batan
Badan Tenaga N uklir N asional
Tangerang Selatan 21-23 November 2017
PEMBUATAN KIT MACROAGGREGATED
ALBUMIN (MAA) UNTUK
PERFUSI PARU
Wening Lestari*, Suharmadi, Sri Aguswarini L, Karyadi, Enny Lestari, Triningsih,
Dede Kurniasih, Sri Setiyowati, Yulianti Susilo
PTRR-BATANSerpong wening@batan.go.id
ABSTRAK
Pembuatan dan kendali mutu kit Macroaggregated Albumin (MAA) telah dilakukan untuk ditandai dengan teknesium-99m (99mTc). Kit MAA-99mTc tersebut akan digunakan untuk perfusi paru. Kit kering MAA telah dibuat secara aseptis dan dianalisis pH, kemumian radiokimia, ukuran dan jumlah partikel, sterilitas, pirogenitas, serta uji biodistribusi. Hasil penandaan MAA dengan 99mTc dianalisis dengan kromatografi kertas eluen metanol 85% dan kertas Whatman no. 1 sebagai fase diam, sedangkan uji sterilitas dilakukan menggunakan medium perbenihan cair Fluid Thioglycolate (FTG) dan Trypton Soy Broth (TSB). Uji in vivo pada hewan percobaan dilakukan pada mencit jantan. Hasil percobaan menunjukkan pH kit adalah 5, kemumian radiokimia 99,4%, uji sterilitas menunjukkan tidak terjadi pertumbuhan mikroba dalam media uji serta uji pirogenitas tidak menunjukkan kenaikan temperatur yang berarti pada hewan coba. Biodistribusi pada mencit jantan menunjukkan partikel yang terdistribusi didalam paru adalah 84,85% sedangkan persentase partikel di dalam hati sebesar 1,54%. Rasio partikel didalam paru terhadap hati adalah 55:1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kit MAA yang dibuat telah memenuhi syarat untuk radiofarmaka injeksi.
Kata kunci : macroaggregated,albumin, radiokimia, biodistribusi, perfusi
ABSTRACT
FORMULATION OF MACROAGGREGATED ALBUMIN (MAA) KIT FOR LUNG
PERFUSION. Formulation and quality control of Macroaggregated Albumin (MAA) kit to be labelled with technetium-99m (99mTc)have been carried out. These 99mTc-MAA kit to be use for pulmonary perfusion Lyophilized MAA kit was prepared aseptically and analyzed for its pH, radiochemical purity, amount and particle size, sterility, pyrogenicity, biodistribution test. The labelled MAA with 99mTcwere analyzed by paper chromatography method with 85% methanol as eluent and Whatman-1 paper as stationary phase, while the sterility test was performed using fluid thioglycolate (FTG) and trypton soy broth (TSB). In vivo study was carried out in male mice. The experimental results showed that the pH of the kit was 5, radiochemical purity 99.4%, the sterility test showed no microorganisms growth in culture media, no significant increase in temperature of experimental animals. Biodistribution in male mice showed that the distributed particles in the lung were 84.85% while the percentage of the particles in the liver was 1.54%. The ratio of particles in the lungs to the liver is 55: 1. The results showed that the MAA kit made was eligible for radiopharmaceutical injection.
batan
Seminar Pendayagunaan
Teknologi N uklir 2017
Badan Tenaga Nuklir Nasional
Tangerang Selatan 21-23 November
2017
~
SENPATENPENDAHULUAN
IImu kedokteran nuklir semakin hari semakin berkembang baik untuk diagnosa maupun terapi. Salah satu perkembangannya adalah Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) yang digunakan untuk pencitraan menggunakan kit radiofarmaka yang sudah ditandai dengan radioisotop. SPECT secara luas digunakan sebagai sarana untuk membantu diagnosa berbagai penyakit [1]. Kit radiofarmaka SPECT telah banyak dikembangkan dan sebagian besar merupakan produk luar negeri. Saat ini, Pusat Teknologi Radioisotop dan Radiofarmaka (PTRR) bekerjasama dengan PT Kimia Farma telah berhasil memproduksi dan mendapatkan ijin edar kit radiofarmaka seperti DTPA, MISI, MDP, MISG. Dengan didapatkannya ijin edar tersebut, rumah sakit dapat menggunakan kit radiofarmaka buatan dalam negeri. Selain keempat kit tersebut, rumah sakit juga membutuhkan kit MM yang sementara ini diperoleh dengan cara impor.
Macroaggregated Albumin
(MM)
merupakan suatu kit yang digunakan dalam pencitraan paru paru untuk mengetahui gangguan sirkulasi di daerah paru paru [2,3,4,5]. Kit MM digunakan untuk pencitraan dengan cara ditandai dengan teknesium 99m (99mTc_). Kit 99mTc-MM telah lama dikembangkan di luar negeri sejak tahun 1974 [6]. Meskipun MM telah lama dikembangkan dan telah banyak teknik
preparasinya namun ternyata
reproduksibilitasnya rendah, terutama dalam hal distribusi ukuran partikel dan terbentuknya agregat partikel partikel dalam MM [7,8]. MAA terdiri dari Human Serum Albumin (HSA) yang teragregasi dengan distribusi ukuran antara 10-90 IJm, dan tidak boleh ada satu partikelpun yang lebih besar dari 150 IJm [9,10,11].
Kit MM yang dibuat ini termasuk dalam sediaan radiofarmaka injeksi, yang disuntikkan kedalam tubuh pasien untuk diagnosa perfusi paru. US Food and Drug Administration (FDA) menyebutkan bahwa semua senyawa bertanda yang digunakan untuk diagnosa maupun terapi dikategorikan sebagai radiofarmaka dan harus steril, be bas pirogen, aman digunakan untuk manusia dan mempunyai kegunaan yang spesifik [12 ]. Oleh karena itu, dalam penelitian ini setelah kit MM diperoleh dilakukan uji kendali mutu yang meliputi pH, kemurnian radiokimia, ukuran partikel, sterilitas, pirogenitas serta biodistribusi. Kit MM harus memenuhi syarat seperti yang tercantum di dalam US Pharmacopeia (USP), yaitu pH kit 3,8-8, kemurnian radiokimia > 90%, mempunyai partikel ~ 90% yang berukuran 10-90 IJm, tidak ada satupun partikel berukuran ~ 150
28
IJm. Kit MM harus steril dan bebas pirogen [13]. Seperti yang disebutkan didalam USP, partikel MM yang terdistribusi didalam paru minimal 80% dan tidak lebih dari 5% partikel terdistribusi didalam hati. Distribusi partikel didalam tubuh dapat diketahui dari hasil uji biodistribusi pada hewan coba.
METODOLOGI
a. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah Human Serum Albumin (HSA), SnCI2, asam askorbat produksi dari Sigma Aldrich, salin, aquades produksi IPHA, gas nitrogen, filter 0,22 IJm (Millipore), NaOH, glukosa, HCI, metanol produksi Merck, kertas Whatman nomor 1. Hewan percobaan yang digunakan ialah mencit yang diperoleh dari BBPMSOH. Uji sterilitas kit dilakukan menggunakan medium pembenihan Fluid Thioglycolate (FTG, Merck) dan Trypton Soy Broth (TSB, Merck).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik (Denver), magnetic stirrer/hot plate (yellow line), sentrifus (Hettie), termometer (Boeco), hemasitometer (Assistant), mikroskop (Ceti), gamma counter (Capract-t). b. Pembuatan kit MAA
20 mgram SnCI2 dilarutkan dalam 20 IJL HCI pekat dan ditambahkan 10 mL salin. Larutan diaduk selama 15 menit sambil dialiri gas nitrogen kemudian ditambahkan ke dalam 100 mgram HSA yang telah dilarutkan dalam 5 mL salin. Larutan tersebut dialiri gas nitrogen selama 15 men it, disaring dengan menggunakan penyaring 0,22 IJm. Larutan ditambah dengan 75 mL salin dan diaduk selama 5 menit sambil terus dialiri gas nitrogen. pH diatur menjadi 5-6 dengan larutan NaOH 0,1 N dan dibiarkan selama 5 menit sehingga tercapai kesetimbangan. Setelah tercapai kesetimbangan, ke dalam larutan tersebut ditambahkan salin sehingga volume total 100 mL, kemudian larutan dipanaskan pada suhu 75-80°C selama 30 menit sambil diaduk dengan kecepatan 900 rpm. Setelah itu larutan didinginkan sampai mencapai suhu kamar dan disentrifius selama 5 menit pada kecepatan 2500 rpm untuk memisahkan partikel yang terlalu kecil dan juga partikel yang besar. Supernatan yang ada dibuang dan ditambahkan salin, disentrifius lagi sebanyak dua kali. Setelah selesai ditambahkan 100 mL salin, 400 mgram glukosa dan asam askorbat. Larutan didispensing kedalam vial dengan volume 1 mL per vial. Kit MM hasil formulasi dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer.
batan
Badan Tenaga Nuklir Nasional
Tangerang Selatan 21-23 November 2017
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ukuran partikel MAA berada pada rentang 10-90 IJm dan jumlahnya lebih dari 90 %, serta tidak ada satupun partikel yang berukuran 150 \-1mseperti terlihat pada Gambar 2.
radioaktivitasnya. Setiap percobaan dilakukan triplo. Syarat kit MAA, distribusi partikel didalam paru 2: 80%, dan persentase partikel didalam hati ::;5% [13].
Uji pirogenitas dan biodistribusi dilakukan setelah mendapat ijin penggunaan hewan coba dari Komite Etik Penggunaan dan Pemeliharaan Hewan Percobaan (KEPPHP) BATAN dengan nomor 001/KEPPHP-BATAN/IV/2016.
Kit kering MAA telah diperoleh melalui proses formulasi yang aseptis dan dilakukan di dalam
clean room.
Kit yang dihasilkan ini nantinya akan digunakan untuk uji klinik di rumah sakit sebagai sediaan radiofarmaka injeksi. Oleh karena itu perlu dilakukan uji kualitas terhadap kit yang dihasilkan yang meliputi pH, kemurnian radiokimia, ukuran partikel, sterilitas, pirogenitas dan biodistribusi. Parameter tersebut merupakan syarat dari sediaan radiofarmaka injeksi [12,13].Kit MAA yang telah diformulasi mempunyai pH 5 dan kemurnian radiokimia sebesar 99,4%. Kemurnian radiokimia ini dianalisa dengan menggunakan metode kromatografi kertas, dapat dilihat pada Gambar 1. senyawa 99mTc-MAAberada pada retensi (Rf) not dan 99mTc_bebas berada pada retensi (Rf) 0,5-0,6. 1600000 1400000 1200000 10 8 6 4 Nomor Migrasi 2 o
Gambar 1. Radiokromatogram 99mTc_MAA
-2
g. Uji pirogenitas
Kit MAA dilarutkan dengan 1 mL larutan NaCI fisiologis pro injeksi. Larutan disuntikkan pada 3 ekor kelinci melalui vena telinga, dan diamati kenaikan suhunya pada 1 jam setelah penyuntikan. Kit dinyatakan bebas pirogen apabila kenaikan suhu tiap kelinci tidak lebih dari 0,6°C dan jumlah kenaikan temperatur ketiga ekor kelinci tidak lebih dari 1AOC.
e. Pengukuran partikel MAA
Kit kering MAA yang telah dilarutkan dengan 1 mL salin ditotolkan pad a hemositometer dan diamati di bawah mikroskop. Syarat ukuran partikel kit MAA adalah partikel yang berukuran 10-90 IJm tidak kurang dari 90% dan tidak ada partikel yang berukuran 2:150 \-1m[13].
f. Uji sterilitas
Media cair FTG sebanyak 1 ml ditambahkan ke dalam vial yang berisi kit MAA dan 1 ml media cair TSB ditambahkan ke dalam vial lainnya . Larutan kemudian dikocok hingga larut. Vial yang mengandung media cair FTG disimpan di dalam inkubator dengan suhu 30 - 35°C untuk mengetahui pertumbuhan bakteri, sedangkan vial yang mengandung media TSB disimpan pada suhu 20-25°C untuk mengetahui pertumbuhan jamur. Kit dinyatakan steril apabila tidak terjadi
kekeruhan pada media uji setelah penyimpanan selama 14 hari. Kekeruhan menunjukkan adanya pertumbuhan jamur dan atau bakteri.
d. Prosedur penandaan dengan 99mTc.
Sebanyak 6 mCi larutan natrium perteknetat 99mTc ditambahkan ke dalam kit kering MAA
,kemudian larutan dikocok dan didiamkan selama 10 menit. Kemurnian radiokimia dianalisa dengan kromatografi kertas menggunakan kertas Whatman nO.1 sebagai fase diam dan larutan metanol 85% sebagai fase gerak. Radioaktivitas kromatogram diukur dengan alat gamma counter (alat pencacah gamma)
c. Pengukuran pH
Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan kertas pH. Larutan 99mTc-MAA ditotolkan pada kertas pH dan diamati tingkat keasaman. Syarat pH adalah 3,8-8 [13].
h. Uji biodistribusi
Uji biodistribusi dilakukan menggunakan mencit jantan. Mencit diinjeksi dengan 0.1 ml 99mTc_
MAA. Mencit dibedah setelah 5 menit, 30 menit, 1 jam, 2 jam dan 4 jam. Organ paru-paru, hati, ginjal, kandung kemih, limpa, lambung, usus, darah dan karkas (ekornya dibuang) diambil kemudian organ-organ tersebut diukur
batan
Seminar Pendayagunaan
Teknologi N uklir 2017
Badan Tenaga Nuklir Nasional
Tangerang Selatan
21-23 Novcmber
2017
SENPAHNGambar 2. Partikel MAA
Ukuran partikel ini merupakan parameter kritis pada pembuatan kit MM. Partikel yang berukuran 10-90 !-1makan terdistribusi di dalam paru sedangkan partikel yang lebih kecil (kurang dari 10 !-1m) akan terdistribusi di dalam hati [12]. Oleh karena itu, partikel yang lebih kecil dari 10 !-1mtidak boleh lebih dari 10%.
Pada uji sterilitas, sampai hari ke-14 tidak terdapat bakteri maupun jamur yang tumbuh pada media cair yang digunakan. Hasil ini menunjukkan bahwa kit MM yang telah diformulasi merupakan sediaan yang steril dan hal ini didukung dengan hasil uji pirogenitas, kenaikan suhu badan kelinci < 0,06°e dan kenaikan suhu total <1 ,4°e seperti pada Tabel1.
Tabel1. Hasil uji pirogenitas kit MAA
Suhu badan kelinci (DC)
Rata Kenaik No Kontrol Rata an kelinci (DC) (DC) Suhu ke-1 ke-2 ke-3 (DC) 39,2 39,23 39,30 39,20 39,203 0,00 39,0 2 39,00 39,100,0339,0039,003 39,0 3 38,93 39,000,0739,0039,000 Kenaikan suhu total
0,10
Oistribusi partikel MM di dalam tubuh dipelajari melalui uji biodistribusi pada mencit. Hasil biodistribusi menunjukkan bahwa lebih dari 80% partikel MM terdistribusi didalam paru seperti ditunjukkan pad a Tabel 2.
30
Tabel2. Hasil biodistribusi kit MM PERSENTASE SETELAHSELANG ORGAN
WAKTU INKUBASIIN VIVO(%) 5 menit 30 menit 1 jam 2jam4jam Kandung Kemih 8.38 1.60 2.685.905.47 Limpa 9.60 1.68 2.685.905.47 Hati 9.59 1.54 2.86 8.258.09 Paru 45.79 84.85 75.26 65.0129.68 Lambung 11.43 1.72 3.07 8.029.47 Ginjal 10.62 1.94 2.82 8.728.22 Usus 10.17 1.66 2.93 8.158.22 Karkas 11.02 3.32 4.819.47 11.68 Darah 9.26 1.79 2.84 6.515.51
Partikel MM yang terdistribusi didalam paru mencapai < 80% setelah 30 menit, dan setelah selang waktu tersebut persentase partikel yang terdapat di paru mulai berkurang. Hal ini sesuai dengan tujuan penggunaan MM untuk pencitraan perfusi paru dimana setelah pencitraan selesai, partikel langsung terdistribusi keluar dari paru dan tereksresikan dari tubuh.
Oistribusi didalam hati disebabkan adanya partikel yang berukuran < 10 !-1m.
KESIMPULAN
Kit Macroaggregated Albumin (MM) telah dibuat dan telah diuji beberapa parameter kendali mutunya. Kit yang dibuat mempunyai pH 5 dengan kemurnian radiokimia sebesar 99,4%.
Lebih dari 90% partikel MAA berukuran 10-90 !-1m,tidak ada satupun partikel berukuran > 150 !-1m dan lebih dari 80% partikel terakumulasi di paru.
Kit MM telah dibuat secara aseptis dalam bentuk kering (liofilisasi) dan telah lolos uji kendali mutu. Kit ini selanjutnya akan digunakan untuk studi in vivo pada man usia.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada seluruh tim di Oirektorat Pengembangan Teknologi Industri Kemenristekdikti yang membantu dalam proses pembiayaan kegiatan ini melalui Program Pengembangan Teknologi Industri Kemenristekdikti. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Ora. Siti Oarwati,M.Sc dan OR.Rohadi Awaludin
batan
Badan Tenaga Nuklir Nasional
Tangerang Selatan 21-23 November 2017
atas dukungan, saran dan bantuannya pada penelitian ini.
DAFT AR PUST AKA
1. RJ OTT, "Single Photon Emission Computed Tomography (Spect)", Department of Physics,lnstitute of Cancer Research & Royal Marsde.n. Hospital,
Downs Rd, Sutton SM2 5PT, Surrey, UK 2. ANONIMOUS, TechneScan® MM 093 Kit
for the Preparation of Technetium Tc 99m Albumin Aggregated], [MPI MM KIT Kit for the Preparation of Technetium Tc 99m Albumin Aggregated Injection Diagnostic - For Intravenous Use.
3. V.L.GA TES.,NSINGH,R.J.LEWANDOWS KI,S.SPIES, R.SALEM,(2015), "Intra arterial Hepatic SPECT/CT Imaging Using 99mTc-Macroaggregated Albumin in Preparation for Radioembolization", The Journal of Nuclear Medicine, Volume 56 (8)
4. D. DJOKIC, D.JANKOVIC T. MAKSIN,( 2002) "Radiochemical Purity and Particles Number Determination of Modified 99mTc_ Macroaggregated Albumin", J.Serb.Chem.Soc,Volume 67 (8-9), 573-579
5. M.A.A.AL-JANABI, Z.M.YOUSIF, A.H.M.KADIM,(1983), "A New Technique for The Preparation of Ready-to-use Macroaggregated Albumin (MM) Kits to be Labelled with 99mTcfor Lung Scanning", J.App\.RadiaUsot, Volume 34 (10),1473-1478
6. A.A COARASA, A.MILERA,
D.CARV AJAL, S.GULEC,
A.J.MCGORON,(2014), "Lyophilized Kit for the Preparation of the PET Perfusion Agent [68Ga]-MM", International Journal of Molecular Imaging.
7. MolLYAS, KH.H.HAIDER, A.SAEEDA,
M.JAVED, Z.SHAMS,
C.SAMEERA,(1998), "In-House Preparation and Characterization of Ready- To-Use Tc99m-Sn-Macroaggregated Albumin Kit for Lung Perfusion Studies", Medical Journal of Islamic Acedemy of Sciences, Volume 11(4),131-138
8. A.K.JABBAR, A.A.AL-SHAMI,
H.M.ABDULKARIM,(2008), "A New Formulation of 99mTc-Macroaggregated Albumin (MM) Freeze-dried Kit for Lungs Scintigraphy", AJPS, Volume 5(1), 67-75 9. ILSE ZOLLE (ed), "Technetium-99m
Pharmaceuticals : Preparation and Quality
Control in Nuclear Medicine", Springer, Belanda, 187-192 .
10. A.P.HUNT, M.FRIER, R.A.JOHNSON, S.BEREZENKO, A.A.PERKINS.(2006), "Preparation of Tc-99m-Macroaggregated Albumin from Recombinant Human Albumin for Lung Perfusion Imaging, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics", Volume 62,26-31
11. J.C.HUNG, M.G.REDFEM,
D.W.MAHONEY, L.M.THORSON,
G.A.WISEMAN, (2000), "Evaluation of Macroaggregated Albumin Particle Sizes for Use in Pulmonary Shunt Patient Studies", Journal of the American Pharmacist Association, Volume 40(1) 12. S. VALLABHAJOSULA, R.P. KILLEEN,
AND J.R. OSBORNE (2010) "Altered Biodistribution of Radiopharmaceuticals: Role of Radiochemical/Pharmaceutical Purity, Physiological, and Pharmacologic Factors", Semin Nucl Med Vo\.40, 220-241 13. US Pharmacopeia 30-NF 25, (2006), The
United States Pharmacopeial Convention
PERTANYAAN:
1. Mengapa uji biodistribusi digunakan mencit jantan?
2. Apa keunggulan kit MM dibandingkan impor?
3. Pada kesimpulan disebutkan bahwa 90% (suatu pernyataan kuantitatif) partikel MM pada kit yang dibuat berukuran 10-90 mikrometer. Angka 90% itu diperoleh dari mana? Jika dari pengamatan secara pandang (hanya yg ditentukan di kaca objek meluruskan saja, yang masih di dalam vial di meja) dan menggunakan indera mata apakah dapat ditulis dalam bent uk kuantitatif (dalam %).
JAWABAN
:
1. Berdasarkan pengalaman kami ketika digunakan mencit betina, saat pembedahan ternyata ada janin di dalam mencit tsb sehingga untuk penelitian kit MM ini yang tidak memerlukan kespesifikan jenis kelamin mencit maka digunakan mencit jantan
2. Kit MM produk PTRR dengan kualitas sebanding dengan kit import akan
batan
Seminar Pendayagunaan
Teknologi Nuklir 2017
Badan Tenaga Nuklir Nasiona1
Tangerang Selatan
21-23 November
2017
SENPATEN~
mempunyai harga yang lebih murah, sekitar setengah dari harga kit import
3. Angka/jumlah 90% diperoleh dan perhitungan partikel MAA berdasarkan ukuran pada kamar hitung hemasitometer. Partikel pada kamar hitung hemasitometer dikelompokkan berdasarkan ukuran 10-90 mikrometer, lebih kecil 10 mikrometer dan 150 mikrometer. Dari ketiga ukuran dihitung jumlahnya dan dihitung persentasenya.
