ISOLASI DNA PLASMID. Disusun dalam rangaka memenuhi tugas terstruktur dalam mata kuliah Bioteknologi. Oleh : Amrullah M, S.

ISOLASI DNA PLASMID

Disusun dalam rangaka memenuhi tugas terstruktur dalam mata kuliah Bioteknologi

Oleh : Amrullah M, S.Pd 8136173002

Kelas A Semester II TA. 2014

Dosen Pengampu :

Isolasi DNA Plasmid

Pada dasarnya plasmid merupakan identitas

genetik yang ditemukan secara alami di dalam

sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot.

Dengan teknik rekayasa genetik, sekarang telah

dikembangkan plasmid artifisial dengan cara

menggabungkan gen-gen dari plasmid alami

maupun genom tertentu (Yuwono, 2009).

•

Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom

yang dikenal pada bakteri, berutas ganda,

dan berbentuk sirkuler (Jusuf, 2001).

•

Plasmid

merupakan

salah

satu

vektor

pembawa molekul DNA di dalam proses

rekayasa

DNA

melalui

teknologi

DNA

rekombinan.

Plasmid

banyak

sekali

digunakan dalam pengklonan DNA, karena

relatif mudah dalam penanganannya.



Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid,

dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan

sebagai vektor untuk kloning DNA.



Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk

perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa

mengekspresikan gen tertentu.



Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah

karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya

marker

sehingga dapat diketahui apakah gen

insert masuk atau tidak, memiliki copy number

yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai

dengan tujuan tertentu.



Plasmid memiliki fungsi yang bisa dimanfaatkan

keuntungannya, maka ada banyak cara yang

digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut.



Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri.

Proses

ini

dikenal

sebagai

proses

mini

preparation karena jumlahnya hanya sekitar

1-20µg.



Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar

(100-200µg) digunakan

midi preparation

dan

maxi

preparation

untuk jumlah yang lebih besar dari

200 µg.



Inti

dari

isolasi

plasmid

bakteri

adalah

menghancurkan membran sel sehingga semua

organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan

DNA kromosomal serta DNA ekstra kromosmal

(plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja

harus

dilakukan

pemurnian

dari

debris

membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya.



Metode yang dapat digunakan untuk isolasi

plasmid antara lain yaitu

boiling lysis, lysis

withdetergent, mechanical lysis, alkaline lysis,

dan

enzimatic digestion.

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan

plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor)

kloning, antara lain adalah :

a. Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;

b. DNA-nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia;

c. Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi;

d. Mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;

e. Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu.

Tahapan Isolasi DNA Plasmid

(Brock,

et al.

, 1994).

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu : 1. tahap kultivasi dan harvesting,

2. tahap lisis dan

3. tahap pemurnian DNA plasmid.

Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak.

Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya.

Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi, dan pembilasan DNA plasmid.

1.

Kultivasi

DNA Plasmid

dimulai dengan

tahapan sebagai berikut:

 Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam.

 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.

 Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HCl pH 8,100mM NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.

 10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan.

 Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.

 Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C.

 Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml.

 Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan.

 Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml.

 Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelansehingga timbul benang-benang halus DNA.

 Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%.

 Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan.

 Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.

 Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid) sebanyak yang diperlukan.

2. Tahap resuspensi dan lisis DNA

plasmid

Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid:

 Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke dalam tabung yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik.

 Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam.

 Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

 Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1, didiamkan dalam es selama 5 menit.

 Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5 menit.

 Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara membolakbalikkan, diinkubasi dalam es selama 5 menit.

 Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.

 Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang.

 Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur dengan Vortek.

Senyawa-senyawa kimia

• Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat).

• Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.

• Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis.

• Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan).

• Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA.

3. Tahap pemurnian DNA plasmid

Tahap ini meliputi proses berikut:

 Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan perbandingan 1:1 (v/v).Dicampur dengan vortek.

 Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil.

 Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA.

 Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C semalam.

 Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin.

 Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit.

 Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol 70%.

 Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

 Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 μl, masukkan ke dalam tabung.

 Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada suhu - 200_{C. jika perlu DNA dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian}

Fungsi Penambahan Senyawa

a. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih

tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama.

b. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid.

c. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan - pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.

d. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

Program Pascasarjana UNIMED

Program Studi Pendidikan Biologi

Mata Kuliah: Bioteknologi

Dosen Pengampu: Dr. Fauziyah Harahap, M.Si

By:

Al Khudri Sembiring 8136173001

Tahapan Isolasi DNA Plasmid metode

alkaline

lysis

(Birnboim dan Dolly tahun 1979) (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523).

1. Menyiapkan kultur bakteri Escherichia coli yang diinkubasi dalam suhu 370 _{C dan dalam waktu 1 malam.}

2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan menggunakan mikropipet.

3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml. 4. Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan

kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan.

5. Membuang supernatan kemudian menambahkan 2 ml larutan A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam pelet.

Fungsi-fungsi Senyawa

 EDTA : Thrometamine ethylenediamine tetraacetic acid: sebagai kofaktor yang esensial bagi aktivitas Dnase dalam mencacah molekul DNA

 Tris HCL: Thrometamine HCL: Buffer menjaga pH, melindungi isi sel agar tidak lisis.

 SDS : Sodium dodesil sulfat : Mendenaturasi protein yang ada dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatan-katan non kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga kembali ke struktur primernya, sebagai rantai linier polipeptida.

 NaOH (sodium hidroksida) : Pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosomal.

Tahapan Isolasi DNA Plasmid (Lanjutan)

6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm.

7. Menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian dibolak-balik 4-6 kali.

8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga terbentuk supernatan dan pelet.

9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan ke dalam tabung yang baru kemudian didiamkan selama 1 malam

Tahap presipitasi

1. Menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam.

2. Menyimpannya ke dalam freezer dengan suhu -20_{C sampai -4}0_{C selama 1 jam.}

3. Mengendapkan DNA plasmid dengan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.

4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di atas tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.

Tahap pembilasan

1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit.

2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit.

3. Menambahkan 50 mikrolit dH₂O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur.

4. Memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

 HASIL akhir

1. Sentrifuge setelah inkubasi : Terbentuk dua lapisan yaitu supernatan yang berwarna keruh dan pellet yang berwarna kuning

2. Setelah Penambahab larutan C : Terbentuk endapan putih

3. Sentrifuge setelah penambahan larutan C : Terbentuk 3 lapisan. Lapisan bawah adalah pellet yang mengandung plasmid lapisan tengah adalah supernatant, dan lapisan atas adalah debris molekul

Fungsi

zat-zat

 Glukosa: berfungsi menjaga tekanan osmotik sel agar tidak pecah.

 FKI (Phenol : Chloroform : Isoamilalkohol) : Memisahkan kandungan lipid, protein dari DNA, menghilangkan kontaminan yg masih melekat

 NaOAc: menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbanagan sel agar tidak lisis

 Asam asetat : Menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh ion hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya

 ethanol absolut 70 % : memurnikan DNA  mikrolit dH₂O :

DAFTAR PUSTAKA

Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004. Understanding DNA. Amsterdam : Academic Press.

Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta :Erlangga.

Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D. 2000. Molecular Cell Biology. Wh Freeman Company

Suryani, Yoni dkk. 2007. Petunjuk Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler. Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta.

Isolasi DNA Plasmid

ERLIA UTAMI PANJAITAN

8136173009

Plasmid adalah molekul DNA sirkular berukuran kecil yang terpisah dari kromsom. Palsmid ini ditemukan di dlam bakteri dn ragi yang merupakan eukariota

uniseluler. Plasmid dapat bereplikasi tanpa tergantung dengan genom sel yang lain dan kadang-kadang

ditransfer diantara sel-sel.

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom

Tahapan isolasi DNA plasmid

1. Sampel berupa biakan Escherichia coli yang mengandung plasmid.

2. Biakan E. Colli kemudian diisolasi dari cawan dan tumbuhan di dalam 2 ml media LB (Luria Bertani) yang mengandung 100 ml/gr ampisilin di dalam

shaker (250 rpm) pada suhu 37 0_{C selama satu}

malam.

3. Diendapkan dengan sentrifugasi pada 10.000 rpm pada suhu 4 0_{C selama 10 menit}

4. Endapan bakteri disuspensikan dalam 300 µl buffer suspensi sel (50mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA).

Fungsi- fungsi Senyawa

 Luria Bertani medium yang mengandung Amphisilin ; berguna untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat

kontaminan yang peka.



Larutan buffer ; untuk menjaga struktur DNA selama

proses penghancuran dan purifikasi sehingga

memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA

serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan

mencegah perubahan pada molekul DNA.

 Tris HCl ; Thrometamine HCl; buffer menjaga pH, melindungi isi sel agar tidak lisis

 EDTA ; ethylenediamine tetraacetic acid: menginaktivasi enzim DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang di isolasi

6. Bila sudah tidak ada endapan, dilisis dengan menggunakan 300 µl buffer lisis

7. Tabung reaksi di balik-balikkan 8x, dan di biarkan 1-2 menit.

8. Setelah lisis campuran ditambakan 300 µl buffer

netralisasi dan dibalik-balikan kembali agar tercampur rata. 9. Disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm pada suhu 4

0_{C selama 20 menit.}

10. Cairan jernih di bagian atas di ambil dan dipindahkan ke tabung ependorf yang bersih

11. Cairan yang mengandung DNA plasmid diekstraksi dengan fenol.

12. Divortex

13. Disentrifugasi lagi pada kecepatan 10.000 rpm dengan suhu ruang selama 1-2 menit.

14. Terbentuk dua fase yang dibatasi oleh dua lapisan putih yang sangat tipis

15. cairan bagian atas dipindahkan ke tabung ependorf yang bersih atau yang baru

16. Di tambah Rnase dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 0_{C, untuk menghilangkan RNA.}

17. DNA plasmid diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm selama 20 menit.

18. Endapan dibilas dengan etanol 70% dan disentrifugasi

19. Endapan dikeringkan kemudian ditambah ddH₂O dan Rnase. 20. Endapan diinkubasi selama satu malam pada suhu 37 0_C

 Fenol ; memisahkan kandungan lipid , protein dari DNA, menghilangkan kontaminan yang masih

melekat

 RNAse ; enzim yang memisahkan DNA dengan RNA, melisis RNA

 Etanol ; dilakukan pencucian dengan etanol,

perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA.

 Larutan ddH₂O dan RNAse : berfungsi

menghilangkan sisa-sisa RNA untuk memperoleh yang murni

Metode elektroforesis

1. mensuspensikan gel agarose didalam larutan

penyangga yang sesuai (TAE 1x) dengan konsentrasi tertentu sesuai dengan kebutuhan di dalam

erlenmeyer.

2. Kemudian dipanaskan dengan microwave atau

hot-plate hingga tidak terlihat lagi butiran agarose, dan dilarutkan menjadi jernih (transparan, tidak

putih).

3. Agarose dibiarkan dingin terlebih dahulu sambil menyiapkan tempat untuk menuang gel (tray).

4. Kemudian dipasang sisir pada tempat tersebut 5. Setelah suhu turun, agarose dituangkan ke dalam tempat tersebut.

6. Setelah beku, gel ditempatkan pada alat untuk

elektroforesis sedemikian rupa sehingga sisir

terletak pada kutub negative

7. dituangkan larutan penyangga TAE 1x sampai gel terendam

8. Sisir diambil secara hati-hati, selanjutnya ditambahkan ethidium bromida (EtBr) pada larutan penyangga sebagia pewarna DNA.

9. DNA yang akan dimigrasi dicampur dengan larutan pewarna (loading dye) untuk menandai laju migrasi. 10. Larutan DNA yang telah di campur loading dye

dimasukkan ke dalam sumur pada gel agarose menggunakan pipet mikro

Fungsi- fungsi Senyawa

 TAE : Tris Asetat EDTA; memisahkan molekul DNA dan RNA



etidhium bromida ; untuk membantu

visualisasi, karena etidhium bromida akan

memendarkan sinar UV

11. Alat elektroforesis dihubungkan dengan alat catu listrik sedemikian sehingga kutub positif dihubungkan dengan kutub positif dan kutub negatif dengan kutub negatif.

12. DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. 13. Selanjutnya alat catu listrik dihidupkan pada 30-250 volt (tergantung dari besarnya DNA dan larutan

penyangga yang digunakan)

14. Setelah cukup jauh bromfenol biru bermigrasi, catu listrik dimatikan.

15. Kemudian gel diambil, dibilas dan diperiksa DNA yang bermigrasi dengan menggunakan sinar ultraviolet.

ISOLASI DNA PLASMID

ISOLASI DNA

PLASMID

DEWI SARTIKA SARI

8136173004

PROGRAM

PASCASARJANA

DNA PLASMID

 Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal

yang berbeda karakternya dengan DNA

kromosomal, berupa DNA sirkuler yang terdapat di sitoplasma, beruntai ganda serta mampu

secara independen bereplikasi.

 Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan

terletak di luar kromosom dalam sel prokariot khususnya bakteri dan sel eukariot tingkat rendah seperti khamir.

TAHAP ISOLASI DNA PLASMID

 Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui

proses :

1. isolasi plasmid 2. elektroforesis

3. visualisasi menggunakan sinar ultraviolet (UV)

I

SOLASI

DNA

Prinsip Isolasi DNA

Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA

dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi

jaringan tersebut sehingga akan

terbentuk ekstrak sel yang terdiri DNA, RNA dan substansi dasar lainnya

• Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,lemak, dan karbohidrat.

Isolasi

• Pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein

Ekstraksi _{• Menghilangkan}

beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida, RNA dan juga protein.

M

ETODA

I

SOLASI

DNA

B

AKTERI

Kultur Bakteri (E.Coli)

- Kultur selama 1 malam

- Sentrifuge (mengambil kultur dan menghilangkan medium)

Larutan I (glucose)

Larutan II

(NaOH & SDS)

NaOH : merusak membran sel SDS : sabun untuk menghancurkan membran sel Larutan III (netralisasi) - sentrifuge Menggumpal & menyatu Supernatan (berisi DNA)

Indikator untuk melihat lendir-lendir dimulut tabung yang menandakan bahwa bahwa membran sel

telah terpecah

Jika ada larutan berkonsentrasi tinggi masuk ke dalam sel, dengan sendirinya

membran sel akan rusak

- Treatment PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol)

DNA bebas dari komponen lain

+ etanol 100% dan NaAc (membantu pengendapan)

Pengendapan

- Inkubasi

- Cuci dengan EtOH 70%

- Keringkan

T

AHAPAN

I

SOLASI

DNA P

LASMID

1. Sampel bakteri Escherichia coli yang diinkubasi

dalam suhu 370 _{C dan dalam waktu 1 malam.}

2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair

dengan menggunakan mikropipet.

3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung

eppendorf 15 ml

4. endapkan bakteri dengan microsentrifuge

dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan.

5. supernatan dibuang, kemudian menambahkan

2 ml larutan A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam pelet.

T

AHAPAN ISOLASI

DNA P

LASMID

6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm. 7. Ditambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke

dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian dibolak-balik 4-6 kali

8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu

memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga terbentuk supernatan dan pelet.

9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan

memasukkan ke dalam tabung yang baru kemudian didiamkan selama 1 malam

FUNGSI- FUNGSI SENYAWA

 EDTA : ethylenediami tetraacetic acid :

Menginaktivasi enzime DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi

 Tris-HCl ( Thrometamine HCL) : merupakan

buffer yang menjaga pH, melindungi isi sel agar tidak lisis

 NaOH (Natrium Hidroksida) merupakan alkali

yang berfungsi merusak membran sel

 SDS (sodium dodecyl sulfate): merupakan

detergen, yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein.

T

AHAP PRESIPITASI

(

PENGENDAPAN

)

1. tambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam.

2.Simpan ke dalam freezer dengan

suhu 20_{C sampai -4}0_{C selama 1 jam.}

3.Endapkan DNA plasmid dengan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.

4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di atas tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.

FUNGSI ZAT

 NaOAc (Sodium Asetat ): sebagai senyawa

berbentuk larutan untuk presipitasi yakni mengendapkan DNA.

TAHAP PEMURNIAN.

1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh

dengan menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit.

2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel

di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit.

3. Menambahkan 50 mikrolit dH₂O pada DNA

plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip sampai bercampur.

4. Menghisap larutan dengan mikropipet tip dan

memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

FUNGSI ZAT-ZAT

1. ethanol 70 % untuk membersihkan sisa-sisa

larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh plasmid yang murni.

2. mikrolit dH₂O berfungsi melarutkan DNA agar

DNA yang diendapkan tercampur (Brown 2010).

METODE

P

OLYMERASE

C

HAIN

R

EACTIONS

(PCR)

 Sebanyak 33,6 mL ddH₂O (Water Nucleus

Free) dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf. Kemudian ditambahkan kromosom (template DNA)1 mL; primer forward 16s rRNA dan primer reserve 16s rRNA 2 mL;dNTP (10mM) 1 ml; 5 ml buffer (dapar) PCR dan Mg2+ _(MgCl

2)sebanyak 5

mL.

 PCR (tahap denaturasi awal 94 0C selama

dua menit; penempelan (annealing) 48 0_{C selama}

satu menit, extention 72 0_{C selama satu menit,}

ELEKTROFORESIS

 Produk PCR dielektroforesis dan hasil

elektroforesis dilihat dibawah sinar UV 312 nm menggunakan alat transilluminatorUV (Cole-Palmer)

 Sebagai penampak bercak digunakan ethidium

Disusun oleh :

Dian RamadhaniTanjung

NPM : 8136173005

Pendidikan Biologi A

PLASMID



Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler

(tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di

dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi

secara autonom



Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa

molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui

teknologi DNA rekombinan.

Beberapa hal yang dapat menyebabkan plasmid dapat

digunakan sebagai wahana (vektor) kloning :

 Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;

 DNA-nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia;

 Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi

 Mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;

 Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu.

TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID

1.

Tahap kultivasi dan harvesting

2.

Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid

3.

Tahap pemurnian DNA plasmid

Tahap kultivasi dan Harvesting

Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri

untuk

memperbanyak

diri

sehingga

pada

saat

pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang

banyak. Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini

adalah

E. coli

yang telah tersisipi plasmid.

Kultivasi dimulai dengan tahapan sebagai berikut:

1. Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam.

2. 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.

3. Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HCl pH 8,100mM NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.

4. 10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan. 5. Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.

6. Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C.

7. Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml. 8. Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan.

9. Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml.

10. Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelansehingga timbul benang-benang halus DNA

11. Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%. 12. Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet

dikeringkan.

Fungsi Zat – Zat

1.

LB ( Lactose broth ) yang terdiri dari Pepton dan ekstrak beef

menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri.

Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat

difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan

pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform.

Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef;

0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.

2.

Sentrifugasi

adalah proses yang memanfaatkan gaya

sentrifugal untuk sedimentasi campuran dengan menggunakan

mesin sentrifuga atau pemusing

3.

Tris HCl pH, NaCl, EDTA, SDS

berfungsi untuk

4. TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan

EDTA pada konsentrasi tertentu berfungsi sebagai larutan

penyangga , memiliki kapasitas buffering terendah tetapi

memberikan resolusi terbaik untuk DNA yang lebih besar

Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid)

sebanyak yang diperlukan.

2. Tahap Resuspensi dan Lisis DNA Plasmid

Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas

membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas

lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan

sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid

bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and

Parkers, 1999).

Lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa

kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS

(sodium dodesil sulfat).

Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid:

1. Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke dalam tabung yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik.

2. Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam. 3. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

4. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1, didiamkan dalam es selama 5 menit.

5. Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5 menit.

6. Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara membolakbalikkan, diinkubasi dalam es selama 5 menit.

7. Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. 8. Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang.

9. Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur denga Vortek.

Fungsi Zat – zat

Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.

Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel yang menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA).

Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan).

Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA.

3. Tahap pemurnian DNA plasmid

1. Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan

CIAA dengan perbandingan 1:1 (v/v).

2. Dicampur dengan vortek.

3. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas

diambil.

4. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan

ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk

memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA.

5. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase

dan diinkubasi pada 37°C semalam.

6. Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol

absolut dingin.

7. Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC

selama 10 menit.

8. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet

dicuci dengan ethanol 70%.

9. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

10. Pellet dikeringkan, ditambahTE 50

μ

l, masukkan ke dalam

tabung.

11. Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk

digunakan lebih lanjut pada suhu - 20

0

_{C. jika perlu DNA}

dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian

DNA.

Fungsi Zat – zat

Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer,

presipitasi, dan pembilasan DNA plasmid.

Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin

masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama.

Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan

single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut.

etanol absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan

juga untuk membilas dan mencuci plasmid.

Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada

gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan

menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif.

Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk

menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak

ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah

terpresipitasi.

Uji Kuantitas

Uji Kuantitas DNA dilakukan dengan spektrofotometer UV

dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA

yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan

protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA

pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio

OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif

murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi

pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi

konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda

tiap ml (Suharsono danWidyastuti, 2006)

Uji Kulitas



_{Uji Kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis. DNA yang}

terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr),

kemudian dilihat di atas sinar ultra violet



Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu

harus ditambahkan loading buffer (

dye)



_{Pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan}

ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan

DNA standar

PCR

Sebanyak 5µl komposisi PCR koloni yang telah di

mix

dengan

0,3 µl primer L1 dan 0,3µl primer L2, selama dalam mesin

PCR dilakukan pradenaturasi pada suhu 95ºC selama 5 menit,

berlanjut terjadinya denaturasi selama 5 menit, proses

annealing

pada suhu 52ºC selama 30 menit, kemudian

extension 72ºC selama 2 menit dan proses akhir selama 10

menit.

Restriksi

Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali

urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di

antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut.

Enzim yang digunakan dalam isolasi DNA plasmid adalah

Enzyme tipe II yang menghasilkan fragmen-fragmen tertentu

dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa.

Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara

sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam.

Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA

Plasmid

Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen, 2 ul larutan penyangga reaksi 10x (10%), 1 ul enzim restriksi (10 unit/ul) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan urutan: dH2O, larutan penyangga, DNA plasmid, enzim).

Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C

Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi dan/enzim restriksi ditambahkan lagi.

Bila telah terpotong, aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65-70°C.

Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. NotI, 2. EcoRI, 3. HindIII, 4. SacI, 5. EcoRI dan HindIII, 6. HindIII dan SacI, 7. NotI dan HindIII, 8. NotI dan EcoRI.

ISOLASI

DNA PLASMID

M. K : BIOTEKNOLOGI

JHONAS DONGORAN ( 8136173010 )

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI ( Kelas- A ) PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2014

ISOLASI DNA

DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua

kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin

dan pirimdin.

DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat

berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang

menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.

Isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom

dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman,

kultur mikroorganise, atau sel manusia.

PLASMID

PLASMID :

Molekul DNA utas ganda sirkular, berukuran kecil yang

terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan

KARAKTER PLASMID

1.

Dapat melakukan replikasi

2.

Terdapat di luar kromosom

3.

Secara genetik dapat ditransfer dengan stabil

KELOMPOK PLASMID

1.

Plasmid F (fertilitas) ---- gen

tra

(konjugasi)

2.

Plasmid R (resisten) ---- antibiotik, L.B.

3.

Plasmid dengan penyandi toksin dan bakteriosin

4.

Plasmid degradatif ---- metabolisme mol. organik

(

Pseudomonas putida

)

5.

Plasmid virulensi ---- patogenitas sel inang

Isolasi DNA Plasmid

Isolasi DNA plasmid adalah menghancurkan membran

sel sehingga semua organel sel dapat keluar, sehingga

didapatkan

DNA

kromosomal

serta

DNA

ekstrakromosmal (plasmid).

Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu

boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,

alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang

paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode

alkaline lysis.

Tahapan Isolasi DNA Plasmid

1)

Tahap kultivasi dan harvesting

Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi

bakteri untuk memperbanyak diri sehingga

pada saat pemanenan didapatkan plasmid

dalam jumlah yang banyak.

Kultivasi dimulai dengan tahapan sebagai berikut:

- Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam. - 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.

- Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HCl pH 8,100mM NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.

- 10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan. - Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.

- Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C. - Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml.

- Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan.

- Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml.

- Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelansehingga timbul benang-benang halus DNA.

- Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%.

- Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan. - Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.

2)

Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid

Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA.

Berikut ini adalah prosedur resuspensi

dan lisis DNA plasmid:

 Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke dalam tabung

yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik.

 Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam.  Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

 Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1, didiamkan

dalam es selama 5 menit.

 Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5 menit.

 Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara membolakbalikkan,

diinkubasi dalam es selama 5 menit.

 Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.  Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang.

 Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur dengan

Vortek.

3) Tahap pemurnian DNA plasmid

Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi, dan pembilasan DNA plasmid. penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan -pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

Tahap pemurnian meliputi sebagai

berikut :

 Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan

perbandingan 1:1 (v/v).

 Dicampur dengan vortek.

 Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil.

 Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI

(fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA.

 Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada

37°C semalam.

 Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin.  Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit.

 Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol 70%.  Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

 Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 μl, masukkan ke dalam tabung.

 Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada suhu

Fungsi-fungsi Zat / Senyawa



EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil

sulfat). fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara

mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan

integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim

nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang

merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak

membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Untuk

menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat

protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan

protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk

memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan

DNA.

Lanjutan,,,!!!



Na Asetat

Fungsinya membuat konsentrasi garam tinggi dan single

stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol

absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk

membilas dan mencuci plasmid.



Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge

pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan

menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam

air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih

lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air

(ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan - pada O).

Lanjutan

,,,!!!



Fungsi penambahan pelarut organik seperti

etanol adalah untuk menurunkan konstanta

dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan

DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih

mudah terpresipitasi.

SELESAI

Tahapan Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri

Escherchia Coli

Oleh:

Maiderawati (8136173012) Program Studi Pendidikan Biologi

Program Pascasarjana Universitas Negeri Medan

2014

Dosen Pengampu:

Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain di inti sel.

Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri, berutas ganda, dan berbentuk sirkuler (Jusuf, 2001). Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan terletak di luar kromosom dalam sel prokariot khususnya bakteri dan sel eukariot tingkat rendah seperti khamir. Plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan Escherichia coli sebagai inang sehingga dalam rekayasa genetika, plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang.

Tahapan Isolasi DNA plasmid dari bakteri

Escherchia coli

Tahap isolasi

1. Menyiapkan kultur bakteri Escherichia coli yang diinkubasi dalam suhu 370 _C dan dalam waktu 1 malam.

2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan menggunakan mikropipet. 3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml.

4. Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan.

5. Membuang supernatan kemudian menambahkan 2 ml larutan A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam pelet.

6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm.

7. Menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian dibolak-balik 4-6 kali.

8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga terbentuk supernatan dan pelet.

9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan ke dalam tabung yang baru kemudian didiamkan selama 1 malam.

Fungsi Zat-zat

o EDTA dapat berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil.

o Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada pH nya.

o NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan mulai menghidrolisis RNA.

o SDS berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan mendenaturasi protein

Tahapan DNA plasmid (Lanjutan)

Tahap presipitasi

1. Menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam.

2. Menyimpannya ke dalam freezer dengan suhu -20C sampai -40C selama 1 jam.

3. Mengendapkan DNA plasmid dengan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.

4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di atas tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.

Fungsi Zat-zat

o

NaOAc adalah garam buffer yang membantu proses

pengendapan.

o

Ethanol

absolut

berguna

untuk

mengendapkan

Tahapan Isolasi DNA Plasmid (Lnjutan)

Tahap pembilasan

1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit.

2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit.

3. Menambahkan 50 mikrolit dH₂O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur.

4. Memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

Fungsi Zat-zat

o

Ethanol 70 % berfungsi untuk membersihkan

sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan

plasmid

sebelumnya

sehingga

dapat

diperoleh

plasmid yang murni.

o

dH

₂

O steril yang berfungsi untuk melarutkan DNA

Daftar Pustaka

Akmalia, L. 2012. Tahapan DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli, (Online),

(http://lulluakmalia.blogspot.com/2012/10/laporan-praktikum-bio-logi-sel-uler-mol.html, diakses 14 Januari 2014).

Febrina, G, Dkk. 2011. Isolasi DNA Plasmid, (Online), (http://kampungbiologi.blogspot.com/2011/10/isolasi-dna-plasmid.html, diakses 14 Januari 2014).

Lab Biomol. 2011. Isolasi DNA, (Online), (http://labbiomol.blogspot.com/2012/12/v-behaviorurldefaultvmlo_17.html, diakses 14 Januari 2014).

Mubin, A.M. 2013. Isolasi Plasmid Dna Bakteri (E. coli), (Online),

(http://duniapeternakanunram.blogspot.com/2013/12/tugas-pengantar-bioteknologi-isolasi_1580.html, diakses 14 Januari 2014).

Prima. 2011. Isolasi Plasmid Dan Elektroforesis, (Online), (http://prima31.wordpress.com/2011/03/18/isolasi-plasmid-dan-elektroforesis/, diakses 14 Januari 2014).

Waliyuddin , M. 2013. Isolasi Dan Pemurnian Dna Plasmid, (online),

(http://muhammadwaliyuddin10.blogspot.com/2013/01/laporan-praktikum-tanisolasi-dan.html, diakses 14 Januari 2014)

ISOLASI DNA PLASMID

OLEH : SISKA OBERLINA PURBA

NIM : 813 6173014

DOSEN PENGAMPU :

Dr. FAUZIYAH HARAHAP, M.Si

PROGRAM PASCA SARJANA PENDIDIKAN BIOLOGI

UNIVERSITAS NERGERI MEDAN 2014



_Plasmid

_merupakan

_salah

_satu

_vektor

pembawa molekul DNA di dalam proses

rekayasa DNA melalui teknologi DNA

rekombinan.

Plasmid

banyak

sekali

digunakan dalam pengklonan DNA, karena

relatif

mudah

dalam

penanganannya.

Plasmid adalah molekul DNA utas ganda

sirkuler (tidak berujung) yang berukuran

kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan

dapat melakukan replikasi secara autonom

(Suharsono dan Widyastuti, 2006).

 Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah :

a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;

b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia;

c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi;

d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;

e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994).

Tahapan Isolasi Plasmid pada Bakteri

E.Coli

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu

 tahap kultivasi dan harvesting, yakni memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak .

 tahap lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat).

 tahap pemurnian DNA plasmid menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan).

Sambungan...

 Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB (bacto tryptone 10g/l, bacto-yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama semalam.

 Kemudian 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm (Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7.5 + EDTA) dan di-vortex.

 Kemudian ditambah 200 ul buffer lisis (0.2M NaOH, 1% SDS). Suspensi dihomogenkan dengan membolak-balik tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit.

 Buffer netralisasi (1,32M Na-asetat pH 4,8) ditambahkan sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit.

 Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C semalam.

 Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Na-asetat pH 5,2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol absolut untuk mengikat air.

 Setelah diinkubasi pada 30°C selama 2 jam, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit.

 Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 10 menit pada 4°C.

 Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Selanjutnya pelet dilarutkan ke dalam buffer TE (Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM).

Fungsi Zat-zat

 EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.

 Buffer TE Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada pH nya.

 SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel atau DNA (DNA double strain menjadi single strain).

 NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan mulai menghidrolisis RNA. Sehingga DNA kromosomal akan kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi dan yang dapat diperoleh setelah proses ini kemungkinan besar adalah DNA plasmid.

Sambungan...

 PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid.

 RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA.

 natrium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi.

 phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan).

 Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).

Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi

DNA dengan Spektrofotometer



_Suspensi

_DNA

_plasmid

_diencerkan

_dengan

mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau TE.

Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca

absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm

dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang

gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam

konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas

ganda tiap ml. Untuk mengetahui kemurnian DNA

terhadap kontaminan protein, nilai absorbansi 260

nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.

Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan

Elektroforesis Gel Agarosa

 Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x (Tris-HCl pH 8,3 40 mM, asam asetat pekat 1,98 mM, EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mM, asam borat 83 mM, EDTA 1 mM), dipanaskan hingga jernih dengan microwave.

 Setelah suhu tidak terlalu panas (60°C), gel dicetak dengan menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran, lalu dibiarkan beku. Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur dengan larutan pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%, xylene cyanol FF 0,25%, sukrosa 40%).

 Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker, λ yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai migrasi, direndam dengan larutan etidium bromide, dan dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 ng. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.

OLEH : Elena Mayanti Nduru 813673008 Pendidikan Biologi A’ 2013

PRORAM STUDI MAGISTER PENDIDIKAN BIOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN T.P. 2013/2014



Plasmid adalah molekul DNA utas ganda

sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil

yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat

melakukan

replikasi

secara

autonom

(Suharsono dan Widyastuti, 2006)



Plasmid banyak sekali digunakan dalam kloning

gen

karena

relatif

mudah

dalam

penanganannya. Untuk itu, DNA plasmid harus

diisolasi.

1.

Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung

plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB

semalaman pada suhu 37°C

2.

sebanyak 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam

tabung 1,5 ml

3.

Diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm

(Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit.

4.

Endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100



l buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7.5 +

EDTA), di-vortex



Media LB : Luria-Bertani media : media

pertumbuhan bakteri yang terdiri dari ekstrak

ragi, tryptone/pepton, dan NaCl



Tris HCl : Thrometamine HCl : buffer penjaga

pH, melindungi isi sel agar tidak lisis



EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid :

Menginaktivasi enzim DNAse yang dapat

mendenaturasi DNA yang diisolasi

5.

Ditambah 200



l buffer lisis (0.2M NaOH, 1%

SDS)

6.

Suspensi dihomogenkan dengan

membolak-balikkan tabung sebanyak 6-8 kali

7.

Didiamkan selama 3 menit

8.

Ditambahkan Buffer netralisasi (1,32M

Na-asetat pH 4,8) sebanyak 300



l.

9.

Tabung dibolak-balik agar suspensi menjadi

homogen

10.

Disentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10



NaOH : Natrium Hidroksida : larutan basa

berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA

(DNA double strain menjadi single strain).



SDS : Sodium Dodesil Sulphate) : merupakan

deterjen yang berperan untuk melisis dinding

atau membran sel yang terdiri dari lipid

(fosfolipid).



Na-Asetat

:

Sodium

asetat

:

Untuk

11.

Supernatan ditransfer ke tabung yang baru

12.

Diekstraksi dengan PCI

(fenol-kloroform-isoamil alkohol)

13.

Fase air (supernatan) yang mengandung DNA

di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C

semalaman

14.

DNA diendapkan dan ditambahkan Na-asetat

pH 5,2 dan etanol absolut

15.

Diinkubasi pada 30°C selama 2 jam

 PCI : fenol-kloroform-isoamil alkohol : pelarut organik untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya

 Rnase : enzim yang memisahkan antara DNA dan RNA, melisis RNA

 Na-Asetat : Sodium Asetat : Untuk menetralkan pH

 Etanol : mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi.

17.

Pelet dibilas dengan etanol 70%

18.

Disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 10

menit pada 4°C

19.

Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan.

20.

Pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8



Etanol 70% : Untuk mendapatkan pelet yang

murni



TE : Tris HCl-EDTA : Menjaga Struktur DNA

tetap seimbang, menetralisir DNA agar tidak

rusak