STRUKTUR BAHAN GENETIK, MEKANISME DAN REGULASI EKSPRESI GENETIK PADA ARAS MOLEKULAR
YONNY KOENTJORO NIM : T651408012
DOSEN PENGAMPU : Dr. Ir. PARJANTO.
PROGRAM DOKTOR ILMU PERTANIAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET
2015
I. PENDAHULUAN
1.1. Sejarah Perkembangan Biologi Molekuler
Istilah biologi molekular pertama kali dikemukakan oleh William Astbury pada tahun 1945. Pengertian biologi molekular pada saat ini merupakan ilmu yang mempelajari fungsi dan organisasi jasad hidup (organisme) ditinjau dari struktur dan regulasi molekular unsur atau komponen penyusunnya. (Yuwono, 2010).
Biologi Molekuler merupakan cabang ilmu biologi yang mempelajari hubungan antara struktur dan molekul-molekul serta peranannya dalam pengendalian berbagai mekanisme proses biokimia. Meskipun ilmu Biologi Molekuler masih tergolong baru tetapi perkembangannya sudah sangat pesat dalam tiga dasa warsa terakhir. Berbagai penemuan-penemuan spektakuler tentang karakteristik gen dan pewarisan sifat telah banyak dipublikasikan. Ketika Mendell mempublikasikan hasil pengamatannya tentang sifat pewarisan pada tanaman Pisum sativum masih belum banyak ahli yang tertarik sampai Mendell meninggal, awal abad 20 penemuan Mendell tersebut secara kebetulan diteliti kembali oleh Hugo de Vries, Carl Correns dan Erich Von Tschermark yang menguji teorinya masing-masing. Sejak itu ilmu genetika berkembang pesat.
Sejak karya Mendell ditemukan kembali maka dasar-dasar genetika mulai berkembang pesat sehingga muncul cabang baru yaitu Genetika Populasi yaitu cabang ilmu yang mempelajari faktor-faktor yang mempengaruhi struktur genetik suatu populasi.
Sewall Wright (Amerika), Sir Ronald Fisher (Inggris) adalah perintis genetika populasi, selain itu dalam genetika populasi terdapat hukum yang sangat terkenal yaitu Hukum Hardy-Weinberg yang menerangkan bahwa dalam kondisi tertentu frekuensi Alel adalah konstan dari generasi ke generasi.
Genetika Molekuler mulai berkembang sejak diketahui oleh para ahli bahwa gen terletak dalam kromosom dan para ahli terus mengembangkan pengetahuan genetika molekuler untuk mengetahui struktur fisik dan kimia dari gen yang dianggap sangat penting dalam sistem informasi gen terutama yang terkait dengan sistem pewarisan sifat.
Sejak itu berkembang pula pengetahuan tentang bagaimana mekanisme munculnya suatu sifat fenotip tertentu, kelainan atau perbedaan sifat yang mula-mula hanya diterangkan melalui parameter jumlah, sifat morfologi atau struktur lainnya, sifat kromosom (sitogenetika), yang sekarang dijelaskan pada tingkat molekuler sehingga dapat dilakukan rekayasa terhadap sifat genetik dari suatu organisme (Irawan, 2008).
Dengan berkembangnya genetika molekuler maka perbaikan sifat tumbuhan atau ternak sekarang memiliki cara alternatif yaitu jalur perkawinan konvensional atau jalur rekayasa genetik. Permasalahan pada jalur konvensional adalah memerlukan waktu yang cukup lama, misal : untuk membuat galur tanaman jagung membutuhkan waktu kurang lebih 6 – 7 tahun. Sedang permasalahan dengan rekayasa genetik pada umumnya berkisar pada kendala etika moral dan keamanan. Etika dan moral muncul bila gen yang direkayasa menyangkut gen manusia atau organisme yang dimanfaatkan manusia untuk kebutuhannya (pangan). Dari segi keamanan umumnya mempertanyakan apakah organisme yang direkayasa tetap dapat terkontrol dan apakah gen hasil rekayasa tidak pindah ke organisme lain yang dikehendaki ?.
Pendekatan molekuler dalam biologi dan akan sangat mempengaruhi tiap disiplin ilmu dalam biologi seperti : Histologi, Sitologi ,Anatomi,Embriologi, Genetika, fisiologi, evolusi. Perbedaannya adalah, pada saat itu para ahli biologi dalam studinya menggunakan sel-sel prokariotik, terutama suatu tipe bakteri Eschericia coli. Berbeda dengan waktu ini yang menggunakan sel eukariotik. Tetapi kebanyakan sifat-sifat yang menyebabkan organisme tingkat tinggi berbeda dengan bakteri sekarang sudah dapat ditunjukkan pada tingkat molekuler.
Pada akhir abad ke-19 timbul 2 teori, yaitu teori evolusi dan teori sel, yang mendorong adanya konversi dalam biologi dari masa lalu yang observasional menjadi ilmu eksperimental yang aktif.dalam teori evolusinya, Darwin dan Wallace melihat ketidaktetapan dunia hayati. Mereka mengajukan hipotesa bahwa perubahan-perubahan massa tanah, fluktuasi suhu dan hujan lokal, dan perubahan iklim jangka lama, merupakan penyebab ‘seleksi alam’. Di lingkungan selektif itu dapat muncul jenis-jenis baru, sedang jenis –jenis lama yang tidak bisa menyesuaikan diri akan mati.
Pada akhir abad ke-17 ahli berkebangsaan Belanda, Anton Van Leeuwenhoek, membuat mikroskop yang pertama. Alat ini menunjukkan padanya adanya partikel- partikel kecil yang tidak dapat dilihat dengan mata biasa. Pada waktu yang hampir bersamaan, Robert Hooke mengamati unitunit mikroskopik yang menyusun gabus, suatu jaringan mati. Ia menamakan unit-unit tersebut sel. Setelah mikroskop yang modern, teknik-teknik pengawetan jaringan, serta alat-alat untuk membuat irisan tipis telah ada pada awal abad ke-19 para penyelidik tidak hanya melihat bahwa jaringan disusun oleh unit-unit sel, tetapi juga bahwa sel-sel dapat membelah. Mulailah diketahui bahwa tiap sel menunjukkan kehidupan. Hingga dapat dinyatakan bahwa ada satu prinsip universal
mengenai perkembangan untuk bagian-bagian dasar pada organisme, walaupun berbeda, dan prinsip ini adalah pembentukan sel-sel.
Kemajuan ilmu pengetahuan dalam bidang bioteknologi, khususnya pada biologi molekuler membuka peluang penggunaannya dalam memecahkan berbagai permasalahan, Penggunaan biologi molekuler (genetika molekuler) pada tanaman telah banyak berperan dalam membantu memecahkan berbagai masalah dalam pemuliaan tanaman. Pemuliaan tanaman konvensional lebih banyak menggunakan hasil observasi fenotipe dan tidak jarang didukung perhitungan statistika yang rumit dalam melakukan seleksi individu unggul pada suatu populasi tanaman. Tugas ini akan menjadi terkesan sulit karena kerumitan genetika pada sifat-sifat agronomis yang sering pula terkait interaksi dengan faktor lingkungan. Oleh karena itu pemuliaan tanaman di masa mendatang akan lebih mengarah kepada penggunaan teknik dan metodologi pemuliaan molekuler dengan menggunakan penanda genetik. (Sudarmi, 2013).
II. BAHAN GENETIK DAN STRUKTUR GEN
2.1 Bahan Genetik
Materi genetik merupakan materi (bahan) yang bertanggung jawab terhadap sistem informasi genetik (pewarisan sifat) atau mengandung informasi biologi yang mempunyai fungsi genetik antara lain : Fungsi menyimpan informasi genetik dalam sistem pewarisan sifat secara tepat (genotipe / replikasi) dan fungsi mengendalikan organisme (fungsi fenotipe/ ekspresi gen). Menurut konsep Mendellian, suatu gen digambarkan sebagai suatu unit penurunan sifat yang mempunyai ciri-ciri tersendiri yang mempengaruhi karakter fenotipik (Fincham, 1990). Awalnya setelah para ilmuwan menyepakati bahwa gen terdapat dalam kromosom dan kromosom tersusun dari protein dan DNA, semenjak itu muncul pertanyaan manakah yang merupakan bahan genetik atau bahan yang membawa informasi biologi ? sehingga sekarang telah diketahui bahwa DNA (asam nukleat) merupakan bahan genetik yang membawa informasi biologi sehingga mematahkan pendapat sebelumnya bahwa protein adalah sebagai bahan pembawa informasi.
Sebelum tahun 1930 an informasi tentang DNA sangat terbatas, sementara itu telah banyak diketahui bahwa protein merupakan suatu kimia yang kompleks yang tersusun dari asam amino dalam bentuk rantai polimer. Asam amino sendiri terdapat 20 jenis susunan asam amino dalam polimer tersebut sangat bervariasi. Sedangkan DNA pada waktu itu hanya dianggap sebagai senyawa yang sederhana dengan berat molekul 1227, dan setiap molekulnya dianggap memiliki struktur yang sama sehingga pada saat itu DNA dianggap tidak memenuhi syarat sebagai bahan pembawa genetik.
Saat ini disepakati oleh para ahli bahwa pengertian Asam deoksiribonukleat atau DNA didefinisikan sebagai molekul yang mengkode informasi genetik yang diperlukan untuk pengembangan dan berfungsinya semua organisme hidup. DNA adalah molekul ganda yang memiliki informasi untuk faktor-faktor seperti pertumbuhan, Divisi dan fungsi sel. DNA adalah berbentuk heliks ganda. DNA adalah polimer nukleotida dengan kode bolak balik urutan asam amino selama proses sintesis protein. DNA membawa informasi genetik pada gen yang diperlukan untuk membangun molekul seperti protein.
Perkembangan penelitian tentang DNA terus berkembang setelah tahun 1930 an saat itu mulai diketahui bahwa DNA bukanlah molekul yang sederhana dan akhirnya disepakati bahwa DNA memenuhi persyaratan-persyaratan sebagai bahan pembawa informasi genetis (biologi) antara lain :
a. Harus mampu hadir dalam berbagai variasi b. Harus dapat menyimpan informasi
c. Harus dapat mengekspresikan informasinya d. Harus dapat melakukan replikasi
e. Harus dapat bermutasi.
Secara umum bahan genetik dari organisme hidup adalah DNA terkecuali pada beberapa Virus, TMV yang memilliki bahan genetik RNA. Gen terletak dalam kromosom dan dapat diwariskan tetua kepada anaknya melalui pembentuk sel kelamin dan fertilisasi, dan kromosom sendiri terdiri dari asam nukleat (DNA) dan protein, sistem informasi pewarisan sifat terdapat dalam asam nukleat (DNA) sehingga DNA adalah bahan genetik yang mengatur dan bertanggung jawab dalam mekanisme pewarisan sifat suatu organisme. DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu:
a. Gugus fosfat
b. Gula deoksiribosa
c. basa nitrogen, yang terdiri dari:
o Adenina (A)
o Guanina (G)
o Sitosina (C)
o Timina (T)
Sebuah unit monomer DNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehingga DNA tergolong sebagai polinukleotida. Rantai DNA memiliki lebar 22-24 Å, sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 Å. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai.
Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang- seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa.
Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya.
DNA terdiri atas dua untai benang polinukleotida yang saling berpilin membentuk struktur heliks ganda. Seutas polinukleotida pada molekul DNA tersusun atas rangkaian nukleotida. Setiap nukleotida tersusun atas:
1. Gugusan gula deoksiribosa (gula pentosa yang kehilangan satu atom oksigen) 2. Gugusan asam fosfat yang terikat pada atom C nomor 5 dari gula)
3. Gugusan basa nitrogen yang terikat pada atom C nomor 1 dari gula
Ketiga gugus tersebut saling terkait dan membentuk “tulang punggung” yang sangat panjang bagi heliks ganda. Strukturnya dapat diibaratkan sebagai tangga, dimana ibu tangganya adalah gula deoksiribosa dan anak tangganya adalah susunan basa nitrogen. Sedangkan fosfat menghubungkan gula pada satu nukleotida ke gula pada nukleotida berikutnya untuk membentuk polinukleotida.
Basa nitrogen penyusun DNA terdiri dari basa purin, yaitu adenin (A) dan guanin (G), serta basa pirimidin yaitu sitosin atau cytosine (C) dan timin (T). Ikatan antara gula pentosa dan basa nitrogen disebut nukleosida. Ada 4 macam basa nukleosida yaitu :
1. Ikatan A-gula disebut adenina atau adenosin deoksiribonukleosida (deoksiadenosin)
2. Ikatan G-gula disebut guanina atau guanosin deoksiribonukleosida (deoksiguanosin)
3. Ikatan C-gula disebut sitosina atau sitidin deoksiribonukleosida (deoksisitidin)
4. Ikatan T-gula disebut timina atau timidin deoksiribonukleosida (deoksiribotimidin)
Ikatan asam-gula-fosfat disebut sebagai deoksiribonukleotida atau sering disebut nukleotida. Ada 4 macam deoksiribonukleotida, yaitu adenosin deoksiribonukleotida, timidin deoksiribonukleotida, sitidin deoksiribonukleotida, timidin deoksiribonukleotida. Nukleotida-nukleotida itu membentuk rangkaian yang disebut polinukleotida. DNA terbentuk dari dua utas polinukleotida yang saling berpilin. Penggabungan nukleotida-nukleotida tersebut melalui ikatan fosfodiester (gambar 2.1).
Gambar 2.1. Struktur Polinukleotida dalam DNA.
Dalam kondisi normal (kondisi fisiologis), DNA relatif stabil, kadang menjadi tidak stabil yang dikarenakan adanya proses-proses replikasi dan transkripsi. Antara basa nitrogen satu dengan yang lain dihubungkan dengan ikatan hidrogen . Watson and Crick menyatakan bahwa replikasi DNA sangat mungkin untuk suatu DNA diperbanyak dengan informasi yang sama. Disosiasi double helix DNA yaitu denaturasi yang terjadi apabila DNA dipanaskan diatas melting temperaturnya (Tm) maka double helix akan terbuka. Tm tergantung pada rasio (G+C)/(A+T). G/C content dapat dihitung dengan (G+C) / (Total Basa N) x 100%. Dalam molekul DNA terdapat 2 rantai nukleotida yg membentuk double helix, dengan arah yang berlawanan. Kedua rantai ini berikatan dengan ikatan hidrogen antara A-T (2 ) dan G-C (3). Bila satu pita 5‟-ATGC-3‟, maka pasangan komplementernya adalah 5‟- GCAT-3‟ dan bukan 5‟-TACG-3‟.
CHARGAFF‟S RULES :
a. Komposisi basa dari DNA suatu organisme adalah tetap pada semua sel nya dan mempunyai karakteristik tertentu.
b. Komposisi basa dari DNA bervariasi dari suatu organisme dengan organisme lainnya dinyatakan dengan dissymmetry ratio : (A + T) / (G + C).
c. Komposisi basa dari suatu spesies tidak berubah oleh umur, keadaan nutrisi, ataupun lingkungan.
d. Jumlah adenin dalam DNA suatu organisme selalu sama dengan jumlah timin (A = T).
UJUNG 5’ (5’-P) BASA-1
Ikatan
fosfodiester
BASA-2
BASA-3
UJUNG 3’ (3’-OH)
OH
e. Jumlah guanin dalam DNA suatu organisme selalu sama dengan jumlah sitosin (G=C).
f. Jumlah total basa purin dalam DNA suatu organisme selalu sama dengan jumlah total basa pirimidin: (A + G) = (T + C).
Dalam Chargaff‟s Rules Adenine selalu berpasangan dengan Thymine dan Guanine selalu berpasangan dengan Cytosine (Gambar 2.2.)
Gambar 2.2. Chargaff‟s Rules
Peranan DNA dalam proses genetik tidak hanya berdasar pada struktur kimianya saja melainkan juga hubungan struktur dan fungsinya. James Watson dan Francis Crick pada tahun 1953 mengemukakan hipotesis sifat pilinan berganda DNA yang kemudian dikenal dengan Double Helical Nature of DNA. Asam Nukleat (DNA) mempunyai fungsi antara lain :
1. DNA mengatur sel untuk membuat protein-protein yang spesifik (fenotipe), oleh karena itu DNA mengendalikan semua fungsi kehidupan
2. DNA merupakan materi penyimpan informasi pewarisan sifat suatu individu 3. DNA bisa mengalami mutasi (berubah), hal ini menyebabkan munculnya
karakteristik (sifat) baru (keragaman) sehingga fungsi ini membantu mahluk hidup untuk dapat beradaptasi sehingga dapat bertahan dan melakukan reproduksi (evolusi).
4. DNA mampu melakukan replikasi (meng-copy) dirinya sendiri.
2.2. Struktur DNA
DNA sebagian besar tersusun dari dua untai yang menggulung dan membentuk heliks ganda (double helix). Untai DNA terbuat dari urutan nukleotida, nukleotida yang terdiri dari basa nitrogen, gula monosakarida dan gugus fosfat. Nukleotida terhubung satu sama lain oleh ikatan kovalen antara gula dan gugus fosfat yang mengakibatkan tulang punggung gula-fosfat bergantian. DNA menyimpan informasi, kedua untai DNA menyimpan informasi biologis yang sama.
G C
T A
Untai DNA anti paralel dan berlawanan satu sama lain. DNA diatur ke dalam kromosom di dalam sel-sel. Selama proses pembelahan sel, DNA direplikasi dalam proses replikasi DNA yang memberikan setiap sel sendiri set kromosom. Organisme eukariotik menyimpan DNA mereka dalam inti sel dan juga dalam komponen lain seperti mitokondria dan kloroplas. Dalam prokariota, DNA yang menyebar di dalam sitoplasma.
Struktur DNA terbagi dalam 2 (dua) katagori yaitu :
1. Struktur utama : DNA adalah urutan polimer yang terdiri dari sub unit nukleotida. Nukleotida DNA terbuat dari gula (deoksiribosa), basa nitrogen dan gugus fosfat. Basa Nitrogen dari empat jenis yang hadir dalam molekul DNA adalah, adenin, guanina, Sitosina dan guanina, molekul gula adalah gula karbon 5 karbon dan satu atau lebih gugus fosfat. Adenin dan guanina adalah nitrogen basa Purina, Sitosina dan Timina adalah Pirimidina. Ikatan phosphodiester yang dibentuk dengan gugus fosfat basa nitrogen dengan kelompok OH pada gula. Urutan asam nukleat pada nukleotida saling melengkapi satu sama lain dalam urutan untai DNA.
2. Struktur Sekunder : Sekunder struktur DNA adalah interaksi antara basa, dengan helai terikat satu sama lain.
a. Dalam struktur heliks ganda DNA, helai yang dibuat bersama oleh ikatan hidrogen, dimana nukleotida pada untai salah satu pasangan dengan nukleotida pada untai yang lain.
b. Struktur sekunder memberikan bentuk asam nukleat. Basa Purina berpasang dengan pirimidin oleh ikatan hidrogen.
c. Struktur sekunder menentukan dasar-pemasangan helai untuk membentuk heliks ganda.
d. Alur utama dan alur kecil dibentuk dalam dua heliks ganda. Untai DNA tidak simetris dengan satu sama lain alur tidak adil.
Total bahan genetik (gen) yang mengendalikan keseluruhan metabolisme pada suatu jasad hidup disebut GENOM. Pada eukariot jumlah kromosom umumnya ganda, maka total gen diartikan sbg total gen pada jumlah kromosom haploid.
Jumlah gen dalam suatu genom berbeda-beda (bervariasi) antara organisme hidup satu dengan yang lainnya. Semakin kompleks suatu organisme hidup maka semakin banyak jumlah gen yang terkandung di dalam genom. Banyaknya bahan
genetik dalam suatu organisme dinyatakan dalam panjang DNA atau jumlah pasangan basa (bp = base pair).
Salah satu perbedaan fundamental antara struktur sel organisme prokariot dan eukariot adalah pada organisasi bahan genetiknya. Pada kelompok eukariot, umumnya hanya ada satu unit bahan genetik utama yang membawa semua informasi genetik yang diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan jasad tersebut. Semua unit bahan genetik merupakan satu kesatuan genom yang merupakan kelangsungan makhluk hidup. Virus yang merupakan jasad paling sederhana menunjukkan organisasi genom yang paling efisien dibandingkan dengan prokariot dan eukariot (Yuwono, 2010). Kompleksitas yang dimiliki oleh setiap materi genetik yang dimiliki oleh prokariot, eukariot, dan virus mendorong kita untuk lebih mengetahui perbedaannya. Fenomena lain yang sangat menarik dalam hal organisasi genom adalah sistem pengemasan bahan genetik yang sangat efisien pada setiap jasad hidup.
Meskipun ukuran bahan genetiknya jauh lebih panjang dibanding ukuran sel atau ukuran partikelnya, namun bahan genetik tersebut dapat dikemas sedemikian rupa sehingga hanya menempati sebagian kecil ruang di dalam sel.
Gambar 2.3. Struktur Double Helix DNA
Gambar 2.4. Sel Prokariot dan Eukariot
2.3. Replikasi DNA
Replikasi DNA adalah proses penggandaan rantai ganda DNA. Pada sel, replikasi DNA terjadi sebelum pembelahan sel. Prokariota terus-menerus melakukan replikasi DNA. Pada eukariota, waktu terjadinya replikasi DNA sangatlah diatur, yaitu pada fase S siklus sel, sebelum mitosis atau meiosis I. Penggandaan tersebut memanfaatkan enzim DNA polimerase yang membantu pembentukan ikatan antara nukleotida-nukleotida penyusun polimer DNA. Proses replikasi DNA dapat pula dilakukan in vitro dalam proses yang disebut reaksi berantai polimerase (PCR).
2.3.a. Model Replikasi DNA
DNA merupakan molekul hidup karena mampu melakukan penggandaan diri (replikasi). Fungsi ini disebut fungsi autokatalisis karena DNA mampu mensistesis dirinya sendiri. Replikasi merupakan peristiwa sintesis DNA. Replikasi DNA dapat terjadi dengan adanya sintesis rantai nukleotida baru dari rantai nukleotida lama.
Prosesnya dengan menggunakan komplementasi pasangan basa untuk menghasilkan suatu molekul DNA baru yang sama dengan molekul DNA lama. Proses yang terjadi tersebut dipengaruhi oleh enzim helikase, enzim polimerase, dan ligase. Ada tiga kemungkinan terjadinya replikasi DNA, yaitu konservatif, semikonservatif, dan dispersif.
a. Model konservatif, yaitu dua rantai DNA lama tetap tidak berubah, berfungsi sebagai cetakan untuk dua rantai DNA baru. Replikasi ini mempertahankan molekul dari DNA lama dan membuat molekul DNA baru.
b. Model semikonservatif, yaitu dua rantai DNA lama terpisah dan rantai baru disintesis dengan prinsip komplementasi pada masing-masing rantai DNA lama.
Akhirnya dihasilkan dua rantai DNA baru yang masing-masing mengandung satu rantai cetakan molekul DNA lama dan satu rantai baru hasil sintesis.
c. Model dispersif, yaitu beberapa bagian dari kedua rantai DNA lama digunakan sebagai cetakan untuk sintesis rantai DNA baru. Oleh karena itu, hasil akhirnya diperoleh rantai DNA lama dan baru yang tersebar pada rantai DNA lama dan baru. Replikasi ini menghasilkan dua molekul DNA lama dan DNA baru yang saling berselang-seling pada setiap untai.
Gambar 2.5. Model Replikasi DNA
Replikasi terjadi dengan proses semi konservatif karena semua DNA double helix. Hasil replikasi DNA double strand. Kedua DNA parental strand bisa menjadi template yang berfungsi sebagai cetakan untuk proses replikasi: Semikonservaative process. Primer strand : Pada 3‟ dia akan melepaskan 2P dipakai sebagai energy untuk menempelkan, tetapi pada 5‟ P tidak bisa dilepas karena ketiga P dibutuhkan sehigga tidak ada energi sehingga tidak pernah terjadi sintesis dari 3‟-5‟, tetapi dari 5‟-3‟, jadi yang menambah selalu ujung 3‟.
2.3.b. Tahapan Replikasi DNA
Proses replikasi DNA merupakan suatu masalah yang kompleks, dan melibatkan set protein dan enzim yang secara kolektif merakit nukleotida dalam urutan yang telah ditentukan. Dalam menanggapi isyarat molekul yang diterima selama pembelahan sel, molekul-molekul ini melakukan replikasi DNA, dan mensintesis dua untai baru menggunakan helai yang ada sebagai template atau
„cetakan‟. Masing-masing dua resultan, molekul DNA yang identik terdiri dari satu untai baru lama dan salah satu DNA. Oleh karena itu proses replikasi DNA disebut sebagai semi-konservatif.
Rangkaian peristiwa yang terjadi selama replikasi DNA prokariotik telah dijelaskan di bawah ini.
1. Inisiasi
Pelepasan untai DNA
Replikasi DNA dimulai pada lokasi spesifik disebut sebagai asal replikasi, yang memiliki urutan tertentu yang bisa dikenali oleh protein yang disebut inisiator DnaA. Mereka mengikat molekul DNA di tempat asal, sehingga mengendur untuk docking protein lain dan enzim penting untuk replikasi DNA. Sebuah enzim yang disebut helikase direkrut ke lokasi untuk unwinding (proses penguraian) heliks dalam alur tunggal.
Helikase melepaskan ikatan hidrogen antara pasangan basa, dengan cara yang tergantung energi. Titik ini atau wilayah DNA yang sekarang dikenal sebagai garpu replikasi (Garpu replikasi atau cabang replikasi adalah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi). Setelah heliks yang unwound, protein yang disebut untai tunggal mengikat protein (SSB) mengikat daerah unwound, dan mencegah mereka untuk annealing (penempelan). Proses replikasi sehingga dimulai, dan garpu replikasi dilanjutkan dalam dua arah yang berlawanan sepanjang molekul DNA.
Gambar 2.6. Tahapan Iniasi
2. Sintesis Primer Sintesis DNA Primer
Sintesis baru, untai komplementer DNA menggunakan untai yang ada sebagai template yang dibawa oleh enzim yang dikenal sebagai DNA polimerase. Selain replikasi mereka juga memainkan peran penting dalam perbaikan DNA dan rekombinasi. Namun, DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis DNA secara independen, dan membutuhkan 3′ gugus hidroksil untuk memulai penambahan nukleotida komplementer. Ini disediakan oleh enzim yang disebut DNA primase yang merupakan jenis DNA dependent-RNA polimerase. Ini mensintesis bentangan pendek RNA ke untai DNA yang ada. Ini segmen pendek disebut primer, dan terdiri dari 9-12 nukleotida. Hal ini memberikan DNA polimerase platform yang diperlukan untuk mulai menyalin sebuah untai DNA. Setelah primer terbentuk pada kedua untai,
DNA polimerase dapat memperpanjang primer ini menjadi untai DNA baru.
Unwinding DNA dapat menyebabkan supercoiling (bentukan seperti spiral yang mengganggu) di wilayah berikut garpu. Ini superkoil DNA Unwinding oleh enzim khusus yang disebut topoisomerase yang mengikat ke bentangan DNA depan garpu replikasi. Ini menciptakan nick di untai DNA dalam rangka untuk meringankan supercoil tersebut.
Gambar 2.7. Sintesis DNA Primer
3. Sintesis leading strand
Replikasi DNA untaian pengawal (leading strand)
DNA polimerase dapat menambahkan nukleotida baru hanya untuk ujung 3
„dari untai yang ada, dan karenanya dapat mensintesis DNA dalam arah 5′ → 3 „saja.
Tapi untai DNA berjalan di arah yang berlawanan, dan karenanya sintesis DNA pada
satu untai dapat terjadi terus menerus. Hal ini dikenal sebagai untaian pengawal (leading strand).
Di sini, DNA polimerase III (DNA pol III) mengenali 3 „OH akhir primer RNA, dan menambahkan nukleotida komplementer baru. Seperti garpu replikasi berlangsung, nukleotida baru ditambahkan secara terus menerus, sehingga menghasilkan untai baru.
Gambar 2.8. Sintesis Leading Strand 4. Sintesis lagging Strand (untai tertinggal)
Pada untai berlawanan, DNA disintesis secara terputus dengan menghasilkan serangkaian fragmen kecil dari DNA baru dalam arah 5 „→ 3′. Fragmen ini disebut fragmen Okazaki, yang kemudian bergabung untuk membentuk sebuah rantai terus menerus nukleotida. Untai ini dikenal sebagai lagging Strand (untai tertinggal) sejak proses sintesis DNA pada untai ini hasil pada tingkat yang lebih rendah.
Gambar 2.9. Sintesis lagging Strand
Di sini, primase menambahkan primer di beberapa tempat sepanjang untai unwound. DNA pol III memperpanjang primer dengan menambahkan nukleotida baru, dan jatuh ketika bertemu fragmen yang terbentuk sebelumnya. Dengan demikian, perlu untuk melepaskan untai DNA, lalu geser lebih lanjut up-stream
untuk memulai perluasan primer RNA lain. Sebuah penjepit geser memegang DNA di tempatnya ketika bergerak melalui proses replikasi.
5. Penghapusan Primer
Meskipun untai DNA baru telah disintesis primer RNA hadir pada untai baru terbentuk harus digantikan oleh DNA. Kegiatan ini dilakukan oleh enzim DNA polimerase I (DNA pol I). Ini khusus menghilangkan primer RNA melalui „5→ 3′
aktivitas eksonuklease nya, dan menggantikan mereka dengan deoksiribonukleotida baru oleh 5 „→ 3′ aktivitas polimerase DNA.
Gambar 2.10. Penghapusan primer RNA 6. Ligasi
Setelah penghapusan primer selesai untai tertinggal masih mengandung celah atau nick antara fragmen Okazaki berdekatan. Enzim ligase mengidentifikasi dan segel nick tersebut dengan menciptakan ikatan fosfodiester antara 5 „fosfat dan 3′
gugus hidroksil fragmen yang berdekatan.
Gambar 2.11. Tahapan Ligasi
7. Pemutusan (terminasi)
Replikasi mesin ini menghentikan di lokasi terminasi khusus yang terdiri dari urutan nukleotida yang unik. Urutan ini diidentifikasi oleh protein khusus yang disebut tus yang mengikat ke situs tersebut, sehingga secara fisik menghalangi jalur helikase. Ketika helikase bertemu dengan protein situs itu jatuh bersama dengan terdekat untai tunggal protein pengikat.
Gambar 2.12. Tahapan Pemutusan
III. MEKANISME EKSPRESI GENETIK
Ekspresi gen merupakan proses dimana informasi dari gen yang digunakan dalam sintesis produk gen fungsional. Produk-produk ini seringkali protein, tetapi dalam non-protein coding gen seperti gen rRNA atau gen tRNA, produk adalah RNA fungsional. Proses ekspresi gen digunakan oleh semua kehidupan yang dikenal - eukariota (termasuk organisme multisel), prokariota (bakteri dan archaea) dan virus - untuk menghasilkan mesin makromolekul untuk hidup. Ekspresi gen juga berarti pengungkapan faktor genetik (gen) menjadi fenotipe atau penerjemahan urutan nukleotida (basa-N) DNA menjadi urutan asam amino protein.
3.1. Proses Ekspresi Gen
Mekanisme ekspresi gen mengikuti aliran (transfer) yang dikenal dengan istilah Dogma Sentral Biologi Molekuler yang merupakan suatu kerangka (pola) kerja untuk memahami urutan transfer informasi antara biopolymer (DNA, RNA, protein) dengan cara yang paling umum dalam suatu organisme hidup. Secara garis besar, dogma sentral maksudnya adalah semua informasi terdapat pada DNA yang kemudian akan digunakan untuk menghasilkan molekul RNA melalui transkripsi, dan sebagian informasi pada RNA tersebut akan digunakan untuk menghasilkan protein melalui proses yang disebut translasi sehingga pada dasarnya ekspresi gen mencakup 2 (dua) proses pokok yaitu : Transkripsi dan Translasi.
3.1.1. Transkripsi
Transkripsi merupakan tahapan awal dalam proses sintesis protein yang nantinya proses tersebut akan berlanjut pada ekspresi sifat-sifat genetik yang muncul sebagai fenotip. Untuk mempelajari biologi molekuler tahap dasar yang harus di ketahui adalah bagaimana mekanisme sintesis protein sehingga dapat terekspresi sebagai fenotip. Transkripsi juga merupakan proses sintesis molekul RNA pada DNA sebagai pola cetakan. Proses ini terjadi pada inti sel / nukleus (pada organisme eukariotik. sedangkan pada organisme prokariotik berada di sitoplasma karena tidak memiliki inti sel) tepatnya pada kromosom.
Sebuah rantai DNA digunakan untuk mencetak rantai tunggal mRNA dengan bantuan enzim polimerase. Enzim tersebut menempel pada kodon permulaan, umumnya adalah kodon untuk asam amino metionin. Pertama-tama, ikatan hidrogen di bagian DNA yang disalin terbuka. Akibatnya, dua utas DNA berpisah. Salah satu
polinukleotida berfungsi sebagai pencetak atau sense, yang lain sebagai gen atau antisense. Misalnya pencetak memiliki urutan basa G-A-G-A-C-T, dan yang berfungsi sebagai gen memiliki urutan basa komplemen C-T-C-T-G-A. Karena pencetaknya G-A-G-A-C-T, maka RNA hasil cetakannya C-U-C-U-G-A. Jadi, RNA C-U-C-U-G-A merupakan hasil kopian dari DNA C-T-C-T-G-A (gen), dan merupakan komplemen dari pencetak. (Prashar et al, 2012)
Transkripsi DNA akan menghasilkan mRNA (messenger RNA). Pada organisme eukariot, mRNA yang dihasilkan itu tidak langsung dapat berfungsi dalam sintesis polipeptida, sebab masih mengandung segmen-segmen yang tidak berfungsi yang disebut intron. Sedangkan segmen-segmen yang berfungsi untuk sintesis protein disebut ekson. Di dalam nukleus terjadi pematangan/pemasakan mRNA yaitu dengan jalan melepaskan segmen-segmen intron dan merangkaikan segmen-segmen ekson. Gabungan segmen-segmen ekson membentuk satu rantai/utas mRNA yang mengandung sejumlah kodon untuk penyusunan polipeptida. Rantai mRNA ini dikenal sebagai sistron.
1. Prinsip Dasar Transkripsi
Fungsi dasar yang harus dijalankan oleh DNA sebagai materi genetik adalah fungsi fenotipik. Artinya, DNA harus mampu mengatur pertumbuhan dan diferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu fenotipe tertentu. Fungsi ini dilaksanakan melalui ekspresi gen, yang tahap pertamanya adalah proses transkripsi, yaitu perubahan urutan basa molekul DNA menjadi urutan basa molekul RNA. Dengan perkataan lain, transkripsi merupakan proses sintesis RNA menggunakan salah satu untai molekul DNA sebagai cetakan (templat)nya.
Transkripsi mempunyai ciri-ciri kimiawi yang serupa dengan sintesis/replikasi DNA, yaitu
1. Adanya sumber basa nitrogen berupa nukleosida trifosfat. Bedanya dengan sumber basa untuk sintesis DNA hanyalah pada molekul gula pentosanya yang tidak berupa deoksiribosa tetapi ribosa dan tidak adanya basa timin tetapi digantikan oleh urasil. Jadi, keempat nukleosida trifosfat yang diperlukan adalah adenosin trifosfat (ATP), guanosin trifosfat (GTP), sitidin trifosfat (CTP), dan uridin trifosfat (UTP).
2. Adanya untai molekul DNA sebagai cetakan. Dalam hal ini hanya salah satu di antara kedua untai DNA yang akan berfungsi sebagai cetakan bagi sintesis molekul RNA. Untai DNA ini mempunyai urutan basa yang komplementer
dengan urutan basa RNA hasil transkripsinya, dan disebut sebagai pita antisens.
Sementara itu, untai DNA pasangannya, yang mempunyai urutan basa sama dengan urutan basa RNA, disebut sebagai pita sens. Meskipun demikian, sebenarnya transkripsi pada umumnya tidak terjadi pada urutan basa di sepanjang salah satu untai DNA. Jadi, bisa saja urutan basa yang ditranskripsi terdapat berselang-seling di antara kedua untai DNA.
3. Sintesis berlangsung dengan arah 5’→ 3’ seperti halnya arah sintesis DNA.
4. Gugus 3’- OH pada suatu nukleotida bereaksi dengan gugus 5’- trifosfat pada nukleotida berikutnya menghasilkan ikatan fosofodiester dengan membebaskan dua atom pirofosfat anorganik (PPi). Reaksi ini jelas sama dengan reaksi polimerisasi DNA. Hanya saja enzim yang bekerja bukannya DNA polimerase, melainkan RNA polimerase. Perbedaan yang sangat nyata di antara kedua enzim ini terletak pada kemampuan enzim RNA polimerase untuk melakukan inisiasi sintesis RNA tanpa adanya molekul primer.
2. Proses Transkripsi
Schelf (1993) menjelaskan bahawa secara garis besar proses transkripsi meliputi 3 (tiga) tahapan utama yaitu : Inisiasi, elongasi dan terminasi.
a. Transkripsi Prokariotik
Pada tipe prokariotik proses transkripsi juga terdapat 3 tahapan yang sama yaitu inisiasi, elongasi dan terminasi.
a.1. Tahapan inisiasi pada prokariotik meliputi proses-proses (tahapan) sebagai berikut :
1. Pembentukan kompleks promoter tertutup, yaitu RNA polymerase holoenzim menempel pada DNA bagian promoter suatu gen. Dalam hal ini subunit s yang menempel pada RNA Polimerase berperanan dalam menemukan bagian promoter suatu gen. Pada awal penempelan, RNA polymerase masih belum terikat secara kuat dan struktur promoter masih dalam keadaan tertutup (closed promoter complex).
2. Pembentukan kompleks promoter terbuka, RNA polymerase terikat secara kuat dan ikatan hydrogen molekul DNA pada bagian promoter mulai terbuka membentuk struktur terbuka(open promoter complex). Struktur khas promoter biasanya berupa suatu kelompok ikatan hydrogen antara kedua untaian DNA pada posisi -35 dan -10. Sedangkan bagian DNA yang terbuka setelah RNA
polymerase menempel biasanya terjadi pada daerah sekitar -9 dan +3 sehingga menjadi struktur untai tunggal.
3. Penggabungan beberapa nukleotida awal (10 nukleotida). Bagian DNA yang berikatan dengan RNA polymerase membentuk suatu struktur gelembung transkripsi (transcription bubble) sepanjang kurang lebih 17 pasang basa. Setelah struktur promoter terbuka secara stabil, maka selanjutnya RNA polymerase melakukan proses inisiasi transkripsi dengan menggunakan urutan DNA cetakan sebagai panduannya. Dalam proses transkripsi, nukleotida RNA digabungkan sehingga membentuk transkrip RNA. Nukleotida pertama yang digabungkan hampir selalu berupa molekul purin.
4. Perubahan konformasi RNA polymerase karena subunit s dilepaskan dari kompleks holoenzim. Setelah RNA polymerase menempel pada promoter, subunit s melepaskan diri dari struktur holoenzim. Pelepasan subunit s biasanya terjadi setelah terbentuk molekul RNA sepanjang 8 – 9 nukleotida. RNA polymerase inti yang sudah menempel pada promoter akan tetap terikat kuat pada DNA sehingga tidak lepas. Selanjutnya subunit s dapat bergabung dengan RNA polymerase yang lain untuk melakukan proses inisiasi transkripsi selanjutnya.
a.2. Tahapan Elongasi pada prokariotik
1. Pada bagian gelembung transkripsi, basa-basa molekul RNA membentuk hybrid dengan DNA cetakan sepanjang kurang lebih 12 nukleotida. Hybrid RNA-DNA ini bersifat sementara sebab setelah RNA polimerasenya berjalan, maka hidrid tersebut akan terlepas dan bagian DNA yang terbuka tersebut akhirnya akan menutup lagi. RNA polymerase akan berjalan membaca DNA cetakan untuk melakukan proses pemanjangan untaian RNA. Lalu pemanjangan maksimum molekul transkrip RNA berkisar antara 30 sampai 60 nukleotida perdetik, meskipun laju rata-ratanya dapat lebih rendah dari nilai ini. Secara umum, berdasarkan atas nilai laju semacam ini, sutu gen yang mengkode protein akan disalin menjadi RBA dalam waktu sekitar satu menit. Meskipun demikian, laju pemanjangan transkrip dapat menjadi sangat rendah jika RNA polymerase melewati sisi jeda yang biasanya mengandung banyak basa GC.
2. Dalam pemanjangan transkrip, nukleotida ditambahkan secara kovalen pada ujung 3’ molekul RNA yang baru terbentuk. Nukleotida RNA yang ditambahkan
tersebut bersifat komplementer dengan nukleotida pada untaian DNA cetakan.
Ada dua hipotesis yang diajukan mengenai perubahan topologi DNA dalam proses pemanjangan transkripsi, yaitu: 1) Enzim RNA polymerase bergerak melingkari untaian DNA sepanjang perjalanannya, 2) Enzim RNA yang terbentuk tidak mengalami pelintiran, tetapi untaian DNA yang ditranskripsi harus mengalami puntiran.
3. Dalam proses pemanjangan transkripsi RNA, terjadi pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida RNA yang satu dengan nukleotida yang berikutnya dan ditentukan oleh keberadaan subunit b pada RNA polymerase.
Transkripsi berakhir ketika RNA polymerase mencapai ujung gen (terminator).
a.3. Tahapan Terminasi pada prokariotik
Terdapat dua macam terminator transkripsi pada Prokariotik, yaitu:
1. Terminator yang tidak tergantung pada protein rho (rho-dependent terminator).
Dilakukan tanpa harus melibatkan suatu protein khusus, melainkan ditentukan oleh adanya suatu urutan nukleotida tertentu pada bagian terminator. Sinyal yang akan mengakhiri transkripsi dengan mekanisme semacam ini ditentukan oleh daerah yang mengandung banyak urutan GC yang dapat membentuk struktur batang dan lengkung (steam and loop) pada RNA dengan panjang 20 basa di sebelah hulu dari ujung 3’-OH dan diikuti oleh rangkaian 4-8 residu uridin berurutan. Struktur batang lengkung tersebut menyebabkan RNA polymerase berhenti dan merusak bagian 5’ dari hybrid RNA-DNA. Bagian sisa hybrid RNA- DNA tersebut berupa urutan oligo (rU) yang tidak cukup stabil berpasangan dengan dA. Akibatnya ujung 3’ hybrid tersebut akan terlepas sehingga transkripsi berakhir. Selanjutnya, pita DNA cetakan yang sudah tidak berikatan atau membentuk hibrid dengan RNA segera menempel kembali pada pita DNA komplemennya. RNA polimerase inti pun akhirnya terlepas dari DNA.
2. Terminator yang tergantung pada protein rho (rho-independent terminator).
Pengakhiran transkripsi yang memerlukan faktor rho hanya terjadi pada daerah jeda yang terletak pada jarak tertentu dari promoter, maka daerah itu tidak dapat berfungsi sebagai daerah pengakhiran transkripsi. Terminator yang bergantung pada rho terdiri atas suatu urutan berulang-balik yang dapat membentuk lengkungan (loop), tetapi tidak ada rangkaian basa T seperti pada daerah terminator yang tidak melibatkan faktor rho. Faktor rho diduga ikut terikat pada
transkrip dan mengikuti pergerakan RNA polymerase sampai akhirnya RNA polymerase berhenti pada daerah terminator yaitu sesaat setelah menyinstesis lengkungan RNA. Selanjutnya, faktor rho menyebabkan distabiliasi ikatan RNA- DNA sehingga transkrip RNA terlepas dari DNA cetakan.
b. Transkripsi pada Eukariotik
Secara umum mekanisme transkripsi eukariotik serupa dengan transkripsi pada prokariotik. Di mana proses transkripsi diawali (diinisiasi) oleh proses penempelan faktor-faktor transkripsi dan kompleks enzim RNA polymerase pada daerah promoter. Namun demikian, pada eukryotik RNA polymerase tidak menempel secara langsung pada DNA di daerah promoter, melainkan melalui perantaraan protein- protein lain yang disebut faktor transkripsi (transcription factor, TF). Faktor transkripsi dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu:
1. Faktor transkripsi umum, mengarahkan RNA polymerase ke promoter dan menghasilkan transkripsi pada aras dasar (basal level).
2. Faktor transkripsi khusus, pengaturan transkripsi yang lebih spesifik untuk suatu gen.
Setelah faktor-faktor transkripsi umum dan RNA polymerase menempel pada promoter, selanjutnya akan terjadi pembentukan kompleks promoter terbuka (open promoter complex). Transkripsi dimulai pada titik aawal transkripsi (RNA initiation, RIS) yang terletak beberapa nukleotida sebelum urutan kodon awal ATG.
b.1. Inisiasi pada Eukariotik
- Transkripsi gen kelas II dilakukan oleh RNA polymerase II yang dibantu oleh beberapa faktro transkripsi umum.
• membentuk kompleks pra-inisiasi yang akan segera mengawali trasnkripsi jika ada nukleotida.
• Pembentukan kompleks prainisiasi yaitu penyusunan kompleks transkripsi umum (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH, dan TFIIJI) dan RNA polymerase II pada daerah promoter. Faktor transkripsi umum akan menempel secara bertahap sebagai berikut:
1. TFIID menempel pada bagian kotak TATA pada promoter yang dibantu oleh faktor TFIIA sehingga membentuk kompleks DA.
2. Penempelan TFIIB
3. TFIIF menempel dan diikuti oleh penempelan RNA polymerase II.
4. Faktor TFIIE akan menempel diikuti oleh TFIIH dan TFIIJ.
Dari penempelan diatas terbentuklah kompleks prainisiasi yakni kompleks DABPoIFEH. Dengan demikian, RNA polymerase II pada eukariotic tidak menempel secara langsung pada DNA, melainkan melalui perantaraan faktor transkripsi.
• Proses pengenalan promoter diarahkan oleh ikatan TFIID dengan kotak TATA, sedangkan TFIIA meningkatkan daya ikat TFIID dengan kotak TATA.
• RNA polymerase dan TFIIH menutupi daerah promoter mulai dari posisi -34 sampai +17.
• TBP, TFIIB, TFIIF dan RNA polymerase II, membentuk kompleks inisiasi sehingga terjadi pembukaan DNA secara local dan pembentukan ikatan phosphodiester pertama.
• TFIIE dan TFIIH melakukan proses pelepasan dari promoter dengan dikatalisis oleh DNA helikase sehingga DNA pada daerah promoter terbuka. Di mana DNA dipuntir pada daerah hilir dari bagian yang berikatan dengan faktor transkripsi yang lain dan membentuk gelembung transkripsi. Transkripsi dimulai dan bergerak ke arah hilir sepanjang 10-12 nukleotida.
• Fosforilasi RNA polymerase II oleh faktor TFIIH menjadi bentuk IIO, menyebabkan ikatan antara CTD dengan TBP menjadi lemah, sehingga terjadi perubahan konformasi kompleks inisiasi menjadi bentuk yang siap melakukan pemanjangan transkrip.
b.2. Elongasi pada Eukariotik
Pada dasarnya, proses pemanjangan transkripsi pada eukariotic sama pada prokariotic, namun terdapat hal-hal spesifik yang dapat dijelaskan sebagai berikut:
1. Pemanjangan dilakukan oleh RNA polymerase dengan distimulasi oleh faktor TFIIS dan TFIIF.
2. Aktivitas RNA polymerase dalam proses transkripsi tidak selalu dalam keadaan tetap , kadang-kadang terjadi jeda pada suatu daerah yang disebut sisi jeda (pausing site). TFIIS berperan dalam mengurangi waktu jeda proses transkripsi pada sisi DNA yang cukup panjang, sedangkan TFIIF mengurangi waktu jeda pada daerah DNA yang acak.
3. Proses pemanjangan transkrip akan berjalan sampai RNA polymerase II mencapai daerah terminator.
b.3. Terminasi pada Eukariotik
Terminasi transkripsi dapat terjadi karena adanya aktivitas fosfatase yang spesifik untuk CTD sehingga mengembalikan RNA polymerase II menjadi bentuk yang tidak dapat mengalami fosforilasi. Dalam keadaan tidak mengalami fosforilasi, RNA polymerase II dapat digunakan lagi dalam proses transkripsi berikutnya (RNA polymerase cycling). Dalam hal ini berbeda pada prokariotic karena pada eukariotik tidak ada struktur stem loop pada proses terminasi.
Gambar 3.1. Diagram Transkripsi
1. Ribonucleic Acid (RNA) / Asam ribonukleat
Asam ribonukleat (RNA) adalah satu dari tiga makromolekul utama (bersama dengan DNA dan protein) yang berperan penting dalam segala bentuk kehidupan.
Asam ribonukleat berperan sebagai pembawa bahan genetik dan memainkan peran utama dalam ekspresi genetik. Dalam genetika molekular, RNA menjadi perantara antara informasi yang dibawa DNA dan ekspresi fenotipik yang diwujudkan dalam bentuk protein.
Gambar 3.2. Diagram RNA
1. Jenis RNA Hasil Transkripsi
RNA dibedakan menjadi dua kelompok utama yaitu RNA genetik dan RNA non-genetik.
a. RNA genetik
RNA genetik memiliki fungsi yang sama dengan DNA, yaitu sebagai pembawa keterangan genetik. RNA genetik hanya ditemukan pada makhluk hidup tertentu yang tidak memiliki DNA, misalnya virus.Ketika virus ini menyerang sel hidup, RNA yang dibawanya masuk ke sitoplasma sel korban, yang kemudian ditranslasi oleh sel inang untuk menghasilkan virus-virus baru. Dalam hal ini fungsi RNA menjadi sama dengan DNA, baik sebagai materi genetik maupun dalam mengatur aktivitas sel.
b. RNA non-genetik
RNA non-genetik tidak berperan sebagai pembawa keterangan genetik sehingga RNA jenis ini hanya dimiliki oleh makhluk hidup yang juga memiliki DNA.Berdasarkan letak dan fungsinya, RNA non-genetik dibedakan menjadi mRNA, tRNA, dan rRNA.
b.1. mRNA (messenger RNA) atau RNAd (RNA duta)
RNAd merupakan RNA yang urutan basanya komplementer (berpasangan) dengan salah satu urutan basa rantai DNA.RNA jenis ini merupakan polinukleotida berbentuk pita tunggal linier dan disintesis di dalam nukleus. Panjang pendeknya RNAd berhubungan dengan panjang pendeknya rantai polipeptida yang akan disusun. Urutan asam amino yang menyusun rantai polipeptida itu sesuai dengan urutan kodon yang terdapat di dalam molekul RNAd yang bersangkutan.RNAd bertindak sebagai pola cetakan pembentuk polipeptida. RNAd membawa kode-kode genetik komplemen dari DNA di inti sel menuju ke ribosom di sitoplasma. RNAd ini dibentuk bila diperlukan dan jika tugasnya selesai, maka akan dihancurkan dalam plasma.
mRNA ini mempunyai fungsi untuk menyampaikan informasi genetik dalam bentuk kode-kode genetik dalam inti sel ke ribosom dan sebagai pola cetakan dalam membentuk polipeptida berupa 3 urutan basa nitrogen (kodon) berturut-turut di robosom untuk menyusun asam amino. mRNA ini dibentuk jika diperlukan dan bila tugasnya sudah selesai maka akan dihancurkan dalam plasma.
Gambar 3.3. mRNA.
b.2. tRNA (transfer RNA) atau RNAt (RNA transfer)
RNA jenis ini dibentuk di dalam nukleus, tetapi menempatkan diri di dalam sitoplasma.RNAt merupakan RNA terpendek dan bertindak sebagai penerjemah kodon pada RNAd. Fungsi lain RNAt adalah mengikat asam-asam amino di dalam sitoplasma yang akan disusun menjadi protein dan mengangkutnya ke ribosom.
Bagian RNAt yang berhubungan dengan kodon RNAd dinamakan antikodon.
Gambar 3.4. Struktur tRNA (2 dan 3 dimensi) b.3. rRNA (ribosomal RNA) atau RNAr (RNa ribosomal)
RNA ini disebut ribosomal RNA karena terdapat di ribosom meskipun dibuat di dalam nukleus.RNAr bersama protein membentuk ribosom, ialah benda-benda berbentuk butir-butir halus di dalam sitoplasma.Lebih dari 80% RNA merupakan RNAr.Ribosom bertindak sebagai “mesin” perakit dalam sintesis protein yang bergerak ke satu arah sepanjang RNAd.Di dalam ribosom, molekul RNAr ini mencapai 30-46%.
Gambar 3.5. Pembentukan struktur Ribosom oleh rRNA dan protein
Dua dimensi Tiga dimensi
3.1.2. Translasi
Translasi merupakan proses penerjemahan urutan nukleotida yang ada pada molekul mRNA menjadi rangkaian asam-asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein.Transkripsi dan Translasi merupakan dua proses utama yang menghubungkan gen ke protein. Translasi hanya terjadi pada molekul mRNA, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi. Molekul mRNA yang merupakan salinan urutan DNA menyusun suatu gen dalam bentuk kerangka baca terbuka.
mRNA membawa informasi urutan asam amino. Pada proses translasi hanya molekul mRNA yang ditranslasi, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi, yaitu dilakukan secara hampir serentak dengan proses transkripsi, artinya sebelum transkripsi selesai maka proses translasi sudah dimulai. Hal ini disebabkan oleh perbedaan dalam hal struktur sel prokariot sangat sederhana dan belum ada pembagian ruang sehingga molekul DNA genom berada di dalam sitoplasma bersama-sama dengan komponen sel yang lain. Dengan demikian, molekul mRNA hasil transkripsi dapat langsung melakukan kontak dengan ribosom sebelum untaian mRNA tersebut selesai disintesis.
a. Komponen Translasi
1. Molekul mRNA yang merupakan transkrip (salinan) urutan DNA yang menyusun suatu gen dalam bentuk ORF (open reading frame / kerangka baca terbuka), didalamnya terdapat rangkaian kodon-kodon yang akan diterjemahkan.
2. Molekul tRNAyang merupakan pembawa asam-asam amino yang akan disambungkan menjadi rantai polipeptida, tRNA sebagai penterjemah, yang membawa antikodon.
3. Ribosom yang merupakan tempat penterjemahan berlangsung/proses translasi, disusun oleh molekul rRNA dan beberapa macam protein, ribosom tersebar diseluruh bagian sel.
ORF dicirikan oleh:
1. Kodon inisiasi translasi, yaitu urutan ATG (pada DNA) atau AUG (pada mRNA).
2. Terdapat serangkaian urutan nukleotida yang menyusun banyak kodon yang dibaca tiap tiga nukleotida sebagai satu kodon untuk satu asam amino, dan pembacaan dimulai dari urutan kodon metionin (ATG pada DNA atau AUG pada mRNA).
3. Kodon terminasi translasi, yaitu TAA (UAA pada mRNA), TAG (UAG pada mRNA), atau TGA (UGA pada mRNA).
Proses translasi dirangkum dalam tiga tahap, yaitu inisiasi, elongasi (pemanjangan) dan terminasi (penyelesaian). Translasi pada mRNA dimulai pada kodon pertama atau kodon inisiasi translasi berupa ATG pada DNA atau AUG pada RNA. Penerjemahan terjadi dari urutan basa molekul (yang juga menyusun kodon- kodon setiap tiga urutan basa) mRNA ke dalam urutan asam amino polipeptida.
Banyak asam amino yang dapat disandikan oleh lebih dari satu kodon. Tempat- tempat translasi ini ialah ribosom, partikel kompleks yang memfasilitasi perangkaian secara teratur asam amino menjadi rantai polipeptida. Asam amino yang akan dirangkaikan dengan asam amino lainnya dibawa oleh tRNA. Setiap asam amino akan dibawa oleh tRNA yang spesifik ke dalam kompleks mRNA-ribosom. Pada proses pemanjangan ribosom akan bergerak terus dari arah 5'3P ke arah 3'OH sepanjang mRNA sambil merangkaikan asam-asam amino. Proses penyelesaian ditandai denga bertemunya ribosom dengan kodon akhir pada mRNA.
Mekanisme translasi atau sintesis protein secara skema garis besar. Sebuah molekul mRNA akan terikat pada permukaan ribosom yang kedua subunitnya telah bergabung. Pengikatan ini terjadi karena pada mRNA prokariot terdapat urutan basa tertentu yang disebut sebagai tempat pengikatan ribosom (ribosom binding site) atau urutan Shine-Dalgarno. Sementara itu, pada eukariot pengikatan ribosom dilakukan oleh ujung 5’ mRNA. Selanjutnya, berbagai aminoasil-tRNA akan berdatangan satu demi satu ke kompleks ribosom-mRNA ini dengan urutan sesuai dengan antikodon dan asam amino yang dibawanya. Urutan ini ditentukan oleh urutan triplet kodon pada mRNA. Ikatan peptida terbentuk di antara asam-asam amino yang terangkai menjadi rantai polipeptida di tapak P ribosom.Penggabungan asam-asam amino terjadi karena gugus amino pada asam amino yang baru masuk berikatan dengan gugus karboksil pada asam amino yang terdapat pada rantai polipeptida yang sedang diperpanjang.
b. Tahapan Translasi 1. Inisiasi
Proses ini dimulai dari menempelnya ribosom sub unit kecil ke mRNA.
Penempelan terjadi pada tempat tertentu yaitu pada 5′-AGGAGGU-3′, sedang pada eukariot terjadi pada struktur tudung (7mGpppNpN).Selanjutnya ribosom bergeser ke arah 3′ sampai bertemu dengan kodon AUG. Kodon ini menjadi kodon
awal.Asam amino yang dibawa oleh tRNA awal adalah metionin.Metionin adalah asam amino yang disandi oleh AUG. pada bakteri, metionin diubah menjadi Nformil metionin.Struktur gabungan antara mRNA, ribosom sub unit kecil dan tRNA- Nformil metionin disebut kompleks inisiasi. Pada eukariot, kompleks inisiasi terbentuk dengan cara yang lebih rumit yang melibatkan banyak protein initiation factor.
2. Elongasi
Tahap selanjutnya adalah penempelan sub unit besar pada sub unit kecil menghasilkan dua tempat yang terpisah. Tempat pertama adalah tempat P yang ditempati oleh tRNA- metionin. Tempat kedua adalah tempat Ayang terletak pada kodon ke dua dan kosong. Proses elongasi terjadi saat tRNA dengan antikodon dan asam amino yang tepat masuk ke tempat A. Akibatnya kedua tempat di ribosom terisi, lalu terjadi ikatan peptida antara kedua asam amino. Ikatan tRNA dengan metionin lalu lepas, sehingga kedua asam amino yang berangkai berada pada tempat A. Ribosom kemudian bergeser sehingga asam amino-asam amino-tRNA berada pada tempat P dan tempat A menjadi kosong. Selanjutnya tRNA dengan antikodon yang tepat dengan kodon ketiga akan masuk ke tempat A, dan proses berlanjut seperti sebelumnya.
3. Terminasi
Proses translasi akan berhenti bila tempat A bertemu kodon akhir yaitu UAA, UAG, UGA. Kodon-kodon ini tidak memiliki tRNA yang membawa antikodon yang sesuai. Selanjutnya masuklah release factor (RF) ke tempat A dan melepaska rantai polipeptida yang terbentuk dari tRNA yang terakhir. Kemudian ribosom berubah menjadi sub unit kecil dan besar.
c. Translasi pada prokariot dan eukariot 1. Translasi Prokariot
Pada prokariot, translasi terjadi sebelum transkripsi sepenuhnya dirampungkan.
Hal ini dimungkinkan karena pada prokariot molekul mRNA di translasikan berdasarkan arah dari ujung 5` ke ujung 3`. Selain dari itu, pada prokariot tidak terdapat membran inti, sehingga tidak ada yang memisahkan transkripsi dan translasi (sebagaimana yang terjadi pada eukariot) sehingga translasi dapat segera dilakukan.
2. Translasi pada eukariot
Pada eukariot transkripsi terjadi tidak bersamaan dengan translasi. Dengan adanya membran inti, pada eukariot dapat dibedakan tempat terjadinya transkripsi dan translasi, transkripsi terjadi di dalam inti sedang translasi terjadi di sitoplasma.
Waktunya pun tidak dapat terjadi secara bersamaan, sebab sebelum dapat melakukan translasi, harus merampungkan terlebih dahulu proses transkripsi. Proses transkripsi dan translasi pada eukariotpun lebih kompleks daripada prokariot.
Gambar 3.6. Translasi mRNA
IV. SISTEM REGULASI EKSPRESI GENETIK
Pengaturan ekspresi genetik merupakan aspek yang sangat penting bagi jazad hidup baik pada prokariot maupun eukariot. Regulasi ekspresi gen merupakan proses pengaturan dalam penterjemahan informasi genetik. Regulasi ekspresi gen adalah suatu pengendalian gen yang berfungsi untuk memunculkan fenotipe dari genotipe. Proses pengaturan ini dilakukan dengan cara menghentikan produksi enzim, melalui penghentian gen penyandinya. Regulasi ekspresi gen pada bakteri dimulai dari proses transkripsi. Ini artinya jika suatu protein (yang dikodekan oleh gen) diperlukan, protein akan ditranskripsi. Sedangkan jika suatu protein (yang dikodekan oleh gen) tidak diperlukan, maka protein tidak akan ditranskripsi.
Sebuah pertanyaan tentang mengapa ekspresi gen harus dikendalikan ?, karena DNA penyusun atas ratusan ribu gen (tergantung dari jenis organismenya) dimana tidak semua sel yang bekerja untuk karakter yang sama walaupun mempunyai gen yang sama, karena tidak semua gen diekspresikan pada level yang sama pada setiap levelnya (Burns, 1980)Sel meregulasi gen dengan tujuan :
1. Sel hanya mengekspresikan gen yang dibutuhkan pada lingkungan tertentu, sehingga sel sangat efisien dan tidak membuang energi untuk membuat mRNA yang tidak diperlukan .
2. Sel dapat menon-aktifkan gen yang menghasilkan produk yang bertentangan atau menghambat proses lain yang berlangsung dalam sel pada waktu bersamaan.
3. Sel meregulasi gen-gen yang merupakan bagian dari proses perkembangan seperti embriogenesis dan sporulasi.
Pengendalian ekspresi gen merupakan aspek penting bagi jasad hidup. Tanpa sistem pengendalian yang efisien, sel akan kehilangan banyak energi yang justru merugikan jasad hidup. Bakteri E.coli merupakan salah satu contoh jasad hidup prokariotik yang paling banyak dipelajari aspek fisiologi dan molekulernya. Dalam sistem molekulernya bakteri ini mempunyai banyak sistem pengendalian ekspresi genetik yang menentukan kapan suatu gen tertentu diaktifkan dan diekspresikan untuk menghasilkan suatu produk ekspresi. Sistem pengaktifan ekspresi gen dibedakan:
1. Secara Konstitutif : Gen diekspresikan setiap saat, gennya disebut gen konstitutif, gen yang diekspresikan terus menerus sepanjang umur individu di
hampir semua jenis sel tanpa tergantung dengan kondisi lingkungan. Kelompok gen ini bertanggung jawab pada berbagai proses metabolisme dasar, misalnya : metabolisme energi atau sintesis komponen sellular. Produk gen antara lain:
Protein ribosomal, rRNA, tRNA, RNA polimerase dan enzim yang mengkatalis berbagai proses metabolisme yang berkaitan dengan fungsi pemeliharaan sel.
Gambar 4.1. Ekspresi gen konstitutif
b. Secara Induktif: Gen yang diekspresikan jika ada proses induksi, gennya disebut gen inducible. Gen ini ekspresinya ditentukan oleh kondisi lingkungan tertentu.
Sehingga diekspresikan pada waktu tertentu dan jenis sel tertentu. Ekspresi gen sejenis ini memerlukan pengaturan tertentu.
Gambar 4.2. Ekspresi Gen Inducible
Pengaturan ekspresi gen dapat terjadi pada berbagai tahap, misalnya transkripsi, prosesing mRNA, atau translasi. Namun, sejumlah data hasil penelitian menunjukkan bahwa pengaturan ekspresi gen, khususnya pada prokariot, paling banyak terjadi pada tahap transkripsi.
Regulasi yang berlangsung pada tahap transkripsi dari gen ke mRNA disebut regulasi transkripsional. Regulasi atau kontrol transkripsional adalah kontrol sintesis rantai polipeptida dari cetakan mRNA-nya. Kontrol transkripsional merupakan mekanisme utama dalam pengaturan ekspresi gen bakteri. Bentuk regulasi ini ini lebih efesien; mRNA yang tidak ditranslasi akan tidak berguna. Tidak semua gen yang ditranskripsi diregulasi, tidak bersifat ekslusif. Tiap regulasi yang terjadi setelah transkripsi disebut regulasi postranskripsional. Terdapat banyak tipe regulasi postranskripsional, yang paling utama adalah regulasi posttranlasi, Jika gen diregulasi pada tahap translasional, mRNA mungkin dapat dilanjutkan pada tahap transkripsi , tapi translasinya memungkinkan untuk dihambat.
Kontrol ekspresi gen lebih kompleks pada eukariotik daripada prokariotik.
Perbedaan utama dari kedua regulasi ini adalah adanya membran inti pada eukariotik, yang mencegah transkripsi dan translasi terjadi secara simultan (Brown, 1993). Pada eukariotik kontrol inisiasi transkripsi adalah titik utama regulasi sedangkan pada eukarioptik regulasi ekspresi gen dapat dikatakan ekuivalen dari banyak titik berbeda dari transkripsi sampai posttranslasi. Regulasi gen memungkinkan sel untuk mengatur struktur dan fungsi yang menjadi dasar dari diferensiasi, morfogenesis dan kemampuan adaptif setiap organisme.
Mekanisme pengaturan transkripsi, baik pada prokariot maupun pada eukariot, secara garis besar dapat dibedakan menjadi dua kategori utama, yaitu :
1. Mekanisme yang melibatkan penyalapadaman (turn on and turn off) ekspresi gen sebagai respon terhadap perubahan kondisi lingkungan dan
Mekanisme penyalapadaman sangat penting bagi mikroorganisme untuk menyesuaikan diri terhadap perubahan lingkungan yang seringkali terjadi secara tiba-tiba. Sebaliknya, bagi eukariot mekanisme ini nampaknya tidak terlalu penting karena pada organisme ini sel justru cenderung merespon sinyal-sinyal yang datang dari dalam tubuh, dan di sisi lain, sistem sirkulasi akan menjadi penyangga bagi sel terhadap perubahan kondisi lingkungan yang mendadak tersebut.
Gambar 4.3. Mekanisme turn on and turn off.
2. Sirkuit ekspresi gen yang telah terprogram (preprogramed circuits).
Pada mekanisme sirkuit, produk suatu gen akan menekan transkripsi gen itu sendiri dan sekaligus memacu transkripsi gen kedua, produk gen kedua akan menekan transkripsi gen kedua dan memacu transkripsi gen ketiga, demikian seterusnya. Ekspresi gen yang berurutan ini telah terprogram secara genetik sehingga gen-gen tersebut tidak akan dapat diekspresikan di luar urutan. Oleh karena urutan ekspresinya berupa sirkit, maka mekanisme tersebut dinamakan sirkit ekspresi gen.
Gambar 4.4. Sirkit ekspresi gen terprogram
Pengaturan Ekspresi Gen Pada Sel Prokariot
Pada bakteria, gen dikat pada satu operon. Operon adalah kelompok gen yang mengkode protein penting dalam fungsi metabolisme tertentu yang terkoordinasi seperti biosintesis asam amino tertentu. RNA yang ditranskripsi dari operon prokariotik berisifat polisistrinik yaitu terdiri atas gen-gen struktural yang mengkode beberapa protein dalam satu kali transkripsi. Operon bakteri adalah wilayah pada DNA yang meliputi gen-gen cotranskripsi menjadi RNA yang sama ditambah semua cis-acting sequences yang dibutuhkan untuk mentranskripsi gen-gen ini, termasuk gen promotor sebagai operator dan sequen lain yang termasuk pada regulasi transkripsi gen-gen ini. Karena gen-gen dari satu operon semua telah ditranskripsi dari promotor yang sama dan menggunakan sekuen regulator yang sama, semua gen pada satu operon dapat diregulasi transkripsinya secara simultan.
- Represor dan Aktivator
Regulasi transkripsi bakteri diregulasi oleh produk gen regulator, yang umumnya protein dan sebut represor atau aktivator. Protein regulator berikatan dengan operon promotor dan meregulasi transkripsi daru promotor. Kadang-kadang protein regulator dapat berperan rangkap dan dapat juga menunjukkan reaksi enzimatis pada jalur yang dikode oleh operon. Karena berikatan dengan DNA, represor dan aktivator sering memiliki helix-turn-helix motif shared oleh banyak ikatan DNA protein. (Helix-turn-helix motif of DNA binding proteins : adalah protein yang berikatan pada DNA termasuk represor dan aktivator, sering membagi motif struktur yang sama ditentukan oleh interaksi antara protein dan DNA helix.
Salah satu motif adalah helix-turn-helix motif). Represor dan aktivator bekerja berlawanan arah. represor berikatan pada sisi yang disebut operator dan menginkatifkan promotor, bertujuan mencegah transkripsi dari gen-gen operon.
Aktivator, sebaliknya berikatan pada sisi ikatan dan mengaktifkan promotor, untuk memfasilitasi proses transkripsi dari gen-gen pada operon.
Pengaturan Ekspresi Gen pada Eukariot
Pada eukariot tingkat tinggi gen-gen yang berbeda akan ditranskripsi pada jenis sel yang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme pengaturan pada tahap transkripsi, dan juga prosesing mRNA, memegang peran yang sangat penting dalam proses diferensiasi sel.
Pada sel eukariot gen yang mengkode protein yang berfungsi bersama-sama biasanya terletk pada kromosom yang berbeda. Situasi ini berbeda dari bakteri, dimana gen yang mengkode protein berfungsi bersama-sama berletak berdampingan satu sama lain dalam operan. operan tidak terdapat pada sel eukariot. Ekspresi gen pada sel eukariot, berlangsung di sejumlah tahapan yang berbeda yaitu : transkripsi, pasca transkripsi, translasi dan pasca translasi.
V. PENUTUP
Proses kehidupan dari suatu jazad hidup pada dasarnya sangat ditentukan oleh bahan (materi) genetik yang bertanggung jawab dalam sistem informasi genetik (pewarisan sifat). Dimana bahan genetik ini berfungsi untuk menyimpan informasi genetik dalam pewarisan sifat (fungsi genotipe/replikasi) dan mengendalikan organisme (fungsi fenotipe/ekspresi gen). Secara umum bahan genetik dari organisme hidup adalah DNA terkecuali pada beberapa Virus. DNA (asam nukleat) merupakan polimer yang terdiri dari 3 komponen utama yaitu : Gugus fosfat, gugus deoksiribosa dan basa nitrogen. Sebagian besar struktur DNA terdiri dari 2 untai yang dikenal dengan double helix.
Replikasi DNA yang merupakan fungsi genotipe merupakan proses penggandaan ganda DNA yang terdiri dari 3 model replikasi yaitu : Model konservatif, semikonservatif, dan dispersif. Dimana pada akhirnya model semi konservatif merupakan model yang dianggap paling sesuai dengan kondisi replikasi DNA. Sedang dalam fungsi fenotipe (ekspresi gen) merupakan proses dimana informasi dari gen digunakan untuk sintesis produk gen fungsional. Mekanisme ekspresi gen ini mengikuti aliran (transfer) yang dikenal dengan Dogma Sentra Biologi Molekuler, pada dasarnya ekspresi gen terdiri dari 2 proses pokok yaitu : Transkripsi dan Translasi. Dalam proses transkripsi dan translasi mempunyai tahapan yang relatif mempunyai kesamaan yaitu : Inisiasi, Elongasi dan Terminasi, baik pada sel prokariotik ataupun eukariotik.
Dalam ekspresi genetik diperlukan adanya pengaturan (regulasi) yang merupakan aspek penting bagi jazad hidup. Pada dasarnya regulasi ekspresi gen merupakan pengendalian gen yang berfungsi untuk memunculkan sifat fenotipe dari genotipe. Sistem pengaktifan ekspresi gen dibedakan menjadi 2 tipe yaitu : Secara konstitutif dan secara Induktif.
Regulasi ekspresi gen terdapat pada berbagai tahap tetapi sebagian besar terjadi pada tahapan transkripsi. Mekanisme pengaturan ekspresi gen dibedakan menjadi 2 katagori utama yaitu : Mekanisme Turn on and turn off (penyalapadaman) dan mekanisme Preprogrammed circuit (Sirkuit ekspresi gen terprogram).
DAFTAR PUSTAKA
Brown, TA. 1993. Genetics, a molecular approach. Chapman and Hill. London Burns, GW. 1980. The Science of Genetics : an Introduction of Heredity. Fourth
edition MacMillan Publishing. New York.
Fincham, JRS. 1990. Mendel – Now down to Molecular Level. Nature. 343 : 207- 210
Irawan, B. 2008. Genetika Molekuler. Pusat Penerbitan dan Percetakan UNAIR.
Surabaya.
Prashar, S., D, Wolfe., M. King., C. Vera., S. Fox., R. Depauw. 2012. Stability of Midge Tolerant Varietal Blends over 3- 4 Successive Generations: High-speed/
High-throughput, SNP-DNA Fingerprinting in Grain Seeds. Plant Molecular Biology and Biotechnology .(2) ; 1.
Scheilf, R. 1993. Genetics and Molecular Biology. Hopkins University. Baltimore.
Maryland.
Sudarmi, 2013. Peranan Biologi Molekuler pada Pemuliaan Tanaman. Magistra (25) : 84.
Yuwono, T. 2010. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.
