Universitas Kristen Maranatha iv
ABSTRAK
Analisis Mutasi Gen Pengekspresi Domain B dan C DNA
Polimerase HBV Dari Pasien Yang Terinfeksi
Dengan Titer Rendah.
Natalia, 2006 Pembimbing Utama : Johan Lucianus, dr., M.Si. Pembimbing Pendamping : Ernawati A. Giri Rachman, Ph.D.
Terdapat kontribusi variasi galur HBV terhadap infeksi akut maupun kronis. Replikasi HBV memerlukan enzim reverse transkriptase yang memiliki kekurangan fungsi ’proofreading’. Akibatnya, HBV memiliki kecepatan mutasi lebih besar dibandingkan virus DNA lainnya. Mutan HBV dapat memiliki kenaikan virulensi, yang ditunjukan dengan terjadinya peningkatan replikasi dan resistensi terhadap terapi antivirus. Hal ini terlihat pada resistensi terhadap lamivudine yang berhubungan dengan munculnya varian YMDD akibat mutasi pada domain B dan C reverse transcriptase.
Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui adanya mutasi gen pengekspresi domain B dan C DNA polimerase HBV pada pasien di Indonesia.
Penelitian dilakukan terhadap 9 pasien hepatitis B dengan hasil titer DNA HBV 104-105 IU/mL. Untuk mengamplifikasi fragmen domain B dan C DNA polimerase HBV dilakukan PCR menggunakan primer HBVDNAPolBCFwd2 dan HBVDNAPolBCRev. Fragmen PCR yang didapatkan yaitu sebesar 250 pb kemudian dimurnikan dan disekuensing.
Analisis sekuensing menunjukan tidak adanya mutasi pada semua sampel yang diteliti.
Universitas Kristen Maranatha v
ABSTRACT
ANALYSIS MUTATIONS OF B AND C DOMAIN OF HBV DNA
POLYMERASE GENE TAKEN FROM LOW INFECTED
PATIENTS
Natalia, 2006 First tutor : Johan Lucianus, dr., M.Si. Second tutor : Ernawati A. Giri Rachman, Ph.D.
HBV strains variant contribute to the clinical course of acute or chronic infection. Replication of HBV requires an active viral reverse transcriptase which lack of proofreading activity. Therefore, the mutation rate of HBV is higher than other DNA viruses. HBV mutant could display enhanced virulence with increased level of HBV replication and the resistance to antiviral therapies. It is shown in it’s resistance to lamivudine which is emerged in the YMDD variant HBV with mutation in B and C domain of reverse transcriptase.
The purpose of the experiment is to detect the mutations in B and C domain of HBV DNA polymerase in Indonesia.
This research was applied to nine patients infected with 104-105 IU/mL HBV DNA. Fragmens of B and C domain of HBV DNA polymerase gene were amplified by PCR using HBVDNAPolBCFwd2 and HBVDNAPolBCRev primers. The PCR product was analyzed by agarose gel, purified and sequenced.
Sequence analysis showed that there is no mutation in all samples being amplified.
Universitas Kristen Maranatha viii
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PERSETUJUAN ...ii
SURAT PERNYATAAN ...iii
ABSTRAK... iv
ABSTRACT... v
PRAKATA ... vi
DAFTAR ISI ...viii
DAFTAR TABEL ... x
DAFTAR GAMBAR ...xi
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Identifikasi Masalah ... 3
1.3 Maksud dan Tujuan... 3
1.4 Manfaat Karya Tulis Ilmiah... 3
1.5 Metode Penelitian... 4
1.6 Lokasi dan Waktu Penelitian ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Epidemiologi... 5
2.2 Gejala Klinis ... 7
2.3 Cara Penularan ... 7
2.4 Komponen Virus ... 7
2.4.1 DNA Polimerase dan DNA HBV... 8
2.4.2 HBsAg dan Anti-HBs ... 8
2.4.3 HBcAg dan Anti-HBc... 8
2.4.4 HBeAg dan Anti-HBe... 9
2.4.5 Protein Dari Region X ... 9
2.5 Struktur dan Genom Virus Hepatitis B ... 10
2.6 DNA Polimerase HBV ... 13
2.7 Replikasi Virus Hepatitis B ... 13
2.8 Mutasi HBV... 14
2.9 Pengobatan... 15
2.9.1 Interferon... 16
2.9.2 Lamivudine... 16
2.9.3 Adefovir Dipivoxil... 19
BAB III ALAT, BAHAN, DAN METODE PENELITIAN 3.1 Subjek Penelitian... 21
3.2 Metode Penelitian... 21
3.3 Alat dan Bahan... 22
3.3.1 Alat-Alat yang Digunakan ... 22
3.3.2 Bahan-Bahan yang Digunakan... 22
Universitas Kristen Maranatha ix
3.3.2.2 Reagen Elektroforesis ... 23
3.3.2.3 Pemurnian... 24
3.4 Cara Kerja... 24
3.4.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 24
3.4.2 Pemurnian Hasil PCR ... 25
3.4.3 Sekuensing ... 25
3.4.4 Analisis Hasil Sekuensing... 25
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 PCR dan Pemurnian ... 26
4.2 Sekuensing... 35
4.3 Analisis Hasil Sekuensing ... 35
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ... 37
5.2 Saran... 37
DAFTAR PUSTAKA... 38
Universitas Kristen Maranatha x
DAFTAR TABEL
Tabel 3.1 Titer DNA HBV... 21
Tabel 3.2 Primer-Primer yang Digunakan ... 23
Tabel 4.1 Hasil Perlakuan Pada Sampel ... 35
Universitas Kristen Maranatha xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Distribusi Geografis Prevalensi Hepatitis B Kronis ... 6
Gambar 2.2 Reaksi Biokimia Infeksi HBV Akut ... 6
Gambar 2.3 Mikroskopi Elektron HBV... 9
Gambar 2.4 Genom HBV... 10
Gambar 2.5 Skema Gambaran DNA Polimerase HBV ... 12
Gambar 2.6 Skema Replikasi HBV ... 15
Gambar 4.1 PCR Dengan Primer HBVDNAPolBCFwd dan HBVDNAPolBCRev Disertai Primer P1 dan P2... 29
Gambar 4.2 PCR HBV Dengan Primer HBVDNAPolBCFwd2 dan Primer HBVDNAPolBCRev ... 30
Gambar 4.3 Hasil PCR 50 L... 31
Gambar 4.4 Hasil Pemurnian ... 32
Gambar 4.5 Hasil PCR dari Templat Awal... 33
1
Universitas Kristen Maranatha BAB I
PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Saat ini hepatitis B masih menjadi masalah besar di dunia, dimana diperkirakan terdapat lebih dari 350 juta penduduk dunia menjadi karier kronis (sekitar 5% populasi dunia) (Kasper et al., 2005). Data dari Departemen Kesehatan Indonesia menyebutkan bahwa 14-16 juta penduduk Indonesia telah terinfeksi HBV dan 200.000 penduduk meninggal setiap tahunnya (Achmadi, 2002; Akbar et al., 2004). Infeksi virus hepatitis B (HBV) dapat menyebabkan hepatitis akut (25%) dengan persentase kesembuhan 99%; hepatitis fulminan dengan angka kematian tinggi; hepatitis kronik (5-10%) yang berpotensi menjadi sirosis hepatis dan karsinoma hepar; kondisi tidak bergejala (65%) dengan atau tanpa progresifitas penyakit dan gagal hati. Akibat dari komplikasi yang disebabkan oleh virus hepatitis B ini, angka kematian mencapai 2 juta penduduk dunia setiap tahunnya (Tse-Ling, 2006).
Walaupun sudah terdapat vaksin yang efektif, belum ada terapi antivirus yang benar-benar efektif untuk menyembuhkan pasien hepatitis B kronis (Ono-Nita et al., 1999). Terapi untuk mengatasi hepatitis B kronis diantaranya menggunakan
interferon-α, analog nukleosida seperti lamivudine dan analog nukleotida adefovir dipivoxil (Kasper et al., 2005).
Universitas Kristen Maranatha 2
menghambat progresifitas klinis hepatitis B kronis, meringankan fibrosis atau sirosis dengan mengurangi insidensi decompensasi hepar dan resiko karsinoma hepar (Liu et al., 2005).
Terdapat pula analog nukleotida yaitu adefovir dipivoxil, dengan bentuk aktif adefovir difosfat, yang bekerja menghambat aktivitas enzim reverse transcriptase pada DNA polimerase HBV dengan cara berkompetisi dengan substrat deoxyadenosine trifosfat alami dan menghancurkan rantai DNA setelah bergabung ke dalam DNA virus (Glaxosmithkline, 2001).
Namun lebih dari satu dasawarsa terakhir, diketahui adanya kontribusi variasi galur HBV terhadap infeksi akut maupun kronis (Hunt et al., 2000). Meskipun HBV merupakan virus DNA, replikasinya terjadi melalui RNA yang memerlukan enzim reverse transcriptase. Reverse transcriptase diketahui memiliki kekurangan fungsi ’proofreading’ yang umum terdapat pada polimerase lainnya. Akibatnya, HBV memiliki kecepatan mutasi 10 kali lebih besar dibandingkan virus DNA lainnya dan diestimasikan rata-rata mutasinya adalah 1 nukleotida/10.000 basa/tahun infeksi (Blum et al., 1995). Mutan HBV dapat memiliki kenaikan virulensi, yang antara lain ditunjukan dengan adanya kenaikan replikasi HBV dan atau resistensi terhadap terapi antivirus (Hunt et al, 2000).
Adanya mutan HBV juga berpengaruh pada responnya terhadap penggunaan lamivudine. Penggunaan lamivudine dalam waktu singkat tidak dapat mengeliminasi virus hepatitis B ini secara sempurna. Terapi jangka panjang yang diperlukan untuk mengeliminasi virus hepatitis B ternyata menimbulkan terdeteksinya mutasi pada DNA polimerase. Bersamaan dengan terdeteksinya mutasi ini, terlihat juga adanya peningkatan ALT, DNA HBV dan histologi yang memburuk pada beberapa pasien (Nakanishi et al., 2005).
Universitas Kristen Maranatha 3
Oleh karena adanya kemungkinan mutasi akibat pengobatan ini, menjadi penting untuk mengetahui mutasi yang dapat terjadi pada DNA polimerase HBV pada pasien di Indonesia. Dengan diketahuinya pola mutasi pada pasien penderita HBV di Indonesia, membuka kemungkinan untuk mengembangkan suatu metode deteksi yang dapat digunakan selama pengobatan pasien HBV di Indonesia. Hal ini akan membantu dalam mencari tahap-tahap pengobatan yang lebih tepat. Namun, oleh karena adanya keterbatasan data klinis dari sampel penderita HBV, dicoba untuk mendeteksi sampel yang ada dan mengelompokkannya berdasarkan jumlah titer. Dalam penelitian ini, sampel dikelompokan dalam titer rendah, dengan kisaran IU antara 104-105.
1.2Identifikasi Masalah
Bagaimana pola mutasi gen pengekspresi domain B dan C DNA polimerase HBV di Indonesia? Pola mutasi ini diperlukan untuk pengembangan metode deteksi keberhasilan pada pengobatan hepatitis B.
1.3 Maksud dan Tujuan
1.3.1 Maksud dari karya tulis ilmiah ini adalah untuk mengetahui adanya mutasi gen pengekspresi domain B dan C DNA polimerase HBV pada pasien di Indonesia.
1.3.2 Tujuan dari karya tulis ilmiah ini adalah untuk mendeteksi mutasi gen pengekspresi domain B dan C DNA polimerase HBV pada pasien dengan titer virus rendah pada pasien HBV di Indonesia.
1.4 Manfaat Karya Tulis Ilmiah
Universitas Kristen Maranatha 4
pengobatan. Diharapkan metode yang dikembangkan ini dapat diterapkan selama pengobatan untuk memperoleh pengobatan yang lebih tepat.
1.5 Metode Penelitian
1. Amplifikasi gen DNA polimerase HBV menggunakan PCR 2. Pemurnian
3. Sekuensing gen DNA polimerase 4. Deteksi mutasi
1.6Lokasi dan Waktu Penelitian
Karya tulis ini dibuat melalui kolaborasi dengan kelompok riset Dr. Debbie S. Retnoningrum dari Sekolah Farmasi ITB dan Laboratorium Klinik Pramita. Penelitian dilakukan selama bulan April-Desember 2006 di:
- LP2IKD dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha.
37
Universitas Kristen Maranatha
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Setelah dilakukan sekuensing pada daerah domain B dan C dari pasien dengan
titer rendah (104-105 IU/mL) didapatkan tidak ada mutasi pada semua sampel yang diteliti.
5.2 Saran
38
Universitas Kristen MaranathaDAFTAR PUSTAKA
Anonimus I., Hepatitis B virus.,
http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/malkowski-beate-2004-09-30/HTML/image001-003.jpg; 30 September 2006.
Anonimus II., Electron microscopy HBV., http://www.geocities.com/hbvinfo
/hbvpic.htm;http://www.geocities.com/hbvinfo/hbvsphere.htm;
http://www.
geocities.com/hbvinfo/hbvparticle.htm, 8 November 2006.
Anonimus III., Prevelence of cronic infection hepatitis B., (http://www.ratste
achmicro.com/Assets/Viral_Hepatitis/Hbv_transmission.JPG), 8 November 2006.
Anonimus IV., Replication of HBV., (www.infekt.ch/updown/images/hbv_cycl.gif),
4 Januari 2007.
Achmadi U. F. 2002. The Epidemiology of communicable diseases in Indonesia and
its realtion to the importance of vaccine development. One-day Seminar on the
occasion of 112
thBio Farma Anniversary.
Akbar S.M., Furukawa S., Horiike N., Onji M. 2004. Vaccine therapy for hepatitis B
virus carrier. Curr Drug Targets Infect Disord, Jun; 4(2):93-101.
Blum H.E.A.1995. Variants of hepatitis B, C, and D viruses; molecular biology and
clinical significance. Digestion, 56: 85-95.
Brooks G.F., Butel J.S., Morse SA. 2001. Hepatitis Virus. Medical microbiology.
22nd ed. America:Mc Graw Hill. p. 404-408.
Chang C.N., Skalski V., Zhou J., Cheng Y.C. 2001. Biochemical pharmacology of
(+)- and (-)-2’,3’-dideoxy-3’-thiacytidine as anti-hepatitis B virus agent. J Biol
Chem, 267(31):22414-22420.
Flint S.J., Enquist L.W., Krug R.M., Racaniello., Skalka A.M. 2000. Reverse
Transcription and Integration.: Virology molekular biology, pathogenesis, and
Universitas Kristen Maranatha
39
GlaxoSmithKline. Epivir-HBV. 2001. US product information.
Hunt C.M., McGill J.M., Allen M.I., Condreay L.D. 2000. Clinical relevance of
hepatitis B viral mutation. Hepatology, 31: 1037-1044.
Kasper., Braunwald., Fauci., Hauser., Longo., Jameson. 2005. Chronic hepatitis. Jules
L., Dienstag., Kurt J., Isselbacher: Harrisons’s principles of internal medicine.
16
thed. United State of America:The McGraw-Hill companies. p285-1826,
1829-1830, 1844-1848.
Khouri M.E., Santos V.A.D. 2004. Hepatitis B: Epidemiological, imunillogical, and
serological consideration emphasizing mutation. Rev. Hosp. Clin Sao Paulo,
59(4):789-815.
Liu K.Z., Hou W., Zumbika E., Ni Q. 2005. Clinical features of chronic hepatitis B
patiens with YMDD mutation after lamivudine theraphy. Journal of Zhejiang
University SCIENCE B, 6(12):1182-1187.
Nakanishi H., Kurosaki M., Asahina Y., Onuki Y., Ueda K., Nishimura Y et al. 2005.
Polymerase Domain B mutation is associated with hepatitis relapse during long
term Lamivudine therapy for chronic hepatitis B. Intervirology, 48:381-388.
Ono-Nita S.K., Kato N., Shiratori Y., Masaki T., Lan K.H., Carrilho F.J et al. 1999.
YMDD motif in hepatitis B virus DNA polimerase influences on replication and
lamivudine resistance: A study by in vitro full-length viral DNA transfection.
Hepatology, 29:939-945.
Rosenberg P., Dienstag J. 1999. Therapy with nucleoside analogues for hepatitis B
virus infection. In: Lee W, ed. Hepatitis B. Philadelphia: WB Saunders Company,
1999: 349-361
Seigneres B., Pichoud C., Ahmed S.S., Hantz O., Trepo C., Zoulim F. 2000.
Evolution of hepatitis B virus polimerase gene sequence during famciclovir
therapy for chronic hepatitis B. Institut National de la Sante et de la Recherche
Medicale INSERM Unit 271 and Liver Unit, Hotel Dieu Hospital; JID,
Universitas Kristen Maranatha
40
Stuyver J.L., Locarnini S.A., Lok A, Richman D.D., Carman W.F., Dienstag J.L.
2001. Nomenclaturefor antiviral human hepatitis B virus mutasions in the
polymerase region. Hepatology, 33:751-757.
Suyono., Sofiana., Heru., Novianto., Riza., Musrifah. 2006. Sonografi sirosis hepatis
di RSUD Dr. Moewardi.
Bagian Radiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Sebelas Maret/ Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi Surakarta. Cermin
Dunia Kedokteran, 150:23-27.
Tse-Ling F. 2006. Hepatitis B virus. http://www.medicinenet.com/hepatitis_b/
article.htm., 8 November 2006.
Yokosuka O., Tagawa M., Omata M. 1993. PCR detection of hepatitis B virus. In:
Persing D.H., Smith T.F., Temovef., White T.J. Diagnostic Molecular
Microbiology principles and applications. Washington. D.C: American Society
