurunan jumlah daun, dan X adalah dosis iradiasi.
Gambar 6 Pengaruh dosis iradiasi sinar gamma terhadap GR50 jumlah daun handeuleum aksesi Bogor.
S = 3.11144608 r = 0.99838653
Dosis Iradiasi (Gy)
P er sen tase P enu ru nan ( % ) 0.0 19.3 38.5 57.8 77.0 96.3 115.5 8.70 25.30 41.90 58.50 75.10 91.70 108.3 0 S = 8.97040010 r = 0.98515682
Dosis Iradiasi (Gy)
P e rs e n tase P e nur un an (% ) 0.0 19.3 38.5 57.8 77.0 96.3 115.5 0.30 18.53 36.77 55.00 73.23 91.47 109.7 0
Nilai koefisien determinasi (R) persamaan ini adalah sebesar 0.985, hal ini menunjukkan persamaan yang digunakan sangat sesuai (andal). Berdasarkan analisis curve fit di atas diketahui GR50 diperoleh pada dosis iradiasi 33 Gy.
Fungsi matematika yang membantu mengetahui dosis yang mengakibatkan reduksi panjang daun handeuleum sebesar 50% adalah Polynomial Fit yang dirumuskan dalam persamaan Y = 96.88 – 2.19 X + 0.04 X2 – 0.0002 X3, dimana Y adalah persentase penurunan panjang daun, dan X adalah dosis iradiasi.
Gambar 7 Pengaruh dosis iradiasi sinar gamma terhadap GR50 panjang daun handeuleum aksesi Bogor.
Nilai koefisien determinasi (R2) persamaan ini adalah sebesar 0.942, hal ini menunjukkan persamaan yang digunakan sangat sesuai (andal) (Gambar 7). Berdasarkan analisis curve fit di atas diketahui nilai GR50 peubah panjang daun diperoleh pada dosis 113 Gy.
Gambar 8 Pengaruh dosis iradiasi sinar gamma terhadap GR50 lebar daun handeuleum aksesi Bogor.
S = 6.31834921 r = 0.94204873
Dosis Iradiasi (Gy)
P e rs e n ta s e Pe nu ru na n (% ) 0.0 19.3 38.5 57.8 77.0 96.3 115.5 50.50 59.50 68.50 77.50 86.50 95.50 104.5 0 S = 4.41575789 r = 0.96092842
Dosis Iradiasi (Gy)
P e rs e n tase P e n u run an ( % ) 0.0 19.3 38.5 57.8 77.0 96.3 115.5 58.20 65.80 73.40 81.00 88.60 96.20 103.80
Hubungan persentase penurunan lebar daun dengan dosis iradiasi sinar gamma dapat menggunakan persamaan Polynomial Fit Y = 97.79 – 1.86 X + 0.03 X2 – 0.0002 X3, dimana Y adalah persentase penurunan jumlah daun, dan X adalah dosis iradiasi. Nilai koefisien determinasi (R2) persamaan ini adalah sebesar 0.961, hal ini menunjukkan persamaan yang digunakan sangat sesuai (andal) (Gambar 8). Berdasarkan analisis curve fit di atas didapat GR50 lebar daun adalah sebesar 122 Gy.
Menurut Ahnstroem (1977), morfologi tanaman seperti batang tanaman yang berkayu atau sukulen dapat mempengaruhi tingkat radiosensitivitas, karena berhubungan dengan ketahanan fisik sel saat menerima iradiasi sinar gamma. Selain itu, radiosensitivitas juga dipengaruhi oleh faktor genetika dan lingkungan seperti oksigen, kadar air, penyimpanan paska-iradiasi, dan suhu.
Tinggi Tanaman, Jumlah Daun, Panjang Daun dan Lebar Daun.
Berdasarkan hasil analisis ragam diketahui iradiasi sinar gamma berpengaruh sangat nyata terhadap peubah tinggi tanaman, jumlah daun, panjang daun, dan lebar daun (Tabel 2). Peubah ini umumnya nilainya semakin kecil seiring dengan bertambahnya dosis iradiasi sinar gamma.
Hasil yang disajikan pada Tabel 2 memperlihatkan bahwa tinggi tanaman paling tinggi diperoleh pada perlakuan kontrol tanpa iradiasi sinar gamma (0 Gy) yaitu sebesar 83 cm, tidak berbeda nyata dengan perlakuan iradiasi sinar gamma 15 Gy yang menghasilkan tinggi 78.7 cm. Tinggi tanaman paling rendah diperoleh pada perlakuan 105 Gy sebesar 14.1 cm (tereduksi sebesar 83.0%), tidak berbeda nyata dengan perlakuan 60 Gy, 75 Gy, dan 90 Gy yang masing-masing menghasilkan tanaman dengan tinggi berturut-turut sebesar 16.2 cm, 16.1 cm, dan 15.9 cm dimana masing-masing perlakuan mengalami tinggi tanaman tereduksi secara berturut-turut sebesar 80.5%, 80.6%, dan 80.8%. Dosis iradiasi sinar gamma yang semakin tinggi menyebabkan tinggi tanaman handeuleum semakin pendek (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa sel-sel meristem pucuk dari tanaman yang diiradiasi dengan dosis yang tinggi mengalami kerusakan.
Tabel 2 Nilai rata-rata tinggi tanaman, jumlah daun, panjang daun, dan lebar daun handeuleum aksesi Bogor pada berbagai perlakuan dosis iradiasi sinar gamma pada 10 MST
Dosis Iradiasi (Gy) Peubah Tinggi Tanaman (cm) Jumlah Dauna) (helai) Panjang Daun (cm) Lebar Daun (cm) 0 83.0 ± 4.7 a 106.3 ± 12.6 a 19.7 ± 1.7 a 9.2 ± 0.9 a 15 78.7 ± 9.3 a 78.3 ± 14.1 b 12.6 ± 1.4 bc 6.5 ± 0.5 b 30 63.4 ± 8.0 b 71.0 ± 12.7 b 13.3 ± 1.9 b 6.5 ± 1.0 b 45 37.8 ± 8.1 c 36.5 ± 19.1 c 10.9 ± 0.6 d 5.7 ± 0.9 b 60 16.2 ± 2.1 d 3.8 ± 1.0 d 12.3 ± 0.8 bc 6.1 ± 0.8 b 75 16.1 ± 2.0 d 3.4 ± 1.3 d 12.0 ± 1.2 bcd 6.1 ± 0.7 b 90 15.9 ± 1.7 d 3.3 ± 1.2 d 12.4 ± 0.6 bc 6.3 ± 0.3 b 105 14.1 ± 2.0 d 3.0 ± 2.0 d 11.5 ± 1.5 cd 6.0 ± 0.8 b
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom peubah yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%. Nilai ± yang disajikan adalah standar deviasi. a) Data merupakan hasil transformasi dengan rumus (√X+0.5)
Penelitian Kon et al. (2007) menyebutkan bahwa semakin tinggi dosis radiasi sinar gamma yang diberikan, tinggi tanaman long bean semakin tereduksi bila dibandingkan dengan tanaman kontrol, dimana penurunan paling tinggi adalah pada dosis 800 Gy, yang merupakan dosis perlakuan paling tinggi. Menurut Fauza et al. (2005) pada bibit tanaman manggis yang bijinya diberi perlakuan sinar gamma dosis 0 krad, 1 krad, 2 krad, dan 3 krad, terdapat kecenderungan terjadi penurunan tinggi bibit tanaman manggis dengan semakin tingginya dosis iradiasi sinar gamma yang diberikan.
Hasil pada Tabel 2 menunjukkan bahwa tanaman kontrol (0 Gy) menghasilkan rata-rata jumlah daun paling banyak yaitu sebanyak 106.3 helai, sedangkan perlakuan iradiasi sinar gamma dosis 105 Gy menghasilkan rata-rata jumlah daun paling sedikit yaitu sebanyak 3.0 helai, mengalami penurunan sebesar 97.2%. Hasil ini tidak berbeda nyata dengan perlakuan iradiasi sinar gamma dosis 60 Gy, 75 Gy, dan 90 Gy yang berturut-turut menghasilkan daun sebanyak 3.8, 3.4, 3.3 helai. Perlakuan sinar gamma dosis 60 Gy mengalami penurunan sebesar 96,4%, dosis 75 Gy sebesar 96.8%, sedangkan dosis 90 Gy sebesar 96.9% bila dibandingkan dengan tanaman kontrol. Tanaman yang
mendapat perlakuan iradiasi sinar gamma dengan dosis 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy, memiliki jumlah daun yang sedikit bila dibandingkan dengan kontrol. Tunas yang muncul pada tanaman yang mendapat dosis iradiasi besar pertumbuhannya sangat lambat dan tidak menghasilkan tunas baru, kecuali untuk perlakuan 60 Gy.
Penelitian Badignnavar dan Murty (2007) mengenai kacang tanah menyatakan bahwa semakin besar dosis iradiasi yang digunakan mengakibatkan tinggi dan jumlah daun tanaman kacang semakin berkurang. Kendarini (2006) menunjukkan bahwa penambahan jumlah daun krisan yang diiradiasi dengan sinar gamma tidak linier dengan penambahan dosis sinar gamma. Krisan kultivar “Puma White” menghasilkan jumlah daun lebih banyak saat dipapar pada sinar
gamma dosis 15 Gy dibandingkan dengan tanaman yang dipapar pada dosis 10 Gy, sedangkan pada tanaman yang dipapar pada dosis 20 Gy, jumlah daunnya
kembali menurun. Pellegrini et al. (2000) mengamati bahwa pada tanaman seledri setelah diberi perlakuan dengan sinar gamma tidak membentuk primordia daun baru.
Berdasarkan hasil yang disajikan pada Tabel 2 terlihat bahwa perlakuan iradiasi sinar gamma 0 Gy menghasilkan panjang dan lebar daun paling besar dibandingkan dengan perlakuan lain, yaitu berturut-turut sebesar 19.1 cm dan 9.2 cm. Panjang dan lebar daun paling kecil dihasilkan oleh iradiasi sinar gamma dosis 105 Gy, yaitu sebesar 11.5 cm dan 6.0 cm. Panjang daun pada perlakuan 105 Gy mengalami penurunan sebesar 39.8%, sedangkan pada lebar daun sebesar 34.8%.
Terhambatnya pertumbuhan menyebabkan daun yang diiradiasi memiliki panjang dan lebar daun yang lebih kecil dibandingkan dengan kontrol, seperti yang dialami oleh bibit tanaman manggis (Widiastuti 2010). Semakin besar dosis iradiasi yang diberikan (0 Gy, 20 Gy, dan 25 Gy) ukuran daun menjadi semakin kecil. Panjang dan lebar daun tanaman anyelir yang diiradiasi tidak selamanya lebih kecil bila dibandingkan dengan kontrol, beberapa genotipe yang diiradiasi memiliki ukuran daun yang lebih besar bila dibandingkan dengan tanaman kontrol (Aisyah 2006).
Tinggi tanaman, jumlah daun, panjang daun, dan lebar daun pada tanaman yang diiradiasi lebih kecil bila dibandingkan dengan kontrol (0 Gy) disebabkan oleh kerusakan pada jaringan meristem tanaman. Iradiasi sinar gamma dengan dosis yang tinggi, 100 - 500 Gy, menyebabkan pertumbuhan tanaman terhambat, degradasi klorofil, aberasi morfologi pada tanaman Nicotiana (Wada et al. 1998). dan menghentikan mitosis pada jaringan meristematik.
Menurut Kim et al. (2004); Kova´cs dan Keresztes (2002); Wi et al. (2005) dalam Wi et al. (2007), sinar gamma bereaksi dengan atom atau molekul untuk memproduksi radikal bebas (H2O2) yang terdapat dalam sel. Radikal bebas ini dapat merusak atau memodifikasi komponen yang penting dari sel tanaman, yang menyebabkan perubahan secara morfologi, anatomi, biokimia, dan fisiologi dari tanaman tergantung dari level iradiasi. Efek ini termasuk perubahan dalam struktur seluler tanaman dan metabolisme, pembesaran dari membran tilakoid, perubahan dalam fotosintesis, modulasi dari sistem antioksidatif, dan akumulasi dari senyawa fenolik. Dosis iradiasi yang tinggi telah terbukti dapat menyebabkan menginduksi perubahan fisiologi dan dapat merusak komponen seluler makromolekuler seperti dinding sel, membran, dan DNA.
Wi et al. (2007) dalam penelitiannya menjelaskan bahwa terjadi peningkatan intensitas penumpukan cerium perhydroxide, yang merupakan marker penumpukan H2O2, pada membran plasma dan dinding sel jaringan (petiole, kotiledon, hipokotil, terutama pada daun) tanaman labu yang diiradiasi dibandingkan dengan kontrol. Akumulasi dan lokalisasi dari H2O2 dan peroksida lebih tinggi pada sel parenkima dibandingkan dengan yang terdapat pada pembuluh, sehingga diperkirakan jaringan pembuluh lebih sensitif dibandingkan dengan sel parenkima. Rusaknya jaringan pembuluh menyebabkan terganggunya transportasi asimilat yang dihasilkan oleh daun ke seluruh jaringan tanaman, sehingga mengakibatkan terjadinya penghambatan pertumbuhan. Lebih lanjut dikatakan bahwa peroksida merupakan salah satu enzim antioksidan yang berperan penting dalam mendetoksifikasi H2O2 dalam sel, sehingga dapat melindungi komponen seluler seperti protein dan lemak melawan oksidasi. Peroksida juga dibutuhkan terutama untuk banyak fungsi seluler seperti
lignifikasi, suberisasi, pemanjangan sel, pengaturan biosintesis dinding sel, dan plasticity.
Nagata et al. (2005) menyebutkan bahwa iradiasi akut dapat mengaktifkan atau menghambat satu set gen. Gen-gen ini terkait dengan asam nukleat (misal perbaikan DNA, penggabungan DNA, atau metabolisme RNA) dan terlibat pada respron stress oksidatif (misal peroksidase, sitokrom P450, glutation S-transferase), atau sinyal transduksi. Pernyataan ini didukung oleh penelitian yang dilakukan oleh Kim et al. (2009) yang mengidentifikasi 2165 gen yang terinduksi oleh sinar gamma dan 1735 gen tertekan, dan dari 345 ekspresi gen yang diteliti, gen yang mengatur respon terhadap stres lingkungan jumlahnya meningkat, sedangkan gen yang mengatur respon pertumbuhan jumlahnya tertekan.
Kovalchuck et al. (2007) memaparkan bahwa pada iradiasi sinar gamma kronik, gen auksin adalah hampir satu-satunya gen hormonal yang terlibat pada saat tanaman dipapar iradiasi sinar gamma. Menurut Taiz dan Zeiger (2002), auksin adalah hormon yang mengatur bermacam-macam proses perkembangan, seperti perpanjangan batang, dominansi apikal, inisiasi akar, perkembangan buah, dan orientasi atau pertumbuhan yang terorientasi. Hal ini menjadi salah satu sebab yang menyebabkan terjadi penghambatan pertumbuhan tinggi tanaman.
Penelitian yang dilakukan oleh Momiyama et al. (1999) pada koleoptil jagung menyebutkan bahwa jumlah IAA endogen koleoptil yang diberi perlakuan 300 dan 3000 Gy berubah hanya setelah 0 jam iradiasi. Jumlah IAA menurun pada 2 jam pertama pada iradiasi dosis 300 Gy, kemudian secara perlahan meningkat dan mencapai level yang sama dengan kontrol (6 jam setelah iradiasi). Hal ini kontras pada penurunan yang teramati pada dosis 3000 Gy. Penelitian tentang IAA teramati dari terjadinya penghambatan pemanjangan koleoptil jagung yang meningkat seiring dengan peningkatan dosis iradiasi (25 Gy, 300 Gy, 1000 Gy), dan terhenti sama sekali pada dosis 3000 Gy. Akan tetapi pada dosis yang lebih rendah dari 1000 Gy kerusakannya sementara dan dapat diperbaiki.
Warna Daun, Tekstur Daun, Warna Batang, dan Indeks Warna Hijau Relatif Daun
Hasil pengamatan morfologi kualitatif menunjukkan bahwa warna daun, tekstur daun, warna batang, dan indeks warna hijau relatif daun secara sangat nyata dipengaruhi oleh perlakuan iradiasi sinar gamma. Warna daun handeuleum pada perlakuan iradiasi sinar gamma 15 Gy sama dengan tanaman kontrol menunjukkan nilai skoring 5, tidak berbeda nyata dengan perlakuan sinar gamma 30 Gy dan 45 Gy. Perlakuan 105 Gy menghasilkan nilai skoring 1, hasil ini tidak berbeda nyata dengan perlakuan 75 Gy dan 90 Gy. Semakin kecil nilai skoring menunjukkan bahwa warna daun handeuleum berubah atau berbeda dengan warna daun handeuleum pada umumnya. Warna daun handeuleum biasanya berwarna ungu, sedangkan tanaman yang mendapat perlakuan iradiasi sinar gamma daunnya berwarna hijau, dan hijau keunguan.
Tabel 3 Nilai rata-rata warna daun, tekstur daun, warna batang, dan indeks warna hijau relatif daun handeuleum aksesi Bogor pada berbagai perlakuan dosis iradiasi sinar gamma pada 10 MST
Dosis Iradiasi (Gy) Peubah Warnaa) Daun Teksturb) Daun Warna a) Batang Indeks Warnac) Hijau Relatif Daun 0 5.0 ± 0.0 a 3.0 ± 0.0 a 5.0 ± 0.0 a 53.94 ± 2.4 b 15 5.0 ± 0.0 a 3.0 ± 0.0 a 5.0 ± 0.0 a 53.66 ± 2.8 b 30 4.5 ± 1.4 a 3.0 ± 0.0 a 5.0 ± 0.0 a 52.96 ± 3.5 b 45 3.8 ± 1.5 a 2.2 ± 1.0 b 3.8 ± 1.5 bc 56.81 ± 2.6 a 60 2.0 ± 1.1 b 1.0 ± 0.0 c 4.0 ± 1.1 b 33.52 ± 3.7 c 75 1.2 ± 0.7 bc 1.0 ± 0.0 c 3.0 ± 0.0 c 30.38 ± 5.2 c 90 1.5 ± 0.9 bc 1.0 ± 0.0 c 3.0 ± 0.0 c 31.30 ± 4.3 c 105 1.0 ± 0.0 c 1.0 ± 0.0 c 3.0 ± 0.0 c 30.39 ± 6.7 c Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom peubah yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%. Nilai ± yang disajikan adalah standar deviasi. a) Data merupakan hasil transformasi dengan rumus (√X+0.5); b) Data merupakan hasil transformasi dengan rumus (√X+1); c) Data merupakan hasil transformasi dengan rumus (log x). Angka pada peubah warna daun, tekstur daun, dan warna batang merupakan nilai skoring. Skoring warna daun dan batang: 5=ungu, 3=ungu kehijauan, 1=hijau. Skoring tekstur daun: 3=lembut, 1=keras/kaku.
Berdasarkan hasil penelitian pada Tabel 3, perlakuan sinar gamma memberikan pengaruh nyata pada tekstur daun tanaman handeuleum. Perlakuan 0 Gy, 15 Gy, dan 30 Gy menghasilkan nilai skoring 3, yang berarti daunnya bertekstur lembut dan lemas. Perlakuan dengan dosis 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy memiliki nilai skoring 1, dan tekstur daun tanaman kaku, daunnya tebal dan mudah patah. Terdapatnya perubahan pada tekstur daun sesuai dengan penelitian yang dipaparkan oleh Widiastuti (2010) pada manggis, dan Aisyah (2006) pada anyelir. Muthusamy et al. (2007) menjelaskan penelitiannya pada kacang tanah, bahwa jumlah daun yang mengalami variasi juga meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi dari mutagen.
Perlakuan sinar gamma juga memberikan pengaruh pada warna batang handeuleum. Berdasarkan hasil yang disajikan pada Tabel 3 diketahui bahwa tanaman yang diberikan perlakuan dengan dosis 15 Gy dan 30 Gy memiliki nilai skoring 5, sama dengan nilai skoring tanaman kontrol (0 Gy). Tanaman handeuleum yang diberi iradiasi sinar gamma dosis 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy memiliki nilai skoring 3, dan tidak berbeda nyata dengan perlakuan sinar gamma dosis 45 Gy. Warna batang pada tanaman yang diberi perlakuan dengan dosis 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy adalah hijau dan hijau keunguan, berbeda dengan warna batang pada perlakuan sinar gamma 15 Gy dan 30 Gy yaitu berwarna ungu.
Sinar gamma mempengaruhi tinggi tanaman, warna daun, tipe daun, ukuran daun, bentuk daun, tipe polong, dan warna benih (Badignnavar & Murty 2007). Menurut Cuttriss et al. (2007), klorofil merupakan pigmen yang menyebabkan warna hijau, sedangkan karotenoid merupakan pigmen penyebab warna merah, oranye, dan kuning pada bagian tumbuhan. Buchanan et al. (2000) menyebutkan bahwa antosianin merupakan pigmen nonkloroplas pada tanaman, dikenal sebagai pigmen yang menyebabkan warna merah jambu, ungu, dan biru dan ditimbun dalam vakuola sel parenkim dewasa. Berdasarkan hasil analisis skoring terlihat bahwa perubahan warna daun terlihat skoringnya semakin menurun seiring dengan peningkatan dosis iradiasi sinar gamma, dan diikuti oleh penurunan kandungan klorofil yang ditunjukkan oleh penurunan indeks warna hijau relatif daun. Menurut Rostini et al. (2000) dan Tyas (2006), kandungan
klorofil berkorelasi positif dengan warna hijau relatif daun, sehingga indeks warna hijau relatif pada daun dapat dimanfaatkan untuk menduga kandungan klorofil.
Iradiasi menyebabkan peningkatan kandungan radikal bebas hidrogen peroksidase (H2O2) pada tanaman, karena ionisasinya mengakibatkan reaksi radiolisis air yang hasil akhirnya adalah radikal bebas. H2O2 terbukti mengakibatkan kerusakan dinding sel, membran, dan DNA. Kloroplas secara genetik memiliki sistem pewarisan sendiri dalam bentuk kromosom kloroplas. Salisbury dan Ross (1995) mengemukakan bahwa klorofil terdapat pada membran tilakoid kloroplas yang terdapat di dalam sitoplasma. Kloroplas mengandung DNA, RNA, ribosom, serta enzim. Apabila mutasi terjadi pada salah satu gen akan mempengaruhi sintesis klorofilnya.
Seperti diketahui klorofil terletak pada sel parenkima, terutama palisade dan sedikit di sel bunga karang. Menurunnya kandungan klorofil pada tanaman yang diiradiasi mengindikasikan bahwa tempat sintesisnya juga mengalami kerusakan. Penelitian yang dilakukan oleh Wi et al. (2007) ditemukan bahwa akumulasi H2O2 ditemukan di membran plasma dan lamela tengah berbagai organ tanaman, tapi paling utama terdapat pada daun. Wi et al. (2007) menjelaskan lebih lanjut bahwa sel parenkima lebih sensitif terhadap iradiasi dibandingkan dengan sel pembuluh.
Kandungan Antosianin, Klorofil Total dan Karotenoid
Perbedaan warna daun dan batang antara tanaman kontrol (0 Gy) dan yang diiradiasi sinar gamma berhubungan sangat erat dengan kandungan antosianin, klorofil, dan karotenoids (Gambar 9). Daun yang telah diiradiasi dosis 15 Gy, 30 Gy, dan 45 Gy kandungan pigmen lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol, sedangkan yang diiriadiasi dengan dosis 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy kandungannya lebih rendah dibandingkan kontrol.
Antosianin merupakan pigmen nonkloroplas pada tanaman, dikenal sebagai pigmen yang menyebabkan warna merah jambu, ungu, dan biru, dan ditimbun dalam vakuola sel parenkim dewasa (Buchanan et al. 2000). Menurut Hopkins dan Huner (2004) antosianin berfungsi menyerap UV-B untuk mencegah kerusakan jaringan daun yang disebabkan oleh radiasi UV.
Gambar 9 Grafik perbandingan kandungan pigmen antosianin, klorofil total, dan karotenoid handeuleum aksesi Bogor pada berbagai dosis iradiasi. Klorofil dan karotenoid merupakan pigmen fotosintetik pada tumbuhan, dimana klorofil merupakan pigmen utama dalam fotosintesis. Karotenoid, merupakan pigmen yang mempunyai warna berbagai campuran kuning dan jingga, dengan fungsi utama untuk fotoproteksi dengan cara menyerap dan melepaskan energi cahaya yang berlebihan (Sandman & Scherr 1998). Salisbury dan Ross (1995) mengemukakan bahwa klorofil terdapat pada membran tilakoid dalam kloroplas yang terdapat di dalam sitoplasma. Kloroplas mengandung DNA, RNA, ribosom, serta enzim.
Berdasarkan hasil sidik ragam dapat dilihat bahwa perlakuan iradiasi sinar gamma berpengaruh sangat nyata pada indeks warna hijau relatif daun tanaman handeuleum. Perlakuan iradiasi 45 Gy menghasilkan indeks warna hijau relatif daun paling tinggi yaitu sebesar 56.81. Nilai paling kecil didapat pada perlakuan
iradiasi 75 Gy sebesar 30.38, tidak berbeda nyata dengan perlakuan iradiasi 60 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy.
Selain diukur dengan indeks warna hijau relatif daun, analisa pigmen juga dilakukan di laboratorium terhadap kandungan masing pigmen antosianin, total klorofil, dan total karotenoid. Menurut Rostini et al. (2000) dan Ning Tyas (2006), kandungan klorofil berkorelasi positif dengan warna hijau relatif daun, sehingga
indeks warna hijau relatif pada daun dapat dimanfaatkan untuk menduga kandungan klorofil.
Berdasarkan hasil analisis laboratorium terlihat bahwa kandungan klorofil total yang besar terdapat pada tanaman kontrol (0 Gy) dan tanaman yang diberi perlakuan iradiasi sinar gamma dosis 15 Gy, 30 Gy, dan 45 Gy, sedangkan tanaman yang diberi perlakuan iradiasi dosis 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy memiliki kandungan klorofil total yang sedikit. Secara umum hal ini sejalan dengan hasil analisis ragam, meskipun secara statistik tanaman yang diberi perlakuan iradiasi 45 Gy ialah tanaman yang memiliki indeks warna hijau relatif daun paling tinggi, sedangkan menurut analisis laboratorium tanaman justru kontrol yang memiliki kandungan klorofil total paling tinggi.
Kandungan antosianin tertinggi dimiliki oleh tanaman yang diberi perlakuan iradiasi dosis 30 Gy, dan paling rendah oleh perlakuan iradiasi 60 Gy. Hal yang sama terlihat pada kandungan karotenoid, iradiasi sinar gamma 30 Gy menghasilkan kandungan paling banyak sedangkan perlakuan 105 Gy menghasilkan karotenoid paling sedikit. Seperti halnya kandungan klorofil total terlihat bahwa kandungan antosianin dan karotenoid yang tinggi dimiliki oleh tanaman yang diberi perlakuan iradiasi dosis 15 Gy, 30 Gy, dan 45 Gy, bahkan melebihi kandungan antosianin dan karotenoid tanaman kontrol (0 Gy).
Hal ini sejalan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Kim et al. (2009), yang mengemukakan bahwa iradiasi sinar gamma meningkatkan kandungan protein terlarut, klorofil, dan karotenoid, pada daun Arabidopsis yang diiradiasi dengan sinar gamma dosis 50 Gy bila dibandingkan dengan kontrol. Nagata et al. (1999) memaparkan bahwa terjadi akumulasi antosianin pada bagian yang berongga (aerial part) setelah tanaman Arabidopsis diiradiasi dengan sinar gamma (1 - 3 kGy). Iradiasi juga menginduksi pembentukan trikoma baru pada permukaan atas daun, penambahan lapisan sel akar, dan pemanjangan akar rambut. Menurut Wada (1998), tanaman Nicotiana setelah mendapatkan iradiasi sinar gamma dosis tinggi (100 - 500 Gy) pertumbuhannya menjadi terhambat, klorofil terdegradasi, dan terjadi aberasi morfologi pada tanaman. Penelitian yang dilakukan Calucci et al. (2003) dikatakan bahwa aplikasi dosis yang umum digunakan (10 kGy) dari iradiasi sinar gamma menyebabkan penurunan
karotenoid pada cinnamon, oregano, parsley, rosemary, bird pepper, dan sage ketika semua dibandingkan dengan kontrol. Sementara menurut Koseki et al. (2002) iradiasi gamma di atas 30 kGy (interval 10), kandungan β-karoten menurun secara perlahan pada ekstrak pada kemangi (Ocimum basilicum L.). Wi et al. (2007) mengemukakan bahwa berdasarkan observasi TEM, kloroplas merupakan organel yang sangat sensitif terhadap iradiasi dengan sinar gamma tingkat tinggi bila dibandingkan dengan organel lain. Adapun dosis iradiasi yang rendah tidak menyebabkan perubahan pada ultra struktur kloroplas. Hal ini yang mungkin dapat dijadikan pegangan mengapa pada penelitian ini antosianoin, klorofil total, dan karotenoid pada tanaman yang diiradiasi dengan sinar gamma dosis rendah kandungannya justru lebih tinggi bila dibandingkan dengan kontrol. Antosianin, klorofil total, dan karotenoid akan mengalami degradasi bila diiradiasi dengan dosis yang tinggi. Lebih jauh Kim et al. (2009) menjelaskan bahwa kandungan klorofil, karotenoids, protein, dan antosianin yang lebih banyak pada tanaman yang diiradiasi disebabkan gen yang terlibat dalam anabolisme klorofil dan antosianin (AtHEMA1, AtPORB, AtPORC, AtCHLG, dan AtANS) proses transkripsi meningkat bila dibandingkan dengan kontrol.
Kandungan pigmen fotosintetik yang tinggi terutama klorofil dapat meningkatkan fotosintesis tanaman sehingga akumulasi fotosintat yang dihasilkan semakin tinggi. Akumulasi fotosintat yang tinggi mengakibatkan pembesaran dan diferensiasi sel yang dinyatakan dalam perubahan ukuran luas daun, pertumbuhan tinggi, dan pembesaran diameter batang (Urnemi et al. 2002).
Hasil pengamatan terhadap warna daun, batang, baik secara skoring, maupun analisis laboratorium sejalan dengan hasil yang diperoleh oleh pengamatan warna hijau relatif daun menggunakan SPAD. Warna daun dan batang ditentukan oleh kandungan pigmen yang terdapat di dalam jaringan tanaman tersebut. Tanaman handeuleum kontrol (0 Gy) dan yang diiradiasi dengan dosis 15 Gy, 30 Gy, 45 Gy memiliki warna daun dan batang keunguan, sedangkan yang diiradiasi dengan dosis 60 Gy, 75 Gy, 90 Gy, dan 105 Gy memiliki warna hijau. Berdasarkan hasil analisis laboratorium dan SPAD terlihat bahwa kandungan klorofil tanaman kontrol (0 Gy) dan yang diiradiasi dengan dosis 15 Gy, 30 Gy, 45 Gy memiliki kandungan pigmen-pigmen yang lebih
tinggi. Berdasarkan penampang melintang daun secara transversal (Gambar 13) diduga warna ungu yang terlihat pada daun dan batang dikarenakan letak antosianin yang lebih tersebar, yaitu terletak di sel epidermis atas dan juga terdapat pada palisade. Hal ini yang menentukan warna tanaman handeuleum terutama pada daun yang terlihat oleh mata, meskipun kandungan antosianin dan klorofil hampir sama besarnya.
Anatomi Daun
Iradiasi sinar gamma berpengaruh sangat nyata terhadap struktur anatomi daun handeuleum. Perubahan bersifat individual meskipun diiradiasi pada dosis yang sama karena pengaruh mutagen bersifat acak, tidak terdapat pola dari kenaikan dosis iradiasi sinar gamma.
Menurut Dickinson (2000), stuktur anatomi daun dapat mengalami perubahan akibat iradiasi sinar gamma yang bersifat ionisasi. Perubahan tersebut dapat berupa perubahan susunan dan ukuran jaringan palisade serta pembesaran jaringan bunga karang, nekrosis jaringan, dan distorsi tulang daun. Harahap (2005) menyatakan bahwa studi struktur anatomi tanaman mutan sangat berguna menjelaskan perubahan kontrol genetik pada proses tertentu. Qosim et al. (2007) berpendapat bahwa tanaman yang memiliki kerapatan stomata, parenkim palisade, dan jumlah pembuluh yang banyak dapat dijadikan sebagai kriteria seleksi tidak langsung untuk efisiensi fotosintesis.
Irisan Paradermal
Daun handeuleum memiliki stomata yang terletak pada permukaan bawah daun. Berdasarkan pengamatan secara paradermal terlihat bahwa pada lapisan epidermis daun handeuleum terdapat stomata, sel penjaga, sel tetangga, dan sel epidermis (Gambar 10).
20
Gambar 10 Irisan paradermal daun handeuleum aksesi Bogor (400x): sel
epidermis (a), sel tetangga (b), sel penjaga (c), dan lubang stomata (d).
Berdasarkan hasil yang disajikan pada Tabel 4 terlihat bahwa jumlah sel epidermis terbanyak dimiliki oleh tanaman yang mendapat perlakuan iradiasi sinar gamma dosis 60 Gy, yaitu sebesar 303.6, tidak berbeda nyata dengan perlakuan iradiasi sinar gamma dosis 30 Gy dengan jumlah sel epidermis sebanyak 284.9. Jumlah sel epidermis yang terendah sebesar 223.8 didapat pada tanaman yang diiradiasi sinar gamma dosis 75 Gy.
Tabel 4 Nilai rata-rata jumlah stomata, jumlah sel epidermis, indeks stomata, dan kerapatan stomata daun handeuleum aksesi Bogor pada berbagai perlakuan dosis iradiasi sinar gamma pada 10 MST
Dosis Iradiasi (Gy) Peubah Jumlah Sel Epidermis Jumlah Stomata Indeks Stomata Kerapatan Stomata (jml/mm2) 0 239.8 ±27.8 bc 94.7 ± 7.7 bc 0.3 ± 0.03 a 482.7±39.0 bc 15 256.6 ± 17.4 b 108. ± 15.7 ab 0.3 ± 0.03 a 554.3 ± 79.8 a 30 284.9 ± 20.8 a 112.1 ± 8.8 a 0.3 ± 0.02 a 571.0 ± 44.9 a 45 248.1 ± 18.0 bc 111.4 ± 8.6 a 0.3 ± 0.02 a 567.6 ± 43.7 a 60 303.6 ± 35.2 a 104.5 ± 7.2 ab 0.2 ± 0.05 b 532.5 ± 87.9 ab 75 223.8 ± 2.1 c 89.0 ± 8.5 c 0.3 ± 0.02 a 453.5 ± 43.5 c 90 229.7 ± 42.6 bc 63.0 ± 19.3 d 0.2 ± 0.07 b 321.0 ± 98.4 d 105 243.2 ± 30.3 bc 95.2 ± 8.9 bc 0.3 ± 0.03 a 485.2 ± 45.5 bc Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom peubah yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%. Nilai ± yang disajikan adalah standar deviasi.
(d) (c)
(b) (a)
Tanaman yang mendapat perlakuan iradiasi sinar gamma dosis 30 Gy memiliki jumlah stomata terbanyak sebesar 111.0, tidak berbeda nyata dengan perlakuan iradiasi sinar gamma dosis 45 Gy yang menghasilkan stomata sebanyak 111.4. Jumlah stomata paling sedikit terdapat pada tanaman yang diberi perlakuan sinar gamma dosis 90 Gy, yaitu sebanyak 63.0.
Indeks stomata paling besar dihasilkan oleh perlakuan iradiasi sinar gamma dosis 45 Gy yaitu sebesar 0.3, tidak berbeda nyata dengan perlakuan 0 Gy, 15 Gy, 30 Gy, 75 Gy, dan 105 Gy (0.3, 0.3, 0.3, 0.3, dan 0.3). Indeks stomata terkecil terdapat pada tanaman yang diiradiasi dengan sinar gamma dosis 90 Gy yaitu sebesar 0.2, tidak berbeda nyata dengan perlakuan iradiasi dosis 60 Gy yang menghasilkan indeks stomata sebesar 0.2.
Kerapatan stomata paling besar dihasilkan oleh perlakuan sinar gamma dosis 30 Gy sebesar 571.0, tidak berbeda nyata dengan perlakuan dosis 15 Gy dan 45 Gy yang berturut-turut menghasilkan kerapatan stomata sebesar 554.3 dan 567.6. Kerapatan stomata paling kecil dihasilkan oleh iradiasi sinar gamma dosis 90 Gy yaitu sebesar 321.6.
Penampang paradermal daun handeuleum disajikan pada Gambar 11. Berdasarkan pengamatan paradermal daun dan hasil analisis ragam terlihat bahwa terjadi perubahan anatomi daun handeuleum yang diiradiasi. Hal yang sama terjadi pada penelitian yang dilakukan oleh Qosim et al. (2007) dan Widiastuti (2010) terhadap manggis yang ditanam secara in vitro dan in vivo. Qosim et al. (2007) mengemukakan terdapat beberapa regeneran manggis yang memiliki kerapatan dan indeks stomata yang lebih besar bila dibandingkan dengan kontrol.
Penelitian Widiastuti (2010) memaparkan bahwa iradiasi sinar gamma dosis 25 Gy menghasilkan indeks dan kerapatan stomata daun manggis paling kecil bila
dibandingkan dengan kontrol.
Kerapatan stomata sangat tergantung ukuran sel, jika ukuran sel penjaga kecil maka kerapatan stomata lebih banyak, begitu pula sebaliknya. Indeks stomata merupakan perbandingan jumlah stomata dengan penjumlahan jumlah sel epidermis dan jumlah stomata, dan merupakan karakter anatomi yang tidak dipengaruhi oleh kondisi lingkungan bila dibandingkan dengan kerapatan stomata, sehingga digunakan sebagai penciri keragaman tanaman (Wilmer 1983).
