Targeted Delivery of Saporin Toxin by Monoclonal Antibody to the Transcobalamin Receptor, TCblR/CD320
Introduction
Uptake vitamin B12 (cobalamin; CBL) dimediai oleh reseptor transcobalamin (TCblR/CD320) pada membran plasma yang mengikat transcobalamin (TC), suatu protein plasma jenuh. Reseptor ini terekspresi tinggi pada sel yang aktif berproloferasi dan rendah pada sel yang tidak berproliferasi. Ekspresi diferensial dari reseptor berfungsi mengirimkan vitamin ke sel pada fase awal sintesis DNA. Metionin sintase sangat penting untuk daur ulang metil folat agar menghasilkan folates yang diperlukan purin dan pirimidin untuk biosintesis. Sel yang lebih proliferatif, membutuhkan folates dan Cbl lebih tinggi untuk peningkatan ekspresi TCblR dalam sel kanker. Membunuh sel kanker secara spesifik dengan pemberian obat dan toksin merupakan tujuan utama. Dilakukan dengan pencarian marker spesifik tumor. Ada banyak factor yang mempengaruhi kekurang selektifan target antigen, antara lain keberagamnnya sel kanker, dan persaingan antar sel. Peneliti memanfaatkan siklus sel yang terkait TCblR untuk mengirimkan saporin ( merupakan inhibitor perakitan ribosom sel kanker dengan menggunakan antibodi monoklonal (mAb) ke domain ekstraseluler TCblR).
Material dan Metode
mAbs yang dihasilkan untuk ekstraseluler rekombinan domain dari TCblR didapat dalam embrio ginjal manusia sel induk (HEK-293) yang dimurnikan. Digunakan untuk mempelajari pengiriman saporin-terkonjugasi goat anti-mouse IgG antibodi sekunder.
Digunakan K562 (ATCC CCL 243) sel erythroleukemia pada manusia dan U266 (ATCC TIB 196) myeloma manusia yang dikultur dalam bentuk suspensi. SW48 (ATCC CCL- 231) sel kanker usus besar. KB (ATCC CCL-17 karsinoma) epidermoid manusia yang dibiakkkan sebagai sel patuh; dan HEK-293 (ATCC CRL-1573).
Spesifisitas pengikatan mAbs.
Pengikatan dan internalisasi antibodi diarahkan ke TCblR yang ditentukan dalam HEK-293 sel yang direkayasa untuk mengekspresikan Green Fluorescent Protein (GFP) di akhir sitoplasmik dari TCblR. Untuk penentuan ini, mAb1-25 di-preinkubasi dengan quantum dot (qdot) 625- goat anti-mouse terkonjugasi dengan IgG antibodi sekunder (Invitrogen) selama 60 menit untuk membentuk suatu yang kompleks dan kemudian diinkubasi dengan sel budaya. Spesifikasi dari pengikatan mAb diuji dalam sel K562 yang mengungkapkan asal TCblR. Pengikat dan internalisasi dari mAb1-19-qdot 625 kompleks ditentukan pada suhu 4 ° C dan 37 ° C, dan IgG dari tikus normal digunakan sebagai negatif kontrol. Penentuan konsentrasi optimum antibodi primer
Untuk menentukan konsentrasi optimum mAb untuk studi in vitro sel-pembunuh, mAb1-25 adalah dg di-preinkubasi saporin-terkonjugasi dengan goat anti-tikus IgG sekunder antibodi pada molar rasio 1:1 selama 60 menit untuk membentuk kompleks. Berbagai konsentrasi ini mAb / saporin antibodi kompleks (0,1 pmol / L untuk 50 nmol / L) diinkubasi dengan 10.000 SW48 (karsinoma kolon) atau sel K562 (Erythroleukemia) dalam 96-piring yang juga budaya selama 72 jam, dan sel-sel yang layak dihitung dengan MTS assay (Promega).
Penentuan rasio optimum mAb untuk Saporin antibody.
Untuk menggunakan antibodi anti-TCblR sebagai pembawa saporin ke dalam sel melalui TCblR, rasio optimum primer mAb untuk penentuan saporin-terkonjugasi antibodi sekunder. Sel karsinoma kolon SW48 adalah unggulan pada kepadatan 10.000 sel per well di baik 96-piring budaya. Dalam satu set percobaan, konsentrasi primer mAb divariasikan 0,078-80 nmol / L, sedangkan konsentrasi antibodi
sekunder adalah tetap konstan pada 10 nmol / L. Dalam satu set percobaan, konsentrasi dari mAb primer tetap konstan pada 2,5 nmol / L, dan konsentrasi antibodi saporin divariasikan 10-40 nmol / L. Viabilitas sel ditentukan setelah 72 jam dengan alat tes MTS.
Efek cell-seeding density pada kemanjuran mAb / saporin antibodi kompleks
Cell-seeding density mendefinisikan sebagai fase proliferatif dari kultur, dan karena itu, sel seeded pada density yang rendah akan mereplikasi lebih lama sampai mencapai populasi sel confluency. Karena ekspresi TCblR tertinggi ada di sel yang aaktif berproliferasi, dilakukan uji garis sel pada seeding density yang bervariasi dari 1.000 hingga 10.000 sel dengan tiga antibodi primer yang berbeda pada 2,5 nmol / L mAb dan 10 nmol / L saporin konsentrasi antibody.
Penentuan konsentrasi mAb / saporin antibody yang dibutuhkan untuk mengahambat 50% pertumbuhan sel.
Karena efek racun dari antibodi saporin lebih nampak dalam kultur cell-seeding density rendah, penentuan IC50 dilakukan pada seeding-cell 1.000 di piring 96, di pada antibodi mAb-saporin rasio 1:4 dan konsentrasi antibodi primer kisaran 0,046-2,5 nmol / L. Sel layak ditentukan dengan alat tes MTS setelah 96 jam dalam kultur.
Spesifikasi jalur TCblR untuk pengahantaran racun saporin antibodi
Spesifikasi jalur TCblR-dimediasi untuk internalisasi kompleks toksin mAb / saporin antibodi yang ditentukan dengan cara menambahkan reseptor larut ke media kultur. Reseptor larut akan bersaing dengan reseptor permukaan sel untuk antibodi, dan ini akan mengurangi toksin antibodi tersedia untuk selular serapan, mengakibatkan penurunan penghambatan persen. Untuk percobaan ini, sel-sel SW48 unggulan di 96-piring dengan baik pada 2.000 sel per baik, dan jumlah mAb / saporin antinbody digunakan adalah setara dengan IC50.
Spesifisitas anti-TCblR mAb untuk menyampaikansaporin antibodi racun
mAb primer yang 100-kali lipat lebih kuat atau normal tikus IgG ditambahkan ke dalam media inkubasi berisi / mAb saporin antibodi konsentrasi 2.5/10 nmol / L. Penurunan anti-TCblR mAb / saporin antibodi dapat menghambatan pertumbuhan sel, harus diamati ketika ada kelebihan antibodi primer, karena rasio saporin antibodi-label mAb utama berlabel primer mAb harus lebih rendah, dan ini meningkatkan probabilitas dari tanpa label mAb mengikat TCblR. Penambahan tikus yang normal IgG juga harus menghasilkan penurunan dalam sel membunuh karena antibodi saporin sekunder juga akan mengikat IgG mouse biasa, dan kompleks ini tidak dapat mengikat TCblR.
Hasil
Sel transfected secara stabil mengekspresikan TCblR chimeric dengan tag GFP ke ujung sitoplasmik dari reseptor, menunjukkan diskrit membran terkait fluoresensi, ditunjukkan pada Gambar. 1A, ikatan dari mAb1-25-qdot 625red kompleks pada 4 ° C terbatas pada reseptor permukaan, seperti ditunjukkan oleh sebagian besar membran terkait fluoresensi tersebar di seluruh pinggiran sel. Ikatan dan internalisasi mAb1-25-qdot 625red kompleks terikat untuk TCblR terjadi pada 37 ° C seperti yang ditunjukkan oleh segregasi dari reseptor ke daerah diskrit dalam membran serta
sitoplasma, ditunjukkan oleh colocalization dari fluoresensi merah dan hijau (Gambar 1B). Mirip ikatan dan internalisasi yang diamati dengan mAb1-19-qdot 625red kompleks ketika diinkubasi dengan K562 sel mengekspresikan tingkat normal non-GFP native TCblR (Gambar 1D). Kekhususan ikatan dan internalisasi dikonfirmasi dengan menggantikan tikus IgG normal untuk antibodi primer dan inkubasi dengan sel K562, yang gagal untuk menunjukkan ikatan dan internalisasi qdot 625red (Gambar 1C)
Ketiga anti-TCblR mAbs diuji menghasilkan efek yang hampir sama, dengan 2,5 nmol / L konsentrasi utama mAb sebagai yang paling efektif dalam menghambat pertumbuhan sel (Gambar 2A). Penambahan 3,7 nmol / L holo-TC kultur tidak memiliki pengaruh yang signifikan pada hasil meskipun kecil perbedaan yang diamati karena TC-CBL bersaing dengan antibodi untuk penyerapan. Konsentrasi dari TC-Kabel yang digunakan adalah lebih dari 0,5 sampai 1,5 nmol normal / L dalam plasma. Meningkatkan konsentrasi antibodi saporin tidak menghasilkan peningkatan kematian sel (Gambar 2B). Jadi, sebuah mAb konsentrasi 2,5 nmol / L dan konsentrasi antibodi saporin dari 10 nmol / L antibodi (yaitu, sebuah mAb-saporin rasio 1:4) tampaknya optimal untuk memberikan antibodi racun ke dalam sel melalui jalur TCblR.
HEK-293 sel secara stabil transfected untuk overexpression TCblR yang sangat sensitif terhadap mAb / saporin antibodi, dalam penghambatan> 90% dari pertumbuhan sel. Ekspresi TCblR dalam sel-sel didorong oleh promotor CMV dan tidak tergantung pada siklus sel atau proliferasi sel. Hubungan antara ekspresi TCblR dan efek mAb-saporin konjugat tampak jelas saat normal-HEK 293 sel dan sel-293TR overexpressing TCblR pada kepadatan yang bervariasi dan terkena mAb-saporin. Sedangkan efek dari toksin menurun dengan meningkatnya kepadatan sel yang normal. HEK-293 sel,> 80% dari sel-sel HEK-293TR mati di semua kepadatan sel (Gambar 3A).
Dengan demikian, efektivitas toksin secara langsung berkaitan dengan tingkat ekspresi reseptor. Untuk semua baris sel diuji di mana ekspresi reseptor terkait dengan keadaan proliferatif dari sel-sel di kultur, efek yang paling diamati ketika pada kepadatan rendah, seperti yang ditunjukkan untuk U266 sel dalam Gambar 3B. Semua tiga mAbs diuji menghasilkan hasil yang sama. Untuk membandingkan efektif pengiriman toksin, penentuan IC50 dilakukan dan ditunjukkan pada Gambar. 4 untuk dua kultur suspensi dan dua penganut baris sel. Untuk jalur sel, IC50 itu di 0,625 untuk 2,5 nmol / L kisaran untuk konsentrasi mAb primer. Kekhususan dari jalur TCblR terbukti dari efek penurunan toksin saat larut.
TCblR rekombinan telah ditambahkan ke dalam media kultur. Reseptor larut dalam media kultur akan bersaing dengan reseptor permukaan sel untuk antibodi dan mengurangi toksin yang tersedia untuk penyerapan selular antibodi, sehingga dalam penurunan penghambatan persen seperti ditunjukkan pada Gambar. 5A. Kekhasan tikus anti-TCblR mAb untuk memberikan toksin antibodi saporin ditentukan dengan menambahkan baik 100-kali lipat primer mAb atau tikus normal IgG terhadap media inkubasi. Penghambatan sel pertumbuhan terlihat dengan antibodi anti-TCblR mAb1-10/saporin menurun ketika salah antibodi primer atau tikus yang normal IgG ditambahkan. Primer mAb atau normal tikus IgG dalam tidak adanya antibodi saporin tidak berpengaruh pada pertumbuhan sel (Gambar 5B). Efek penghambatan pertumbuhan dari TCblR mAb / saporin kompleks antibodi tampaknya lebih spesifik untuk saluran sel tumor karena berbeda garis fibroblast sel manusia tidak dihambat pada kondisi kultur identik (Gambar 5C). Efek pada sel sumsum tulang yang tampak jauh lebih sedikit jika dipertahankan dalam DMEM dibandingkan dengan MarrowMAX menengah (Gibco) tetapi jauh lebih sedikit daripada penghambatan diamati dengan banyak baris sel tumor (Gambar 5D).
DISKUSI
Tujuan perkembangan terapi pada target sel kanker adalah penghancuran tanpa mempengaruhi komponen seluler normal. Tapi, konsep ini terbukti sulit karena sifat kompleks dan beragam kanker dan adaptasi biologis yang lolos pengobatan. Kini, pendekatan multipronged disesuaikan dengan kanker tertentu dan jenis jaringan mungkin diperlukan untuk keberhasilan dalam merancang pengobatan kanker yang spesifik dan kurang toksik.
Potensi terapi antibodi monoklonal sebagai modulator kekebalan atau sebagai pembawa obat atau racun sedang dieksplorasi sebagai antibodi rekayasa yang sedang dikembangkan. Penggunaan racun poten seperti risin, toksin kolera, gelonin dan saporin jika ditargetkan secara khusus untuk sel-sel kanker dapat sangat efektif dalam menghancurkan sel-sel. Hal ini memerlukan antigen sel target spesifik tumor yang antibodi monoklonal dapat mengenali dan memberikan racun ke sel. Banyak reseptor telah dieksplorasi sebagai antigen target dengan beberapa tingkat keberhasilan. Namun, antigen ini juga diekspresikan pada sel normal dan karenanya selektif menargetkan sel kanker ditentukan terutama oleh perbedaan ekspresi dari target reseptor.Toksisitas umum dari konjugasi akan tergantung pada jumlah reseptor yang diekspresikan pada masing-masing jenis sel. Antigen target yang ideal harus spesifik tumor atau diekspresikan pada tingkat rendah seperti pada sel normal yang akan membuat dosis efektif. Reseptor yang sama jika diekspresikan dalam sel-sel kanker akan memberikan antigen target yang selektif untuk sel tumor.
Ekspresi dari TCblR cukup rendah dengan hanya beberapa ribu reseptor yang diperlihatkan dalam sel aktif mereplikasi selama fase S dari siklus sel. Karena sifat proliferatif sel neoplastik, ekspresi ini 5 sampai 10 kali lipat diatas normal dan berkelanjutan dalam sel-sel kanker tertentu. Ekspresi ini cukup berbeda untuk memberikan selektivitas yang diperlukan untuk target penghancuran sel kanker.
Kesimpulan ini didasarkan pada efek penurunan pada turunan sel pada kerapatan lebih tinggi , yang tidak membelah dengan tingkat yang sama seperti turunan sel pada kerapatan rendah dan virtual sel normal yang membaginya tetapi gagal untuk menginternalisasi racun yang cukup.
Cbl penting dalam daur ulang metilfolat, yaitu bentuk mayor folat dalam tubuh. Sehingga, kekurangan Cbl akan menurunkan produk metabolit folat yang akan merusak sintesis DNA dan perubahan megaloblastic pada sumsum tulang. Hambatan ambilan dari Cbl ke dalam sel oleh antibodi monoklonal menjdi TC telah digunakan untuk strategi dalam terapi kanker. Antibodi untuk TCblR yang menghambat pengikatan TC-Cbl dapat juga mencegah uptake seluler dari TC-Cbl dan dapat digunakan untuk memblok uptake Cbl menjadi sel kanker. Dalam hal ini, hampir tidak ada toksisitas sistemik langsung. Namun, tidak praktis karena jadwal pengobatan panjang yang diperlukan untuk mendeplesi Cbl intraseluler. Penggunaan jalur TC-TCblR untuk meghantarkan racun dan memberikan dosis obat yang dibutuhkan secara cepat akan menghancurkan sel tumor yang sangat proliferatif. Siklus sel terkait ekspresi TCblR dan ekspresi tingkat tinggi dalam sel-sel kanker tertentu vs sel-sel normal memberikan selektivitas dan spesifisitas tergantung dari strategi penargetan.
Dalam memanfaatkan antibodi secara in vivo pada manusia, toksisitas sumsum tulang merupakan masalah potensial. Toksisitas rendah diamati untuk sel-sel dalam DMEM dan efek sedikit lebih tinggi terlihat di media Marrowmax berkaitan dengan proliferasi dan diferensiasi sel-sel sumsum selanjutnya. Rata-rata, ekspresi TCblR dalam sel embrio adalah serupa dengan yang diamati dalam fibroblas kulit. Jadi keadaan proliferatif dari sel-sel dan ekspresi TCblR akan menentukan toksisitas sumsum. Meskipun efek pada sumsum in vitro rendah, kemungkinan toksisitas jauh lebih besar pada in vivo. Penurunan reseptor sel permukaan oleh predosis dengan B 12 atau dengan antibodi tanpa racun adalah strategi
