EKSPRESI GEN TNF -
α
INDIVIDU DENGAN HIPERTENSI
M.Sabir
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Tadulako
ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian ekspresi gen TNF-α pada individu dengan hipertensi. Tujuan penelitian ini untuk mendeteksi ekspresi gen TNF-α pada individu dengan hipertensi. TNF-α merupakan salah satu mediator imun yang berperan pada inflamasi vaskuler baik akut
maupun kronik. Pada individu dengan hipertensi terdapat sirkulasi TNF-α yang tinggi dan
abnormal yang memiliki korelasi terhadap besarnya tekanan darah. Jumlah sampel yang
digunakan sebanyak 25 sampel dari individu hipertensi dan individu sehat normotensi. Uji
teknik RT-PCR dilakukan di Laboratorium Imunologi dan Biologi Molekuler Fakultas
Kedokteran Universitas Hasanuddin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi gen TNF-α pada individu hipertensi meningkat lebih tinggi dibandingkan dengan orang sehat.
Kata kunci : Hipertensi, TNF -α, Inflamasi vaskular
ABSTRACT
A research has been done about the Analyze of TNF -α Gene Expression in Hypertension. This research was aimed to detect of TNF-α gene expression in hypertension. TNF-α is an immune system that takes a role in acute and cronic of vascular inflamation. In many kinds of hypertension patients, there is a high and abnormal of TNF -α circulation and has been correlated with blood pressure level. Twenty five samples were taken from hypertension patients and health body (normotension) blood. Technical assay of RT-PCR was done in Molecular Biology and Immunology Laboratory of Medical Faculty of Hasanuddin University. The result indicated that TNF-α gene expression in hypertension was more increased than in health body cell.
Pendahuluan
Hipertensi disebut sebagai “The
silent killer” karena tidak menimbulkan gejala hingga komplikasi mulai terjadi,
sekitar separuh orang yang menderita
hipertensi tidak menyadarinya. Selain itu
sebagian besar orang beranggapan
hipertensi sebagai gejala dari suatu
penyakit bukan sebagai penyakit atau suatu
keadaan abnormal yang primer (berdiri
sen-diri). Kenyataannya hipertensi merupakan
salah satu dari tujuh penyebab kematian
utama di dunia selain mengakibatkan
kerusakan pada organ jantung, otak dan
ginjal (1).
Di seluruh dunia hampir 1 miliar
orang dewasa atau sekitar se-perempat dari
seluruh populasi orang dewasa
menyandang hipertensi, jumlah ini
cenderung meningkat. Pada populasi usia
lanjut, angka penyandang hipertensi
lebih banyak dialami oleh lebih dari
separuh populasi usia di atas 60 tahun (2).
Kurang lebih 90 – 95 % hipertensi
ialah primer dan idiopatik (esensial) yang lebih banyak berhubungan dengan kelainan
genetik dan sisanya 5 % adalah hipertensi
sekunder (non esensial) yang kebanyakan berhubungan dengan penyakit ginjal,
stenosis arteri renalis (reno-vaskuler),
kelainan endokrin maupun gangguan
neurologik (2,3).
Beberapa penelitian sebelumnya
menunjukan bahwa inflamasi kronik
merupakan salah satu bagian terhadap
patogenesis vaskuler (4). Kelainan patologi
vaskuler dapat disebabkan oleh interaksi
antara sel imun dan dinding vaskuler yang
maladaptif yakni melalui aktivasi mediator
atau sitokin proinflamasi yang berlebihan
(abnormal). Pelepasan mediator inflamasi
yang abnormal ini diakibatkan oleh adanya
ekspresi gen yang tidak terkendali oleh
sistem imunitas yang ada. Salah satu
sitokin yang berperan penting pada proses
inflamasi vaskuler adalah Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) (5).
TNF-α adalah imunitas pleitropik
yang diproduksi monosit -makrofag, sel T
yang diaktifkan, sel NK, sel endotel dan
otot polos. TNF-α berperan penting dan
merupakan dasar yang sangat penting
dalam proses inflamasi vaskuler,
aterosklerosis dan infark miokard. Pada
kadar rendah TNF-α berperan terhadap sel
endotel dan pada kadar tinggi ber-peran
terhadap resistensi vaskuler (5).
PCR adalah suatu metode untuk
mengamplifikasi sekuens gen target secara
eksponensial in vitro dan telah berkembang
biologi molekuler yang dapat digunakan
untuk mendeteksi suatu ekspresi gen.
Selain itu juga PCR telah digunakan secara
luas dalam bidang kedokteran untuk analisa
berbagai penyakit menular, keganasan dan
kelainan genetika. Pada reaksi ini
dibutuhkan DNA target, sepasang primer,
polimerase DNA yang termostabil dan
buffer reaksi (6).
Berdasarkan latar belakang di atas,
maka diperoleh rumusan masalah dari
penelitian ini adalah apakah ada
peningkatan ekspresi gen TNF-α pada
individu hipertensi dibandingkan individu
normal dengan menggunakan metode
RT-PCR (12). Tujuan penelitian ini adalah
mendeteksi ekspresi gen TNF-α pada
individu hipertensi. Manfaat dari penelitian
ini diharapkan dapat menambah informasi
ilmiah mengenai peran gen TNF-α
terhadap perkembangan hipertensi dan
dapat dijadikan sebagai salah satu petunjuk
dalam penelitian hipertensi.
Desain Penelitian
Penelitian ini dilakukan secara
observasional dengan pendekatan Cross Sectional Study untuk mendeteksi adanya ekspresi gen TNF-α pada individu
hipertensi dan individu normotensi dengan
menggunakan metode RT-PCR (12,18).
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian telah dilakukan pada
bulan April hingga Mei 2013 dan
dilaksanakan di Laboratorium Biologi
Molekuler dan Imunologi, Fakultas
Kedokteran, Universitas Hasanuddin
Makassar.
Subjek dan Cara Pemilihan
Subjek penelitian meliputi semua
populasi terjangkau yang memenuhi
kriteria inklusi dan eksklusi. Pemeriksaan
ekspresi gen TNF-α dilakukan di
Laboratorium Biologi Molekuler dan
Imunologi, Bagian Mikrobiologi Fakultas
Kedokteran, Universitas Hasanuddin.
Kriteria sampel
1. Inklusi
Sampel berasal dari penderita yang telah
didiagnosa menderita hipertensi (≥ 140/90 mmHg).
2. Eksklusi
Penyakit kardiovaskuler, gagal ginjal,
diabetes melitus, kehamilan dan pasien
dalam terapi obat anti hipertensi dan
anti inflamasi.
Jenis sampel
Sampel dalam penelitian darah
normal (normotensi) yang memenuhi
kriteria serta bersedia diikutkan dalam
penelitian ini. Teknik pengambilan sampel
secara accidental sampling yaitu pengambilan sampel berdasarkan kejadian
atau kemunculan pada saat penelitian
berlangsung.
Perkiraan Besar Sampel
Besar sampel diperkirakan
berdasarkan rumus (16):
n =
keterangan :
- n = Besar sampel
- N = Besar proporsi populasi (27,33)
- d = Tingkat kepercayaan yang
diinginkan (ditetapkan), nilainya
(p) = 0,05
Data rekam medik yang diambil di
Rumah Sakit Wahidin Sudirohusodo,
menunjukkan bahwa jumlah keseluruhan
pasien hipertensi rawat jalan selama tahun
2012 adalah 328 orang (dengan proporsi
27.33).
Jadi n = = 25,29
dibulatkan menjadi 25 sampel
Definisi Operasional
1. TNF-α adalah sitokin proinflamasi
yang diproduksi oleh sel makrofag, sel
T yang diaktifkan, sel NK, sel endotel,
berperan penting dalam proses
inflamasi akut dan vaskuler (5).
2. PCR adalah metode untuk
mengamplifikasi sekuens gen target secara eksponensial in vitro menggunakan DNA target, primer dan
enzim polimerase (14).
Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam
penelitian ini adalah elektoforesis, mesin
PCR, gyraroty shaker, inkubator, mikropipet 10 µl,100 µl dan 1000 µl,
sentrifus, vortex dan oven.
2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan
dalam penelitian ini adalah sampel darah
vena individu hipertensi dan sampel darah
vena orang sehat (normotensi), buffer L6,
suspensi diatom, buffer L2, etanol 70 %,
aseton, destilat water, PCR mix, ethidium bromida, gel agarose 2 %, microcup, tabung eppendorf, primer yang terdiri atas (15,17) :
N
1 + N (d
2)
27,33
1. TNF-α :
5’-CAGCCTCTTCTCCTTCCTGAT-γ’ dan
5’GCCAGAGGGCTGATTAGAGA-γ’
2. -actin :
5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-γ’ dan
5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATT TC-3’
Prosedur Kerja
1. Pengukuran tekanan darah
Pasien dibiarkan rileks 5 menit
sebelum pengukuran tekanan darah. Atur
posisi tangan minimal sejajar dengan letak
jantung dan tidak terlalu rendah. Pasang
manset pada lengan atas 2 – 3 cm di atas
lipatan siku dan stetoskop pada arteri tepat
di bawah manset untuk mendengar bunyi
arteri. Pompa manset sampai pada tekanan
di antara tekanan sistolik dan tekanan diastolik yang terbaca pada skala (≥ 160 mmHg). Manset dikempiskan secara
perlahan-lahan sampai timbul bunyi. Bunyi
pertama kali terbaca sebagai tekanan
sistolik dan hilangnya bunyi pertama kali
terbaca sebagai tekanan diastolik,
kemudian catat hasil (2).
2. Pengambilan darah vena
Bersihkan tempat pengambilan
darah dengan alkohol 70% dan biarkan
kering kembali. Pasang pembendung pada
lengan atas, minta pasien agar mengepal
dan membuka tangannya berkali-kali agar
vena jelas terlihat. Tegangkan kulit dengan
menggunakan jari, agar vena tidak
bergerak. Tusuk kulit dengan jarum yang
terpasang pada holder. Ketika darah mulai
mengalir pembendung dilepaskan. Jika
volume darah telah mencukupi, tabung
darah dilepaskan dari holder. Letakkan
kapas di atas jarum dan jarum ditarik
perlahan-lahan. Pasien diminta menekan
tempat pengambilan darah dengan kapas,
kemudian diberi plester (7,8).
3. Pengambilan sampel
Sampel berupa darah vena yang
berasal dari individu hipertensi dan orang
normal, dimasukkan pada microcup yang berisi larutan buffer L6 sebanyak
masing-masing sebanyak 1-2 tetes.
4. Pemeriksaan PCR
a. Ekstrasi RNA TNF-α yang berasal dari darah vena penderita hipertensi dan orang normal dengan metode Boom.
Darah vena sebanyak 100 µl
ditambahkan 900 µl larutan buffer L6 dan
dihomogenkan pada gyraroty shaker. Campuran kemudian disentrifus dengan
kecepatan 12000 rpm selama 10 menit, lalu
ditambahkan 30 µl suspensi diatom
kemudian dilakukan vortex dan disentrifus
di dalam tabung eppendorf dengan
kecepatan 12000 rpm selama 30 detik.
Supernatan dipisahkan dan dicuci dengan
larutan L2 dan dilanjutkan dengan etanol
70 % sebanyak 2 kali dan aseton 1 kali.
Setelah itu dipanaskan pada suhu 56oC
pada oven selama 10 menit dan
ditambahkan 60 µl destilate water. Kemudian dilakukan vortex. Tabung
eppendorf tersebut diinkubasi dalam
oven pada suhu 56oC selama 10 menit,
kemudian disentrifus dengan kecepatan
12000 rpm selama 15 detik dan
dipindahkan ke dalam tabung eppendorf
yang baru. Supernatan dari proses ini
merupakan hasil ekstraksi yang
mengandung RNA dan disimpan pada suhu – 20oC untuk dilakukan analisa PCR
(10,13).
b. Amplifikasi RNA TNF-α dengan teknik RT-PCR
Hasil ekstraksi RNA sebanyak 2,5
µl ditambah 22,5 µl PCR mix dan
dimasukkan ke dalam tabung 250 µl.
Tabung dimasukkan dalam mesin PCR.
Program amplifikasi dibuat berlangsung
selama 40 siklus, yang tiap siklus terdiri
dari :
1. Denaturasi dengan jalan pemisahan
dari pasangan untai-DNA, pada
suhu 950 C selama 30 detik
2. Annaeling yaitu pengikatan primer
dengan untai-DNA yang sesuai
pada suhu 560 C selama 30 detik
3. Elongating yaitu perpanjangan
ikatan antara primer dengan
untai-DNA yang telah terikat, pada susu
720 C selama 30 detik
Hasil PCR kemudian dianalisa
dengan menggunakan metode
elektroforesis (6,14,15).
c. Analisa hasil PCR dengan metode Elektroforesis menggunakan gel agarose 2 %
Ke dalam tangki elektroforesis,
dimasukkan produk amplifikasi yang
ditambahkan larutan pengembang (gel loading buffer) sebanyak 2 µl lalu dimasukkan ke dalam sumur- sumur gel
agarosa. Elektroforesis dijalankan dengan
elektroda 220 volt, sehingga DNA akan
bergerak ke kutub positif. Hasil
elektroforesis dapat dilihat dengan bantuan
divisualisasikan dengan kamera. Pita DNA
dari sampel dibandingkan dengan pita
internal kontrol -actin. Hasil pemeriksaan
pada teknik PCR dikatakan positif yaitu
jika terbentuk pita DNA TNF-α pada
elektroforesis dengan pasangan basa (bp) 123 bp dan terbentuk pita internal kontrol -actin pada elektroforesis dengan
pasangan basa (bp) 540 bp (11,15).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Penelitian
Penelitian mengenai ekspresi gen
TNF-α pada penderita hipertensi dan
normotensi (normal) dengan metode
RT-PCR (Reverse Transciptase-PCR) telah dilakukan dengan jumlah 25 sampel.
Berdasarkan hasil yang diperoleh
menunjukan bahwa adanya ekspresi gen
TNF-α dimana peningkatan terjadi pada
sampel hipertensi nomor 1 dan 7 seperti
terlihat pada tabel 3.
Tabel 3. Sampel hipertensi berdasarkan umur, jenis kelamin dan tekanan darah
Pada tabel 4 menunjukan data
ekspresi gen TNF-α dari sampel darah
penderita hipertensi dimana nilai +1
sebanyak 2 orang dan +2, +3, +4, +5 tidak
ada (0).
Tabel 4. Data ekspresi gen TNF-α pada penderita hipertensi
Berdasarkan data tersebut
dilakukan perhitungan mean ekspresi gen
TNF-α dari sampel tersebut dengan hasil
yang diperoleh adalah 0,16 dan persentase
ekspresi gen TNF-α pada populasi
hipertensi (tabel 5).
Tabel 5. Persentase ekpresi gen TNF-α pada populasi hipertensi berdasarkan tekanan darah
Hasil uji PCR sampel penderita
hipertensi diperoleh peningkatan gen TNF-α sebanyak β dari 1β sampel orang (16,7 %), berdasarkan te-kanan darah
peningkatan terjadi pada tekanan darah
150/80 mmHg (8,33%) dan >160/90 mmHg
Hasil elektroforesis ditandai
dengan terbentuknya pita DNA TNF-α
pada pasangan basa sebesar 123 bp dan
terbentuknya pita internal kontrol -actin
pada elektroforesis dengan pasangan basa
sebesar 540 bp. Dimana sampel 1 dan 7 terlihat lebih tebal dibandingkan dengan
yang lainnya (gambar 3).
Gambar 3. Hasil Elektroforesis tampak pita TNF-α pada posisi 1βγ bp dan pita internal kontrol -actin pada posisi 540 bp dengan RT PCR. M=Marker; No.1-12 = sampel penderita hipertensi.
Secara keseluruhan pada individu
hipertensi terjadi peningkatan ekspresi gen
TNF-α sebanyak 16,7% (diagram 1)
Pada tabel 6 menunjukan hasil
pemeriksaan gen TNF-α dari sampel orang
normal (normotensi) sebanyak 13 sampel,
hasil yang diperoleh adalah tidak adanya
peningkatan ekspresi seperti pada individu
hipertensi
Tabel 6. Sampel orang normal berdasarkan umur, jenis kelamin dan tekanan darah
Tabel 7. Data ekspresi gen TNF-α pada orang normal (normotensi)
Berdasarkan data tersebut
dilakukan perhitungan mean ekspresi gen
TNF-α dari sampel tersebut dengan hasil
yang diperoleh adalah 0.
Hasil elektroforesis menunjukkan
tidak adanya penebalan pita DNA TNF-α
pada elektroforesis yang menunjukan
bahwa tidak adanya peningkatan ekspresi
(gambar 4).
Gambar 4. Hasil Elektroforesis tampak pita
TNF-α pada posisi 1βγ bp dan
pita internal kontrol -actin
pada posisi 540 bp dengan RT PCR. M=Marker; No.13-25 = sampel orang normal (normotensi)
Secara umum dari keseluruhan
populasi sampel baik hipertensi maupun
normal menunjukkan bahwa terjadi
peningkatan ekspresi sebanyak 8% yang
terdapat pada populasi hipertensi dan
sisanya 92 % tidak mengalami peningkatan
ekspresi yang sebagian besar terdapat pada
orang normal (tabel 8 dan diagram 2).
Tabel 8. Persentase ekpresi gen TNF-α pada populasi hipertensi dan normal
Pembahasan
Penelitian ini dilakukan pada bulan
Maret hingga April 2012 dengan
menggunakan 25 sampel yang berasal dari
penderita hipertensi dan orang normal
(normotensi) menggunakan metode
RT-PCR. Tujuan dari peneli-tian ini adalah
untuk melihat apakah ada peningkatan
ekspresi gen TNF-α pada penderita
hipertensi dibandingkan dengan orang
normal.
Pemilihan pemeriksan TNF-α
sebagai subyek penelitian karena selain
disintesis oleh sel endotel yang merupakan
penyusun utama tunika intima vaskuler
yang berperan dalam regulasi tekanan
darah (tahanan perifer) melalui produksi zat
vasoaktif salah satunya adalah Nitrit oksida
(NO) (7). Jika terjadi kerusakan pada sel
endotel maka TNF-α akan diekspresikan
sebagai mediator proinflamasi dan
transduksi sinyal antar sel. Kadar TNF-α
yang diekspresikan sebanding dengan
tingkat kerusakan yang ditimbulkan (5).
RT-PCR digunakan dalam
penelitian ini karena teknik tersebut dapat
menganalisis mRNA. mRNA yang
diekspresikan oleh gen TNF-α akan diubah
menjadi cDNA dengan menggunakan
enzim reverse transcriptase, baru kemudian dilakukan amplifikasi PCR. Pada penelitian
ini, -actin digunakan sebagai internal
kontrol untuk melihat kualitas dari
pemeriksaan PCR (18). -actin merupakan
housekeeping gene yang diekspresikan oleh semua jenis sel dan secara umum
ekspresinya tidak dipengaruhi oleh kondisi
eksperimental dan selalu hadir dalam
kondisi apapun (13,15).
Berdasarkan hasil yang diperoleh
bahwa pada sampel orang normal dengan tekanan darah yang normal (≤ 1β0/80 mmHg) tidak menunjukkan adanya
peningkatan. Hal ini sesuai teori bahwa
pada ke-adaan normal TNF-α merupakan
mediator non-preformed yang hanya dilepaskan pada saat dibutuhkan seperti
ketika tubuh terpapar benda asing atau
adanya gangguan dalam tubuh (abnormal)
(5,9).
Pada sampel hipertensi terjadi
peningkatan ekspresi gen TNF-α pada
tekanan darah yang tinggi yakni 150/80 –
160/90 mmHg. Hipertensi dapat terjadi
karena resistensi perifer sebagai akibat
disfungsi endotel atau sebaliknya. Kadar
TNF-α yang tinggi (≥ 10-7 M) diketahui
berperan penting terhadap resistensi perifer.
Tekanan darah yang tinggi dan persisten
dapat menimbulkan kerusakan berupa
resistensi perifer, kadar TNF-α yang
dilepaskan sebanding dengan tingkat
kerusakan yang terjadi (5). Berdasarkan hal
tersebut ekspresi TNF-α pada orang dengan
tekanan darah tinggi (hipertensi) lebih
banyak dibandingkan dengan orang dengan
tekanan darah normal (normotensi) maupun
rendah (hipotensi) (4,9,15).
Hal di atas belum bisa dijadikan
sebagai acuan yang pasti, karena dari hasil
penelitian pada sampel penderita hipertensi
dengan tekanan darah yang sama (150/80
mmHg) diperoleh bahwa tidak adanya
peningkatan ekpresi gen TNF-α.
mekanisme kerjanya, ekpresi gen TNF-α
diatur dan dipengaruhi oleh multifaktorial
seperti hormon (hormon steroid), molekul
sinyal (cAMP) dan peptida faktor
pertumbuhan termasuk sitokin IL-1
(Interleukin-1), 12 (Interleukin-12),
IL-10 (Interleukin-IL-10), IFN- (Interferon- )
dan VEGF (Vasculer endothelial Growth Factor) (16). Selain itu, regulasi ekspresi
TNF-α juga diinduksi oleh reseptor TNF-α
sendiri. Pengikatan TNF-α dengan
reseptornya (TNFR1 dan TNFR2)
menimbulkan amplifikasi sinyal TNF-α.
Sistem regulasi faktor-faktor tersebut
mempunyai kepekaan yang berbeda pada
setiap orang termasuk sistem imunitas.
Sehingga meskipun berada pada keadaan
tekanan darah yang sama, akan tetapi
respon tubuh dapat berbeda-beda. Selain
itu, tidak adanya peningkatan ekspresi gen
TNF-α dapat dipengaruhi oleh
antihipertensi dan antiinflamasi yang
dikonsumsi penderita hipertensi.
SIMPULAN DAN SARAN
1. Simpulan
Individu dengan hipertensi terjadi
peningkatan ekspresi gen TNF-α sebesar
8% dibandingkan dengan individu normal.
2. Saran
Perlu adanya penelitian untuk
melihat ekspresi sitokin anti-inflamasi pada
individu dengan hipertensi.
DAFTAR PUSTAKA
1. Beevers D. G. Tekanan Darah. Simbolon OH. Dian Rakyat. Jakarta. 2002. Hal 16 - 28
2. Palmer A, Williams B. Tekanan Darah Tinggi. Terjemahan oleh Yasmine E. Erlangga. Jakarta. 2005. Hal 10-59
3. Robbins, Cotran & Kumar. Dasar Patologi Penyakit. Ed. 5. Terjemahan oleh Tjarta A, Himawan S, Kurniawan AN, Sadikin V & Halim A. Jakarta; EGC. 1999. Hal 293 – 294
4. Boos CJ & Lip HJY. Is Hypertension an Inflammatory Process. Current Pharm. Design. 2006(12). pp. 1263, 1267 -1268
5. Baratawijaya KG. Imunologi Dasar. Ed. 7. Balai Penerbit FKUI. Jakarta. 2006. Hal 124, 384 – 389
6. Putra ST. Biologi Molekuler Kedokteran. Airlangga University Press. Surabaya. 1999. Hal 165
7. The Seven Report of The Joint of National Committee. Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure. JNC 7 Express. [diakses 9 Februari 2011]. Available
from :
8. Pickering TG, Hall JE, Appel LJ, Falkner BE, Graves J, Hill MN, et al. Recommendations For Blood Pressusre Measurement In Humans And Experimental Animals. [diakses 9 Februari 2011]. Available from : http://hyper.ahajournals.org/cgi/full/45/ 1/142
9. Whiteside TL. Introduction to Cytokines as Targets for Immunomodulation. In: House RV, Descotes J, editors. Cytokines in Human Health: Immunotoxicology, Pathology, and Therapeutic Applications. Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. 2007. Molekuler. Widya Padjadjaran. Bandung. 2008. Hal 52, 69-81
12. Hatta M. Advance Experimental in Medical Biology. Plenum Publisher. New York. 2003. pp 269-278. Available as PDF file
13. Boom R, Col CJA. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. Journal of Clinical Microbiology. New York. 1990 ;(28). pp 495-503. Available as PDF file 14. Yuwono T. Teori dan Aplikasi
Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi. Yogyakarta. 2006. hal. 10-16
15. Aust G. Competitive RT-PCR to Quantify Small Amounts of mRNA. In: De Ley M, editor. Cytokine Protocols.
Humana Press. Totowa. 2007. pp 31-40. Available as PDF file
16. Notoatmodjo S. Metodelogi Penelitian Kesehatan. Bingkai cipta. Jakarta. 2005. Hal 92
17. Buckingham L, Flaws ML. Molecular Diagnostics. Davis Company. New York. 2007. pp. 72-77,81
18. Guiletty A, Overbergh L. An Overview of Real-Time Quantitative PCR: Applications to Quantify Cytokine Gene Expression. Ideal. [serial on the internet]. 2001[dikutip 23 Februari 2011]; Vol.25 [8 screen]. Available from: http://www.idealibrary.com
LAMPIRAN 1 DNA Manusia untuk TNF-α
>tnf-a mRna-AK314960
1 agacgctccc tcagcaagga cagcagagga ccagctaaga gggagagaag caactacaga 61 ccccccctga aaacaaccct cagacgccac
atcccctgac aagctgccag gcaggttctc 121 ttcctctcac atactgaccc acggctccac
cctctctccc ctggaaagga caccatgagc 181 actgaaagca tgatccggga cgtggagctg
gccgaggagg cgctccccaa gaagacaggg 241 gggccccagg gctccaggcg gtgcttgttc
ctcagcctct tctccttcct gatcgtggca
301 ggcgccacca cgctcttctg cctgctgcac tttggagtga tcggccccca gagggaagag 361 ttccccaggg acctctctct aatcagccct ctggc
ccagg cagtcagatc atcttctcga
421 accccgagtg acaagcctgt agcccatgtt gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc 481 cagtggctga accgccgggc caatgccctc
ctggccaatg gcgtggagct gagagataac 541 cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac
ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc 601 caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc
661 taccagacca aggtcaacct cctctctgcc atcaagagcc cctgccagag ggagacccca 721 gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag
cccatctatc tgggaggggt cttccagctg 781 gagaagggtg accgactcag cgctgagatc
aatcggcccg actatctcga ctttgccgag 841 tctgggcagg tctactttgg gatcattgcc ctgtga
Forward : cagcctcttctccttcctgat
Reverse : gccagagggctgattagaga TCTCTAATCAGCCCTCTGGC (Complementary Reverse) // > best β-actin X00351
1 ttgccgatcc gccgcccgtc cacacccgcc gccagctcac catggatgat gatatcgccg 61 cgctcgtcgt cgacaacggc tccggcatgt
gcaaggccgg cttcgcgggc gacgatgccc 121 cccgggccgt cttcccctcc atcgtggggc
gccccaggca ccagggcgtg atggtgggca 181 tgggtcagaa ggattcctat gtgggcgacg
aggcccagag caagagaggc atcctcaccc 241 tgaagtaccc catcgagcac ggcatcgtca
ccaactggga cgacatggag aaaatctggc 301 accacacctt ctacaatgag ctgcgtgtgg
ctcccgagga gcaccccgtg ctgctgaccg 361 aggcccccct gaaccccaag gccaaccgcg
agaagatgac ccagatcatg tttgagacct 421 tcaacacccc agccatgtac gttgctatcc
aggctgtgct atccctgtac gcctctggcc 481 gtaccactgg catcgtgatg gactccggtg
acggggtcac ccacactgtg cccatctacg 541 aggggtatgc cctcccccat gccatcctgc
gtctggacct ggctggccgg gacctgactg 601 actacctcat gaagatcctc accgagcgcg
gctacagctt caccaccacg gccgagcggg 661 aaatcgtgcg tgacattaag gagaagctgt
gctacgtcgc cctggacttc gagcaagaga 721 tggccacggc tgcttccagc tcctccctgg
agaagagcta cgagctgcct gacggccagg 781 tcatcaccat tggcaatgag cggttccgct
gccctgaggc actcttccag ccttccttcc 841 tgggcatgga gtcctgtggc atccacgaaa
ctaccttcaa ctccatcatg aagtgtgacg 901 tggacatccg caaagacctg tacgccaaca
cagtgctgtc tggcggcacc accatgtacc
961 ctggcattgc cgacaggatg cagaaggaga tcactgccct ggcacccagc acaatgaaga 1021 tcaagatcat tgctcctcct gagcgcaagt
actccgtgtg gatcggcggc tccatcctgg 1081 cctcgctgtc caccttccag cagatgtgga
tcagcaagca ggagtatgac gagtccggcc 1141 cctccatcgt ccaccgcaaa tgcttctagg
cggactatga cttagttgcg ttacaccctt 1201 tcttgacaaa acctaacttg cgcagaaaac
aagatgagat tggcatggct ttatttgttt 1261 tttttgtttt gttttggttt tttttttttt tttggcttga
ctcaggattt aaaaactgga
1321 acggtgaagg tgacagcagt cggttggagc gagcatcccc caaagttcac aatgtggccg 1381 aggactttga ttgcacattg ttgttttttt
aatagtcatt ccaaatatga gatgcattgt 1441 tacaggaagt cccttgccat cctaaaagcc
accccacttc tctctaagga gaatggccca 1501 gtcctctccc aagtccacac aggggaggtg
atagcattgc tttcgtgtaa attatgtaat
1561 gcaaaatttt tttaatcttc gccttaatac ttttttattt tgttttattt tgaatgatga
1621 gccttcgtgc ccccccttcc ccctttttgt cccccaactt gagatgtatg aaggcttttg 1681 gtctccctgg gagtgggtgg aggcagccag
ggcttacctg tacactgact tgagaccagt 1741 tgaataaaag tgcacacctt a
Forward : gtggggcgccccaggcacca
Reverse : ctccttaatgtcacgcacgatttc GAAATCGTGCGTGACATTAAGGAG (Complementary Reverse)
