FIBROSIS GINJAL DI MENCIT (
Mus musculus
)DENGAN
METODE
UNILATERAL URETERAL OBSTRUCTION
(
UUO
)
SKRIPSI
Untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat
Sarjana Kedokteran Universitas Gadjah Mada
Disusun Oleh:
VITO CAMBODIAWAN
11/312650/KU/14386
Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada
Yogyakarta
ii
KORELASI ANTARA EKSPRESI
ENDOTHELIAL NITRIC
OXIDE SYNTHASE
(
eNOS
) TERHADAP FIBROSIS
PERIVASKULER DAN INTERSTISIAL PADA MODEL
FIBROSIS GINJAL DI MENCIT (
Mus musculus
)DENGAN
METODE
UNILATERAL URETERAL OBSTRUCTION
(
UUO
)
SKRIPSI
Untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat
Sarjana Kedokteran Universitas Gadjah Mada
Disusun Oleh:
VITO CAMBODIAWAN
11/312650/KU/14386
Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada
Yogyakarta
iii
HALAMAN PENGESAHAN
SKRIPSI
KORELASI ANTARA EKSPRESI
ENDOTHELIAL NITRIC
OXIDE SYNTHASE
(
eNOS
) TERHADAP FIBROSIS
PERIVASKULER DAN INTERSTISIAL PADA MODEL
FIBROSIS GINJAL DI MENCIT (
Mus musculus
)DENGAN
METODE
UNILATERAL URETERAL OBSTRUCTION
(
UUO
)
Diajukan oleh:
VITO CAMBODIAWAN
11/312650/KU/14386
Telah disetujui untuk diuji pada tanggal
7 November 2014
Pembimbing Materi, Pembimbing Metodologi,
dr. Nur Arfian, Ph. D dr. Santosa Budiharjo, M. Kes, PA(K)
NIP: 1120110064 NIP: 19630309 19803 1 002
Dosen Penguji,
dr. Dyah Samti Mayasari, Ph. D
iv
HALAMAN PERNYATAAN
SKRIPSI
KORELASI ANTARA EKSPRESI
eNDOTHELIAL NITRIC
OXIDE SYNTHASE
(
ENOS
) TERHADAP FIBROSIS
PERIVASKULER DAN INTERSTISIAL PADA MODEL
FIBROSIS GINJAL DI MENCIT (
Mus musculus
)DENGAN
METODE
UNILATERAL URETERAL OBSTRUCTION
(
UUO
)
Oleh:
VITO CAMBODIAWAN
11/312650/KU/14386
Adalah karya tulis hasil pekerjaan saya dan bukan
merupakan jiplakan dari karya orang lain. Segala muatan
yang bersumber dari penelitian lain yang saya gunakan
sebagai acuan sepanjang pengetahuan saya telah ditulis
sesuai tata cara dan etika penulisan karya tulis ilmiah.
Apabila di kemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya
ini tidak benar, maka hal ini menjadi tanggung jawab
saya sebagai penulis.
Yogyakarta, 15 Oktober 2014
Penulis
VITO CAMBODIAWAN
v
Kata Pengantar
Alhamdulillahirabbil’alamin. Segala bentuk puji dan
syukur penulis curahkan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala
karena berkat rahmat dan ridha-Nya, penulis dapat
menyelesaikan tugas akhir ini yang berjudul “Korelasi
Ekspresi eNOS terhadap Fibrosis Perivaskular dan
Interstisial pada Model Gagal Ginjal di Mencit (Mus
musculus) dengan Metode Unilateral Ureteral Obstruction
(UUO)” dengan paripurna tanpa adanya kendala yang
berarti.
Dalam proses penelitian hingga penyusunan tugas
akhir ini, penulis merasa banyak sekali mendapatkan
bantuan yang berharga dari berbagai pihak sehingga
proses keseluruhan dapat berlangsung lancar tanpa adanya
kendala yang bermakna. Pada kesempatan ini, penulis
ingin mengucapkan terima kasih dan memberikan
penghargaan yang setinggi-tingginya kepada:
1.dr. Nur Arfian, Ph. D selaku dosen pembimbing utama
yang telah memberikan pembinaan dengan sabar dan
ilmu-ilmu yang bermanfaat, semenjak awal penelitian
hingga titik akhir penulisan tugas akhir ini.
2.dr. Santosa Budiharjo, M. Kes, PA(K) selaku dosen
membimbing penulis dalam masalah metodologi
penelitian dan memberikan masukan yang begitu
berharga terkait sistematika penulisan maupun
penelitian yang dilakukan.
3.dr. Dyah Samti Mayasari, Ph. D selaku dosen penguji
yang telah memberikan masukan yang begitu berharga
dan membuat penulis berpikir lebih kritis tentang
permasalahan yang dihadapi pada penelitian yang
dilakukan.
4.Ayah dan Ibu, Juwondo dan Emy Kipwati, kedua orang
tua penulis yang selalu memberikan dukungan dan
bimbingan
5.Teman-teman kelompok tugas akhir: Muhammad Gractya
Nurfiantoro, Fahmi Zahwan Khinana, dan Rofiuddin
Ali yang telah menjadi sahabat-sahabat yang luar
biasa dan telah memberikan dukungan serta kerja
sama yang hebat sehingga tugas akhir ini dapat
diselesaikan denga paripurna.
6.Bapak Mulyono dari bagian Anatomi, Embriologi, dan
Antropologi FK UGM yang telah membantu penulis dan
tim peneliti dalam hal teknis-teknis penelitian
sehingga penelitian dapat dilaksanakan dengan
7.Ucapan terima kasih secara khusus penulis
sampaikan kepada teman-teman tutorial tahun
pertama: Nurkholis Bramantyo, Syahru Agung
Setiawan, Felix Gunawan, Githa Rizky, Dwi Astuti
Dharma Putri, Agatha Tyas, Amanda Puteri, Stacy
Gabriella, dan Habella Carissa; teman-teman
tutorial tahun kedua: Muhammad Gractya
Nurfiantoro, Fahmi Zahwan Khinana, Wegig Setiaji,
Rachmanita Yudelia Sjarif, Diah Dinar Utari,
Annisa Rahmawati, Dinisa Diah Winari, Kirantri
Larasati, dan Avie Avievah; teman-teman tutorial
tahun ketiga: Zulfikar Ihyauddin, Adi Ariffianto,
Muhammad Abror Rizani, Christiana Dita Natalia,
Nadhira Nur Ratri, Elvi Aprillia Karamoy, David
Tirawati Fadhillah, Nisryna, dan Anggraeni Ayu
Rengganis yang telah banyak membentuk penulis
selama proses studi dan telah menjadi
sahabat-sahabat yang istimewa di hati penulis.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada
seluruh pihak yang telah memberikan kontribusi kepada
penulis baik pada tahap penelitian maupun penyusunan
persatu. Biarlah Allah SWT yang memberikan balasan atas
kebaikan kepada seluruh pihak yang terkait.
ix
DAFTAR ISI
Halaman Judul ... ii
Halaman Pengesahan ... iii
Halaman Pernyataan ... iv
Kata Pengantar ... v
Daftar Isi ... ix
Daftar Gambar ... xii
Daftar Tabel ... xii
Daftar Lampiran ... xiv
Intisari ... xv
Abstract ... xvi
BAB I PENDAHULUAN I.1. Latar Belakang ... 1
I.2. Rumusan Masalah ... 3
I.3. Tujuan Penelitian ... 3
I.4. Keaslian Penelitian ... 4
I.5 Manfaat Penelitian ... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA II.1. Tinjauan Pustaka ... 6
II.1.1. Teori Dasar Ginjal ... 6
II.1.1.2. Fisiologi Ginjal ... 13
II.1.2. Pathogenesis Gagal Ginjal ... 14
II.1.3. Sistem Nitric Oxide Synthase ... 25
II.1.3.1. Nitric Oxide Synthase ... 25
II.1.3.2. Endothelial Nitric Oxide Synthase ... 26
II.2. Kerangka Teori ... 30
II.3. Kerangka Konsep ... 31
II.3. Hipothesis ... 31
BAB III METODE PENELITIAN III.1. Rancangan Penelitian ... 32
III.2. Materi Penelitian ... 32
III.2.1. Subyek Penelitian ... 32
III.2.2 Jumlah Sampel Minimal ... 32
III.2.3 Alat dan Bahan ... 33
III.3. Metode Penelitian ... 35
III.4. Variabel Penelitian ... 39
III.4.1. Variabel Bebas ... 39
III.4.2. Variabel Terikat ... 39
III.5. Metode Analisis Statistik ... 39
III.6. Jadwal Penelitian ... 40
Bab IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN IV.1. Hasil penelitian ... 42
IV.1.1. Pengukuran Fraksi/Rasio Area Fibrosis Interstisial dan Perivaskular ... 44
IV.1.2. Pengukuran Ekspresi eNOS ... 45
IV.2. Analisis Statistik ... 47
IV.2.1.1. Uji Persebaran Data pada Kelompok
Fibrosis Perivaskuler ... 49
IV.2.1.2. Uji Persebaran Data pada Kelompok Fibrosis Interstisial ... 50
IV.2.1.3. Uji Persebaran Data pada Kelompok Ekspresi eNOS/GAPDH ... 50
IV.2.2. Uji Komparasi Nilai Rerata ... 51
IV.2.2.1. Uji Komparasi Rasio Fibrosis Perivaskuler di kelompok SO, U7 dan U14 ... 51
IV.2.2.2. Uji Komparasi Fraksi Area Fibrosis Interstisial di Kelompok SO, U7, dan U14 ... 51
IV.2.2.3. Uji Komparasi Ekspresi eNOS/GAPDH di Kelompok SO dan U14 ... 51
IV.2.3. Uji Korelasi ... 52
IV.2.3.1. Uji Korelasi Fibrosis Perivaskuler terhadap Ekspresi eNOS/GAPDH ... 52
IV.2.3.2. Uji Korelasi Fibrosis Interstisial terhadap Ekspresi eNOS/GAPDH ... 52
IV.2.3.3. Uji Korelasi Fibrosis Interstisial terhadap Fibrosis Perivaskuler ... 53
IV.3. Diskusi ... 54
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN V.1. Kesimpulan ... 62
V.2. Saran ... 62
Daftar Pustaka ... 63
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Vaskularisasi dan Letak Anatomis Ginjal .. 7
Gambar 2.2 Segmen Ginjal ... 8
Gambar 2.3 Vaskularisasi Intra Parenkimal ... 9
Gambar 2.4 Sistem Pelvicocalices ... 11
Gambar 2.5 Nefron ... 12
Gambar 2.6 Proses Pembentukan Urin di Ginjal ... 14
Gambar 2.7 Proses Biomolekuler Fibrosis Ginjal ... 19
Gambar 2.8 Skema Efek Peningkatan Kadar Angiotensin II terhadap Akumulasi Komponen Matriks Ekstraseluler ... 20
Gambar 2.9 Pembentukan Myofibroblast ... 22
Gambar 2.10 Transisi Mesenkimal dari Sel Asalnya ... 23
Gambar 2.11 Pembentukan Myofibroblast dari Perisit . 24 Gambar 4.1 Hasil Pengecatan Sirius Red pada Jaringan Ginjal ... 43
Gambar 4.2 Proses Pengolahan Gambar pada Pengukuran Fraksi Area Fibrosis Interstisial ... 44
Gambar 4.3 Proses Pengolahan Gambar pada Pengukuran Rasio Fibrosis Perivaskuler ... 45
Gambar 4.4 Ekspresi eNOS dan GAPDH ... 46
Gambar 4.5 Grafik Perbandingan Ekspresi eNOS/GAPDH antara Kelompok SO dengan UUO 14 Hari ... 46
Gambar 4.6 Grafik Perbandingan Mean Rasio Fibrosis Perivaskuler ... 48
Gambar 4.7 Grafik Perbandingan Fraksi Area Fibrosis Interstisial ... 48
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel 3.1 Jadwal Penelitian ... 40
Tabel 4.1 Mean dan SE dari Fraksi Area Fibrosis Interstisial, Rasio Fibrosis Perivaskuler dan Rasio Ekspresi eNOS/GAPDH ... 47
Tabel 4.2 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji
Persebaran Data Kelompok Fibrosis
Perivaskuler ... 49
Tabel 4.3 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji
Persebaran Data Kelompok Fibrosis
Interstisial ... 50
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Protokol RT-PCR ... 66
Lampiran 2 Protokol Elektroforesis ... 67
Lampiran 3 Protokol Perhitungan Fraksi Area
Fibrosis Interstisial ... 69
Lampiran 4 Protokol Perhitungan Rasio Fibrosis Perivaskuler ... 70
Lampiran 5 Protokol Pewarnaan Sirius Red ... 71
Lampiran 6 Hasil Analisis Statistik dengan Stata tentang Uji Persebaran Data, Uji Korelasi dan Uji Komparasi Nilai Rerata ... 72
xv
INTISARI
Korelasi Antara Ekspresi Endothelial Nitric Oxide Synthase
(eNOS) terhadap Fibrosis Perivaskuler dan Interstisial pada Model Gagal Ginjal di Mencit (Mus musculus)dengan Metode
Unilateral Ureter Obstruction (UUO)
Vito Cambodiawan1, Nur Arfian2, Santosa Budiharjo2 Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,
Indonesia
1Mahasiswa Strata 1 Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
2Dosen Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
Latar Belakang: insidensi gagal ginjal meningkat seiring waktu, menurut beberapa studi epidemiologi terakhir. Fibrosis ginjal merupakan kondisi akhir dari penyakit ginjal kronis. Kondisi ini memiliki karakteristik adanya aktivasi myofibroblast yang mengakibatkan fibrosis interstisial dan perivaskular. Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) merupakan suatu enzim dengan efek utama sebagai vasodilator yang mempunyai fungsi proteksi pada penyakit ginjal kronis. Tujuan: penelitian ini bertujuan memeriksa pola ekspresi eNOS pada model fibrosis dan mencari korelasi antara ekspresinya dengan proses fibrosis ginjal
Metode: kami membuat model fibrosis ginjal pada mencit dengan latar belakang Swiss (3 bulan, 30-50 gr, n=16) menggunakan metode Unilateral Ureteral Obstruction (UUO). UUO dilakukan dengan meligasi ureter kiri melalui prosedur operasi baku dan mencit diterminasi pada hari ke-7 dan ke-14 paska ligasi. Kelompok Sham Operation (SO) berfungsi sebagai kontrol (operasi tanpa ligasi). Kami memeriksa ekspresi eNOS menggunakan cDNA dengan RT-PCR
Hasil: UUO menginduksi fibrosis interstisial dan perivaskular pada hari ke-7 dan ke-14 secara signifikan (p<0,05 vs SO). Hal ini diikuti dengan penurunan ekspresi eNOS (p<0,05 vs SO) pada hari ke-14. Terdapat korelasi negatif antara ekspresi eNOS dan fibrosis interstisial (p<0,05). Fibrosis interstisial berkorelasi positif terhadap fibrosis perivaskular (p<0,05)
Kesimpulan: peningkatan fibrosis interstisial mengakibatkan penurunan ekspresi eNOS. Peningkatan fibrosis perivaskular diikuti dengan peningkatan fibrosis interstisial pada model fibrosis ginjal.
xvi
ABSTRACT
Correlation Between Expression of Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) for perivaskuler and Interstitial Fibrosis in Renal Failure Model in Mice (Mus musculus) the method
Unilateral Ureter Obstruction (UUO)
Vito Cambodiawan1, Nur Arfian2, Santosa Budiharjo2 Faculty of Medicine, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,
Indonesia
1Undergraduate student of Faculty of Medicine Universitas Gadjah Mada
2Lecturer in Faculty of Medicine Universitas Gadjah Mada
Background: The incidence of renal failure increased over time, according to several recent epidemiological studies. Renal fibrosis is the final condition of chronic kidney disease. This condition has a characteristic presence of myofibroblast activation resulting in interstitial and perivascular fibrosis. Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS), an enzyme with the main effects as a vasodilator that has a protective function in chronic kidney disease.
Objective: This study aims to examine the pattern of eNOS expression in fibrosis models and look for correlations between the expression with the process of renal fibrosis Methods: We made a model of renal fibrosis in mice with Swiss background (3 months old, 30-50 grams, n = 16) using the method Unilateral Ureteral Obstruction (UUO). UUO performed by ligating the left ureter through standard operating procedures and mice were terminated on day 7 and 14 post-ligation. Sham group Operation (SO) serves as a control (operation without ligation). We examined the expression of eNOS using cDNA by RT-PCR
Results: UUO induced interstitial and perivascular fibrosis at day 7 and 14 were significant (p <0.05 vs. SO). This was followed by a decrease in eNOS expression (p <0.05 vs. SO) on day 14. There is a negative correlation between the expression of eNOS and interstitial fibrosis (p <0.05). Interstitial fibrosis positively correlated to the perivascular fibrosis (p <0.05)
Conclusions: The increase in interstitial fibrosis resulted in decreased expression of eNOS. Increased perivascular fibrosis followed by an increase in interstitial fibrosis in a model of renal fibrosis.
1
BAB I
PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang
Beberapa studi terakhir menyatakan bahwa insidensi
dari penyakit gagal ginjal kronis meningkat seiring
waktu. Studi terakhir di Amerika dan Spanyol menyebutkan
bahwa insidensi gagal ginjal meningkat sebesar 11% dari
tahun 1992 ke 2001 (Xue, et al., 2006).
Menurut laporan Indonesian Renal Registry, jumlah
kasus gagal ginjal yang diterapi dengan hemodialisis
mencapai 15.353 kasus pada tahun 2011. Persebaran umur
untuk kasus ini cenderung merata di setiap golongan umur,
dengan insidensi tertinggi pada golongan umur 45-54
tahun (27%). Data diagnosa etiologis menyatakan bahwa
insidensi penyakit ginjal obstruktif adalah sebesar 8%
dari keseluruhan diagnosis, urutan pertama ditempati
oleh penyakit ginjal hipertensif dan kedua oleh
nefropati diabetika (PERNEFRI, 2011).
Gagal ginjal kronis disebabkan oleh fibrosis ginjal
yang ditandai dengan glomerulosklerosis dan fibrosis
intertisial (Thomas, et al., 1994). Fibrosis ginjal juga
ditandai dengan pembentukan dan aktivasi kumpulan sel
modulator kunci perkembangan penyakit ginjal, karena
berfungsi untuk memproduksi matriks ekstraseluler pada
fibrosis dan mediator-mediator pro-fibrotik. Sel ini
disebutkan berasal dari sel-sel di area perivaskuler
(Humphreys, et al., 2010).
Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) merupakan
suatu enzim yang menghasilkan nitric oxide (NO) dari
senyawa dasar l-arginine yang merupakan suatu suatu asam
amino. NO bekerja memediasi vasodilasi, inhibisi
aktivasi platelet dan inhibisi adhesi leukosit.
Penurunan eNOS berkaitan dengan iskemia ginjal dan
cidera ginjal akut (Betz, et al., 2013). Pada proses
penuaan, didapatkan penurunan ekspresi eNOS secara umum
yang diikuti oleh penurunan fungsi ginjal (Thomas,
Anderson, Gordon, Oyama, Shankland, & Johnson, 1994).
Dapat disimpulkan bahwa ekspresi eNOS secara umum dapat
digunakan untuk menggambarkan fungsi ginjal.
Mengingat sel-sel myofibroblast berasal dari
sel-sel di area perivaskuler, ada kemungkinan bahwa proses
patologis di area perivaskuler berkorelasi dengan
fibrosis intertisial di parenkim ginjal dan juga dengan
ekspresi eNOS, sebagai suatu penanda biomolekuler pada
I.2. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah di atas, rumusan
masalah pada penelitian ini adalah:
1.Apakah terdapat fibrosis interstisial dan
perivaskular pada model fibrosis yang diinduksi
pada mencit?
2.Bagaimanakah korelasi antara ekspresi eNOS
terhadap fibrosis perivaskular dan interstisial?
3.Bagaimanakah korelasi antara fibrosis perivaskular
terhadap fibrosis interstisial?
I.3. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah:
1.Memeriksa dan mengukur derajat fibrosis
perivaskuler dan intertisial pada model fibrosis
yang diinduksi oleh obstruksi ureter unilateral
pada ginjal mencit.
2.Melakukan analisis korelasi antara ekspresi eNOS
dengan fibrosis interstisial dan fibrosis
perivaskuler.
3.Melakukan analisis korelasi antara proses fibrosis
perivaskuler terhadap proses fibrosis
I.4. Keaslian Penelitian
Penelitian serupa pernah dilakukan di model kelinci
dengan area ligasi di ureter kiri setinggi
ureterovesical junction, hal ini dilakukan untuk
mengetahui peran fibrosis interstisial pada model.
Penelitian tersebut dilakukan karena obstruksi saluran
kemih menjadi penyebab utama end-stage renal disease
pada anak-anak dan apabila terjadi saat kehamilan
mengakibatkan displasia ginjal, namun tidak ada korelasi
antara ekspresi eNOS dan derajat kerusakan ginjal pada
penelitian ini (Sharma, Mauer, Kim, & Michael, 1993).
Pengamatan pathogenesis gagal ginjal pada model
fibrosis telah dilakukan pada penelitian lain, namun
proses yang diteliti berkaitan dengan proses penuaan
(Thomas, Anderson, Gordon, Oyama, Shankland, & Johnson,
1994). Dari penelitian ini didapatkan data bahwa pada
pada model gagal ginjal terjadi kenaikan infiltrasi sel
radang, cidera tubulointertisial, cidera vasa
peritubular, dan penurunan densitas pengecatan
imunologis dari eNOS. Korelasi antara derajat cidera
tubulointertisial dengan eNOS tidak dibahas pada
penelitian ini. Korelasi antara fibrosis perivaskuler
terhadap fibrosis interstisial dan ekspresi eNOS belum
I.5. Manfaat Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan
pemahaman tentang hubungan antara proses fibrosis pada
model gagal ginjal yang diinduksi oleh obstruksi ureter
unilateral dengan ekspresi eNOS. Penelitian ini juga
diharapkan menjadi penelitian pembuka untuk munculnya
suatu penelitian lain yang mengamati pola ekspresi eNOS
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1. Tinjauan Pustaka
II.1.1. Teori Dasar Ginjal
II.1.1.1. Anatomi Ginjal
Ginjal adalah salah satu organ di dalam cavum
abdomen. Pada orang yang masih hidup, ginjal berwarna
merah kecoklatan. Dalam tubuh manusia, ginjal terletak
di belakang peritoneum (oleh karena itu disebut organ
retroperitoneal), di samping columna vertebralis dan
dikelilingi oleh jaringan adiposa. Batas atas ginjal
manusia terletak setinggi vertebra thoracal ke-12,
sedangkan batas bawahnya terletak setinggi vertebra
lumbal ke-3. Ginjal bagian kanan cenderung lebih rendah
akibat posisi hati di atas ginjal kanan. Dalam kondisi
normal, manusia memiliki sepasang ginjal dengan ukuran
panjang sekitar 11 cm, lebar 6 cm, dan dimensi
anteroposterior sepanjang 3 cm (lihat gambar 2.1).
Ginjal pria cenderung lebih berat (±150 gr) jika
Ginjal mendapat vaskularisasi melalui a. renalis yang
bercabang langsung dari aorta tepat di bawah a.
mesenterica superior. A. renalis dextra lebih tinggi dan
panjang dari a. renalis sinistra, berjalan di belakang
dari vena cava inferior, v. renalis dextra, caput
pancreas dan duodenum pars descenden. A. renalis
sinistra berjalan di belakang v. renalis sinistra, caput
pancreas dan v. lienalis. Sebelum memasuki hilum
renalis, a. renalis memberikan beberapa cabang, ke arah
supra-renal (a. suprarenalis inferior), ureter, jaringan
perinefrik, capsula renalis, dan pelvis.
Gambar 2.1 Vaskularisasi dan Letak Anatomis Ginjal
(Moore, Dalley, & Agur, 2010)
Di hilum renalis, masing-masing a. renalis akan
Masing-masing divisi akan bercabang menuju segmen-segmen
ginjal, yaitu: apical, superior, media, inferior dan
posterior (lihat gambar 2.2).
Gambar 2.2 Segmen Ginjal (Moore, Dalley, & Agur,
2010)
Ketika memasuki parenkim ginjal, a. renalis terbagi
menjadi arteri yang lebih kecil lagi, yaitu: a.
segmentalis, lobaris, interlobaris, arcuata,
interlobouralis, arteriola aferen dan eferen glomerulus
hingga mencapai plexus peritubular. Dari plexus ini
muncul v. interlobularis yang berpasangan dengan a.
interlobularis. Vena interlobularis akan berjalan hingga
corticomedullary junction, menerima beberapa vasa rekta
sebelum berakhir menjadi v. arcuata di mana vena ini
akan bermuara ke v. interlobaris yang beranastomosis
Gambar 2.3 Vaskularisasi Intra Parenkimal (Guyton
& Hall, 2010)
Vena renalis berjalan di anterior dari arteri
renalis dan bermuara ke vena cava inferior. Vena renalis
sinistra memiliki panjang 3 kali lebih panjang
dibandingkan vena renalis dextra (masing-masing 7,5 cm
dan 2,5 cm). Vena renalis sinistra berjalan dari hilum
renalis, posterior dari vena lienalis dan corpus
pancreatica lalu berjalan anterior dari aorta tepat di
atas asal arteri mesenterica superior.
Vena gonadalis sinistra dan vena suprarenalis
sinistra akan bermuara ke vena renalis sinistra. Vena
dextra berada di belakang duodenum pars descenden atau
di lateral dari caput pancreas. Panjangnya bisa sangat
pendek (<1 cm).
Secara mikroskopis, struktur fungsional dari ginjal
disebut sebagai nephron (lihat gambar 2.4). Berdasarkan
karakteristik dan letaknya, nephron terdiri dari dua
tipe, yaitu: nephron cortical dan nephron juxtamedullar.
Nephron cortical memiliki loop of Henle yang lebih pendek
dan tebal, sedangkan nephron juxtamedullar memiliki loop
of Henle yang cenderung lebih panjang. Secara umum
nephron terdiri atas corpusculum renalis yang berfungsi
untuk memfiltrasi plasma.
Corpusculum renalis tersusun atas glomerulus dan
capsula Bowman yang merupakan asal dari tubulus renalis.
Dari capsula Bowman, tubulus renalis akan membentuk
tubulus proksimalis, loop of Henle, tubulus distalis dan
ductus colectivus yang akan bermuara ke papilla renalis
melalui duct of Bellini, melubangi permukaannya
membentuk seperti ayakan. Papilla renalis terletak di
calyx minor yang akan bermuara ke calyx mayor lalu ke
pelvis renalis (sering disebut sebagai sistema
pelvicocalices). Dinding pada sistema pelvicocalices
tengahnya yang berfungsi untuk memompa urin ke arah
ureter.
Gambar 2.4 Nefron (Guyton & Hall, 2010)
Ureter adalah tabung muskular yang berfungsi
menghantarkan urin menuju pelvis melalui kontraksi
peristaltik. Panjangnya sekitar 25-30 cm,
berkesinambungan dengan pelvis renalis. Ureter menurun
sedikit ke arah medial, anterior dari muskulus psoas
mayor, membelok lateral lalu ke medial kemudian bermuara
ke vesica urinaria. Diameter ureter sekitar 3 mm dengan
tiga lokasi penyempitan, yaitu di ureteropelvico
junction, saat memasuki pelvis minor dan pada
Gambar 2.5 Sistem Pelvicocalices (Guyton & Hall,
2011)
Di parenkim ginjal, banyak terdapat sel-sel
interstisial yang ikut menyusun parenkim. Sel-sel ini
terutama tersusun atas fibroblast, pericyte, makrofag
serta sel epithelial tubulus kortikal mapun medullar.
Selain itu terdapat sel-sel lain seperti sel
juxtaglomerular dan macula densa yang berperan dalam
menjaga kestabilan volume cairan intravaskuler melalui
sistem renin-angiotensin-aldosteron (Standring, et al.,
II.1.1.2 Fisiologi Ginjal
Ginjal merupakan organ yang unik. Beratnya hanya
1/100 dari berat manusia namun mendapatkan 20% dari curah
jantung total (Hall & Guyton, Guyton and Hall Textbook
of Medical Physiology, 2011). Hal ini dikarenakan fungsi
dari organ ini yang bervariasi dan esensial. Fungsi yang
paling umum diketahui adalah sebagai alat ekskresi
zat-zat hasil metabolisme tubuh. Unit fungsional terkecil
ginjal disusun oleh nefron yang bekerja secara makro
membentuk fungsi-fungsi ginjal yang kita ketahui
sekarang.
Fungsi-fungsi lain meliputi regulasi keseimbangan
air dan elektrolit, regulasi osmolalitas cairan dan
konsentrasi elektrolit, regulasi tekanan arterial,
regulasi keseimbangan asam dan basa, endokrin, dan
glukoneogenesis (Hall & Guyton, Guyton and Hall Textbook
of Medical Physiology, 2011).
Urin di ginjal dibentuk melalui beberapa tahapan.
Tahapan-tahapan tersebut antara lain: filtrasi,
reabsorpsi, sekresi, dan ekskresi (lihat gambar 2.6).
Dalam prosesnya, semua tahapan-tahapan ini sangat
bergantung terhadap substrat yang akan dihantarkan ke
mengalami filtrasi, tetapi belum tentu mengalami
reabsorpsi, sekresi, maupun ekskresi. Hal ini disebabkan
oleh properti fisika dan kimiawi substrat yang sangat
spesifik, sehingga berbeda antara satu substrat dengan
substrat lainnya.
Gambar 2.6 Proses Pembentukan Urin di Ginjal
(Guyton & Hall, 2010)
II.1.2. Pathogenesis Gagal Ginjal
Definisi dari gagal ginjal adalah ketidakmampuan
kondisi konsesntrasi plasma yang normal, atau
ketidakmampuan ginjal untuk mempertahankan kadar
elektrolit dalam darah pada kondisi pasokan elektrolit
yang normal, sehingga terjadi akumulasi produk hasil
metabolisme di dalam darah. Proses ini diikuti dengan
penurunan volume urin yang dihasilkan. Dalam studi ini,
model gagal ginjal pada mencit diinduksi menggunakan
prosedur UUO.
Dalam beberapa studi yang telah dilakukan, prosedur
UUO menginduksi terjadinya fibrosis pada ginjal yang
mengalami prosedur ini. Proses fibrosis interstisial
yang progresif dan diikuti dengan reaksi inflamasi pada
ginjal yang terobstruksi akan berujung pada kerusakan
jaringan parenkim ginjal tersebut (Iwano, Plieth,
Danoff, Xue, Okada, & Neilson, 2002).
Gagal ginjal dan penyakit ginjal kronik lainnya
dikarakteristikkan oleh cidera tubulointerstisial yang
berarti cidera pada parenkim ginjal meliputi area
tubulus dan interstisial. Pada area interstisial dalam
keadaan fisiologi didominasi oleh matriks ekstraseluler
terutama tersusun atas kolagen, khusus di parenkim
ginjal tersusun atas kolagen tipe I dan III yang berperan
Pada cidera tubulointersisial terjadi akumulasi
matriks ekstraseluler yang abnormal di area interstisial
ginjal yang dikenal sebagai fibrosis interstisial
(Farris & Colvin, 2012). Proses ini tentunya akan
menggantikan parenkim ginjal normal menjadi jaringan
fibrosis, sehingga akan terjadi penurunan luas area
parenkim.
Pada area tubulus, akan terjadi atrofi tubulus yang
dikarakteristikkan dengan tubulus-tubulus ginjal yang
mengecil dengan sel-sel epithelial bersitoplasma pucat
atau tubulus-tubulus yang mengalami dilatasi dengan
pemipihan sel epithelial tubulus. Fibrosis interstisial
erat kaitannya dengan atrofi tubulus, namun keduanya
dapat terpisah seperti pada kasus insufisiensi arteri
ginjal di mana terjadi atrofi tubulus yang hebat namun
fibrosis interstisial terjadi minimal (Farris & Colvin,
2012).
Banyak teknik morfometri untuk menilai proses
fibrosis pada ginjal, salah satu metode yang banyak
digunakan adalah computer-assisted morphometry
menggunakan pengecatan Sirius Red yang spesifik untuk
kolagen tipe I dan III. Beberapa metode lain menggunakan
tipe III, namun memiliki kekurangan terutama pada
masalah reproduksibilitas yang rendah karena prosedur
yang cukup rumit (Farris & Colvin, 2012).
Ditinjau dari sisi biomolekuler dan selular, proses
fibrosis renal sangatlah kompleks. Dari sisi molekular,
suatu molekul sinyal yang disebut transforming growth
factor-β (TGF-β1) disebut-sebut sebagai mediator sentral
proses fibrosis renal. Hal ini dikarenakan ekspresi
TGF-β1 selalu meningkat pada kondisi penyakit ginjal kronis
baik pada manusia maupun hewan. Dalam teorinya, senyawa
ini merupakan suatu modulator utama yang paling berperan
yang mengakibatkan berbagai sel di parenkim ginjal (sel
epithel tubulus, fibroblast, dll) mengalami aktivasi dan
mengarah ke suatu kondisi pro-fibrotik (kecenderungan
untuk terjadinya akumulasi matriks ekstraseluler).
Bertindak sebagai mediator, tentunya TGF B1 membutuhkan
suatu jalur sinyal hingga menghasilkan suatu fungsi.
TGF-B1 beraksi melalui jalur Smad, jagged/notch & Crim1
dengan hasil akhir aktivasi fibroblast atau sel epithel
tubulus yang menginisiasi proses fibrosis ginjal (Farris
& Colvin, 2012).
Ada keterlibatan mekanisme imunologis di dalam
berpartisipasti di dalam terjadinya cidera
tubulointerstisial. TLR berperan melalui BAMBI (BMP and
Activin Membrane Bound Inhibitor) yang mengakibatkan
terjadinya fibrosis interstisial. Inhibisi sistem
komplemen juga terbukti memiliki properti anti-fibrotik,
sehingga disinyalir bahwa komplemen juga terlibat dalam
potensiasi proses fibrosis renal dengan mekanisme yang
belum begitu jelas (Farris & Colvin, 2012).
Integrin A VB6 diekspresikan secara berlebih oleh
sel-sel epithelial tubulus yang secara normal hanya pada
kadar yang rendah saat terjadi pertumbuhan atau cidera
pada tubulus. Molekul ini dapat diinduksi oleh TGF B1,
berfungsi untuk meningkatkan proses fibrosis. Terjadi
amplifikasi sinyal molekular pro-fibrotik (Farris &
Colvin, 2012).
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) isomer C
ternyata terbukti berperan pada proses fibrosis
interstisial ini. PDGF-CC terbukti berperan dalam
potensiasi tingkat proliferasi dari fibroblast dan
infiltrasi leukosit (Farris & Colvin, 2012).
Jalur molekular lain yang juga berperan adalah
jalur janus kinase/signal transducer and activator of
perkembangan fibrosis renalis. Fibrinogen, bentuk
polimer dari fibrin juga berperan sebagai mitogen bagi
fibroblast, merangsang fibroblast untuk berproliferasi
sehingga memulai terjadinya proses fibrosis ginjal.
Gambar 2.7 Proses Biomolekuler Fibrosis Ginjal
(Farris & Colvin, 2012)
Dari ginjal sendiri, peningkatan konsentrasi
angiotensin II mampu meningkatkan ekspresi PDGF, kolagen
tipe IV, dan TGF-β1 yang masing-masing berperan sebagai
mediator pro-fibrotik, terutama TGF B1 sebagai mediator
utama pada proses ini. Peningkatan ekspresi TGF-β1
mengakibatkan peningkatan aktivitas deposit kolagen dan
penurunan degradasi dari matriks ekstra seluler baik
memberikan hasil akhir akumulasi dari komponen matriks
ekstraselular di interstisial. Proses ini diterangkan
dalam bagan di bawah (Klahr & Morrissey, 2002).
Gambar 2.8 Skema Efek Peningkatan Kadar Angiotensin II
terhadap Akumulasi Komponen Matriks Ekstraseluler
(Klahr & Morrissey, 2002)
Dari aspek seluler, proses fibrosis renal
melibatkan banyak komponen seluler dari berbagai sistem,
antara lain: sel T helper 2, fibrosit, sel epithel
tubulus, limfosit, monosit, sel denditrik, sel mast, sel
endothelial, sistem kapiler, fibroblast dan
myofibroblast (Farris & Colvin, 2012). Seperti yang
sudah dibahas pada bab sebelumnya, sebagian besar area
interstisial tersusun oleh fibroblast. Sama seperti di
matriks ekstraseluler yang berperan sebagai rangka pada
parenkim organ, dalam konteks ini parenkim ginjal.
Ketika terjadi cidera (baik karena ischemia,
obstruksi aliran urin, dan berbagai etiologi lainnya)
fibroblast akan mengalami transformasi menjadi
myofibroblast setelah berikatan dengan membrana basalis
tubulus yang terluka. Myofibroblast inilah yang secara
aktif menghasilkan matriks ekstraseluler sehingga
terjadi akumulasi matriks ekstraseluler atau dalam kata
lain terjadi fibrosis. Dalam beberapa literatur, sel ini
berperan sebagai modulator kunci perkembangan penyakit
ginjal, karena secara aktif menghasilkan matriks
ekstraseluler dan mediator-mediator pro-fibrotik seperti
yang telah dibahas di atas (Farris & Colvin, 2012).
Dari berbagai studi yang telah dilakukan, terbukti
bahwa myofibroblast berasal dari fibroblast, sel
perivaskuler, sel endothelial dan pericyte. Dalam studi
in vivo, didapatkan fakta bahwa sel endothelial tidak
berkontribusi menghasilkan myofibroblast. Melalui metode
lineage analysis, pericyte juga terbukti menjadi nenek
moyang dari myofibroblast, di mana pada mulanya sel ini
tidak mengekspresikan smooth muscle actin, kemudian
fibrosis terjadi (Farris & Colvin, 2012). Selain itu,
fibroblast perivaskuler juga secara aktif berperan dalam
proses fibrosis renal, karena sel ini akan berubah
menjadi myofibroblast dalam proses ini. Dapat dikatakan
bahwa komponen-komponen di area perivaskuler memiliki
peran yang penting dalam proses fibrosis renal.
Gambar 2.9 Pembentukan Myofibroblast (Grgic, Duffield,
& Humphreys, 2012)
Transisi sel-sel epithelial dan endothelial ke
bentuk sel mesenkimal ini sering disebut sebagai
epithelial mesenchymal transition atau endothelial
Gambar 2.10 Transisi Mesenkimal dari Sel Asalnya
(Farris & Colvin, 2012)
Dalam keadaan normal, pericyte merupakan pelapis
vasa-vasa berukuran mikroskopis yang memiliki hubungan
langsung dengan endothelium. Kontak langsung ini
berperan dalam menjaga integritas struktur
mikrovaskualtur, menjaga tonus vaskular agar tidak
kolaps, menghasilkan matriks, dan berfungsi sebagai sel
progenitor ketika proses regenerasi diperlukan. Pada
cidera kronis, sel ini akan terstimulasi untuk
yang menghasilkan matriks ekstraseluler yang disebut
myofibroblast (Grgic, Duffield, & Humphreys, 2012).
Pericyte ini berasal dari sutu progenitor
mesenkimal yang mengekspresikan FoxD1+, di mana sel-sel
progenitor ini akan berdeferensiasi menjadi fibroblast
perivaskuler dan pericyte (lihat gambar 2.11). Pada
kondisi adanya cidera ginjal, sel-sel ini
mengekspresikan alpha-smooth muscle actin yang merupakan
karakteristik dari myofibroblast. Beberapa jalur sinyal
telah didefinisikan pada proses ini, jalur-jalur
tersebut antara lain: TGF B, CTGF, Hedgehog & PDGF
(Humphreys, 2012).
Gambar 2.11 Pembentukan Myofibroblast dari Perisit
(Humphreys, Targeting pericyte differentiation as a
strategy to modulate kidney fibrosis in diabetic
Dapat disimpulkan bahwa komponen sel-sel
perivaskuler memegang peran kritikal pada proses cidera
tubulointerstisial (Humphreys, Targeting pericyte
differentiation as a strategy to modulate kidney
fibrosis in diabetic nephropathy, 2012).
II.1.3 Sistem Nitric Oxide Synthase
II.1.3.1 Nitric Oxide Synthase
Nitric oxide (NO) merupakan suatu senyawa
vasorelaksan yang terdapat di dalam berbagai organ di
dalam tubuh manusia. NO berperan sebagai biological
messenger dalam aktivitasnya, bisa secara autokrin
maupun parakrin (Akyurek, et al., 1996).
Secara umum, NO berfungsi dalam pengaturan
pertumbuhan vaskular dan tonusnya, memediasi interaksi
antara leukosit dengan sel endothel, dan adhesi platelet
(Akyurek, et al., 1996). Senyawa ini dibentuk dari suatu
enzim yang disebut nitric oxide synthase (NOS).
Ada beberapa isoform dari enzim ini, antara lain
neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS) dan
inducible NOS (iNOS). NOS berperan mengkatalisis
pembentukan nitric oxide (NO) dari l-arginine. Enzim ini
l-arginine dan non l-l-arginine. Jalur non l-l-arginine ini
terutama disuplai dari makanan sehari-hari, karena
memanfaatkan metabolisme nitrogen. Terdapat beberapa
bentuk lain l-arginine yang justru menghambat
pembentukan NO. Asymmetrical d-methyl L-arginine (ADMA)
dan symmetrical d-methylarginine (SDMA) menghambat
produksi NO karena bersifat sebagai inhibitor kompetitif
pada enzim NOS terhadap l-arginine. Peningkatan kedua
senyawa ini ditemukan pada kondisi cidera ginjal akut,
secara spesifik pada kondisi pasca ischemic reperfusion
injury (IRI) (Betz, et al., 2013).
Berbagai macam sel memiliki aktivitas NOS, dalam
artian lain mampu menggunakan l-arginine untuk
menghasilkan NO dengan hasil samping l-citrulline.
Sel-sel ini antara lain adalah makrofag, neutrofil, dan Sel-sel
endothel vasa yang mengalami aktivasi oleh berbagai
mediator immunologis (TNF-α, TGF-β, interferon, IL-1β,
LPS) dan juga sel otot polos vasa yang diaktivasi oleh
berbagai macam sitokin atau c-AMP (Betz, et al., 2013).
II.1.3.2. Endothelial Nitric Oxide Synthase
Dari beberapa penelitian yang telah dilakukan,
sebagian besar mengatakan bahwa eNOS memiliki fungsi
fisiologis, ekspresi eNOS pada ginjal terkonsentrasi di
glomerulus, tubulus distalis, dan tubulus kolektivus
(Sonmez , Narin, Akkus, & Turkmen, 2012). Kondisi awal
obesitas pada tikus mengakibatkan penurunan aktivitas
NO, hal ini memicu terjadinya perkembangan gagal ginjal.
Pemberian L-arginine dan anti-oksidan mecegah perubahan
ini lebih lanjut (Gamez-Mendez, et al., 2014). Pada
penelitian lain, peningkatan aktivitas NOS (eNOS dan
nNOS) di ginjal dan atrium kiri tikus yang diinduksi
dengan berolahraga memberikan efek protektif bagi
jantung dan ginjal pada cardiorenal syndrome (Ito, et
al., 2013).
Disfungsi endothel diasosiasikan dengan peningkatan
resiko morbiditas dan mortalitas dari sistem
kardiovaskular dan ginjal. Hal ini karena terjadi
penurunan aktivitas dari eNOS. Perlu diketahui bahwa
eNOS memiliki peranan yang paling dominan dalam
pembentukan NO pada mikro dan makrovaskulatur (Yuen, et
al., 2012). Penurunan eNOS akan mengakibatkan penurunan
respon endothelium-dependent vasorelaxation terhadap
asetilkolin. Penurunan NO juga mengakibatkan efek
vasokonstriktor yang dimediasi oleh katekolamin,
terjadi peningkatan tahanan vaskular perifer yang
berujung kepada hipertensi dan berbagai penyakit sistem
kardiovaskular. Selain itu, tidak adanya inhibisi faktor
pertumbuhan pada pembuluh darah, yang merupakan fungsi
NO, mengakibatkan terjadinya remodelling vaskular.
(Savard, et al., 2012).
Penyebab penurunan produksi NO secara pasti masih
belum diketahui, namun ada beberapa kondisi terkait yang
mengakibatkan terjadinya penurunan produksi NO. Salah
satu kondisi yang mengakibatkan penurunan produksi NO
adalah kurangnya l-arginine dalam diet sehari-hari,
karena l-arginine adalah substrat dasar dalam
pembentukan NO.
Kondisi lain adalah penurunan kadar
tetrahydrobiopterin (BH4) yang merupakan kofaktor
kritikal bagi eNOS untuk berfungsi. Penurunan kofaktor
ini mengakibatkan enzim eNOS tidak berfungsi secara
optimal sehingga terjadi penurunan produksi NO. Namun,
kadar berlebih dari kofaktor ini juga mengakibatkan
terbentuknya anion superoksida yang justru mengganggu
fungsi NO, sehingga NO tidak dapat bekerja sebagaimana
Pada kondisi gagal ginjal kronis, yang
mengakibatkan penurunan NO adalah akumulasi anion
superoksida yang menonaktifkan NO sehingga terjadi
penurunan NO secara fungsional (Savard, et al., 2012).
Mekanisme lainnya adalah peningkatan senyawa lain yang
menghambat l-arginine untuk diproses oleh NOS. Senyawa
ini merupakan analog l-arginine yang mengalami metilasi,
yaitu asymmetric dimethyl l-arginine (ADMA) (Savard, et
II.3. Kerangka Konsep
II.4. Hipothesis
Berdasarkan tinjauan pustaka, rumusan masalah dan
pertanyaan penelitian, maka kami menyusun hipothesis
penelitian sebagai berikut:
1.Fibrosis perivaskular berkorelasi positif
terhadap fibrosis interstisial (semakin besar
derajat fibrosis perivaskular, semakin besar
pula derajat fibrosis interstisial yang
terjadi).
2.Ekspresi eNOS berkorelasi negatif terhadap
proses fibrosis ginjal (semakin rendah
32
BAB III
METODE PENELITIAN
III.1. Rancangan Penelitian
Desain penelitian ini termasuk ke dalam studi
eksperimental, yaitu quasi-eksperimental pre-klinik yang
melibatkan subyek mencit (Mus musculus) yang diberikan
perlakuan obstruksi ureter unilateral untuk menghasilkan
model gagal ginjal.
III.2. Materi Penelitian
III.2.1. Subyek Penelitian
Subyek penelitian adalah 16 ekor mencit Swiss
background, pejantan, usia 3-4 bulan dengan berat
rata-rata antara 30-50 gr. Subyek akan dibagi menjadi tiga
kelompok perlakuan, yaitu: kelompok obstruksi ureter
unilateral 14 hari (n=5), 7 hari (n=5) dan operasi Sham
(n=5). Disediakan satu ekor mencit sebagai cadangan.
III.2.2. Jumlah Sampel Minimal
Perhitungan jumlah sampel minimal menggunakan
pertidaksamaan Federer, yaitu:
(n-1)(t-1) ≥ 15
(n-1) ≥ 7.5
n ≥ 9 (per kelompok perlakuan)
Dari hasil perhitungan di atas, setidaknya harus
digunakan 16 ekor mencit dalam tiap kelompok perlakuan
(total 48 mencit). Namun, dari komite etik melakukan
pertimbangan tertentu dan memberikan rekomendasi agar
tiap kelompok perlakuan menggunakan 5 sampel (5 ekor
tikus), sehingga total yang digunakan pada penelitian
ini adalah 15 ekor tikus.
III.2.3. Alat dan Bahan
1.Ether
Ether merupakan salah satu anestesi untuk
sacrifice mencit yang diakui. Ether dituangkan ke
kapas hingga basah, lalu kapas diletakkan di atas
sungkup dan tikus dimasukkan ke dalam sungkup
hingga mati.
2.Alkohol
Alkohol 70% digunakan sebagai disinfektan,
baik oleh peneliti dan untuk alat-alat operasi
3.Agen anaesthesia (Somnopenthyl)
Agen yang digunakan adalah somnopenthyl dengan
pengenceran sebesar 10 kali. Dosis yang digunakan
adalah 10 mg/kg berat badan
4.Spuit injeksi tuberculin
Digunakan untuk menginjeksikan Somnopenthyl ke
mencit
5.Perlatan bedah minor
Berisi alat-alat bedah minor yang digunakan
dalam operasi obstruksi ureter unilateral dan
operasi Sham.
6.Benang jahit (silk/cat gut: 3/0)
7.Formalin 4%
Formalin 4% diperoleh dari hasil pengenceran,
digunakan untuk menyimpan preparat sebelum dikirim
ke laboratium patologi anatomi
8.Pewarnaan IHC Nitric Oxide Synthase (eNOS)
III.3. Metode Penelitian
1.Operasi Unilateral Ureteral Obstruction (UUO)dan
Sham pada mencit
Mencit dianestesi dengan phentobarbital
sebelum masuk ke fase operasi. Setelah teranestesi
penuh, regio flank kiri mencit (bagian lateral
punggung) dibuka untuk mengakses ureter kiri
(bagian posterior-inferior dari hilum renalis).
Ureter kiri diligasi di dua tempat, kemudian
dipotong di antaranya. Region flank ditutup dan
mencit ditunggu sampai sadar. Pada grup operasi
Sham (SO; n=5) dilakukan prosedur yang sama persis
dengan UUO hanya ligasi ureter kiri ditiadakan.
Ginjal akan diambil setelah 7 dan 14 hari pada
kelompok UUO. Jadi akan terbentuk 2 kelompok UUO,
yaitu: kelompok UUO 14 hari dan kelompok UUO 7
hari. Kelompok operasi Sham menjalani prosedur
bedah serupa namun tidak dilakukan prosedur
ligasi.
2.Pemeliharaan mencit
Mencit-mencit yang telah dilakukan operasi
diletakkan di dalam kandang dengan spesifikasi
Spesifikasi ini meliputi: volume kandang, isi
kandang dibandingkan dengan volume, tipe lantai
kandang, luas lantai kandang, sarana memberi makan
dan minuman, tipe makan dan minuman, kelembapan
dan suhu udara di kandang. Dilakukan observasi
berkala untuk mengamati apakah ada mencit yang
meninggal atau mengalami infeksi luka operasi
sekaligus memberi makan dan minum mencit.
3.Terminasi hewan coba untuk pengambilan ginjal
(Sacrifice/Terminasi)
Terminasi dilakukan dengan metode ether
chamber. Setelah meninggal, abdomen dibuka,
diteruskan hingga membelah cavum thorax. Dilakukan
irigasi jantung dengan mengalirkan NaCL 0.9%
melalui ventrikel kiri jantung. Tekanan
intra-kardiak dikurangi dengan cara merobek atrium
kanan. Setelah itu, ditunggu hingga ginjal
berwarna pucat. Ginjal diambil dengan cara
memotong di daerah hilum renalis dan melakukan
penyiangan ginjal terhadap lemak peri-renal.
Ginjal dimasukkan ke dalam 2 micro tube dengan dan
tanpa formalin 4% lalu diinkubasi selama 24 jam
4.Preservasi jaringan
Preservasi jaringan dilakukan dengan cara
memasukkan specimen ginjal yang sudah diletakkan
di dalam micro tube ke dalam mesin pendingin -800C
5.Pewarnaan sirius Red
Pewarnaan Sirius Red dilakukan pada preparat
yang telah diolah di laboraturium Patologi Anatomi
FK UGM sesuai dengan protokol yang terdapat pada
lampiran. Pewarnaan ini bertujuan untuk membantu
kuantifikasi histopatologis fibrosis pada
jaringan.
6. Perhitungan/kuantifikasi histopatologis dan
ekspresi eNOS
i. Fraksi area fibrosis intertisial
Fraksi area fibrosis diukur berdasarkan
luas daerah berwarna merah pada pewarnaan Sirius
red (fibrosis positive area) dibandingkan dengan
luas seluruh lapang pandang. Dilakukan 10-12
kali pengamatan pada tiap kelompok sampel dengan
perbesaran total 400x sebagai standar prosedur
kuantifikasi. Perhitungan dilakukan secara
ii. Skor fibrosis perivaskuler
Skor fibrosis perivaskuler dinilai
berdasarkan pewarnaan sirius red pada area
perivaskuler. Dilakukan perbandingan antara
fibrosis pada area perivaskuler dengan luas
lumen dalam pembuluh darah. Dilakukan 10-12 kali
pengamatan pada tiap kelompok sampel dengan
perbesaran total 400x. Perhitungan dilakukan
secara otomatis menggunakan peranti lunak
Imagej.
iii. Ekspresi eNOS
Pengukuran ekspresi eNOS dilakukan
menggunakan prosedur Reverse
Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Ekspresi
GAPDH diperiksa untuk menormalisasi ekspresi
eNOS. Kuantifikasi dilakukan melalui metode
analisis densitometri dengan bantuan peranti
III.4. Variabel Penelitian
III.4.1. Variabel Bebas
Model gagal ginjal mencit yang diinduksi dengan
teknik UUO selama 7 dan 14 hari (U7 dan U14).
III.4.2. Variabel Terikat
1.Rasio fibrosis perivaskuler
2.Fraksi area fibrosis intertisial
3.Ekspresi eNOS/GAPDH
III.5. Metode Analisis Statistik
Analisis statisitik menggunakan Stata v12.0 IC
dengan α=0.05; β=0.02. Langkah-langkah uji statistik
pada penelitian ini adalah sebagai berikut:
1.Melakukan uji persebaran memakai uji numerikal
Saphiro-Wilk
2.Melakukan uji komparasi nilai rerata antar tiap
kelompok perlakuan (SO, U7 & U14) dengan uji
one-way ANOVA, Kruskal-Wallis dan unpaired t-test.
3.Melakukan uji korelasi antara proses fibrosis
interstisial dengan perivaskular dan ekspresi eNOS
dengan kedua proses fibrosis menggunakan uji
atau Spearman (untuk data dengan distribusi
normal).
III.6. Jadwal Penelitian
Tabel 3.1 Jadwal Penelitian dengan Indikator Kerja
42
BAB IV
Hasil dan Pembahasan
IV.1. Hasil Penelitian
Hasil pengecatan preparat ginjal dengan Sirius Red
pada ketiga kelompok perlakuan menunjukkan adanya
perbedaan. Pada kelompok SO, tidak didapatkan adanya
fibrosis yang ditandai dengan munculnya tampakan area
merah yang intens seperti yang tampak pada kelompok U7
dan U14. Struktur parenkim pada kelompok SO terlihat
sesuai dengan struktur fisiologisnya, sedangkan pada
kelompok U7 dan U14 terjadi perubahan pada struktur
tubulus, di mana lumen tubulus mengalami dilatasi
disertai dengan pemipihan dari sel pelapisnya. Terdapat
massa eosinofilik didalam beberapa lumen tubulus pada
kelompok U7 dan U14 yang disebut sebagai cast, suatu
Gambar 4.1 Hasil Pengecatan Sirius Red pada Jaringan Ginjal dari Ketiga Kelompok Perlakuan (A = SO; B = U7;
C = U14). Perhatikan area di lingkaran biru, terjadi proses kemerahan pada parenkim yang menandakan fibrosis. Pada kelompok Sham tidak terjadi proses fibrosis dan arsitektur histologis jaringan masih
normal.
A B
IV.1.1. Pengukuran Fraksi/Rasio Area Fibrosis
Interstisial dan Perivaskuler
Pengukuran fraksi area fibrosis interstisial
masing-masing grup perlakuan dilakukan dengan bantuan
peranti lunak ImageJ, begitu pula dalam perhitungan
fibrosis perivaskuler.
Pada pengukuran fibrosis interstisial, dilakukan
pengukuran fraksi area berwarna hitam dengan warna putih
yang menandakan fraksi antara area fibrosis dengan
seluruh lapang pandang. Parameter hitung yang digunakan
adalah fraksi area.
Gambar 4.2 Proses Pengolahan Gambar pada Pengukuran Fraksi Area Fibrosis Interstisial (A = preparat U14; B = gambar pada program pengolah ImageJ). Area dalam
lingkaran biru dibandingkan dengan seluruh area lapang pandang untuk memperoleh fraksi area fibrosis
interstisial.
Pada pengukuran fibrosis perivaskuler, luas area
fibrosis di area sekitar vasa dibandingkan dengan luas
lumen vasa Pemilihan area fibrosis menggunakan metode
semi-otomatis, sedangkan pemilihan luas lumen vasa
menggunakan free hand selection. Parameter hitung yang
digunakan adalah area.
IV.1.2. Pengukuran Ekspresi eNOS
Analisis ekspresi eNOS menggunakan metode RT PCR.
Setelah itu dilakukan perbandingan intensitas ekspresi
eNOS dengan ekspresi GAPDH sebagai kontrol positif.
Analisis perbedaan intensitas warna dibantu menggunakan
peranti lunak ImageJ.
Gambar 4.3 Proses Pengolahan Gambar pada Pengukuran Rasio Fibrosis Perivaskuler (A = gambar preparat; B =
gambar pada program pengolah ImageJ). Luas area lingkaran biru (luas lumen vasa) dibandingkan dengan
luas area berwarna hitam pada gambar kanan untuk memperoleh rasio fibrosis perivaskular.
Gambar 4.4 Ekspresi eNOS dan GAPDH pada Kelompok UUO 14
Hari
Gambar 4.5 Grafik Perbandingan Ekspresi eNOS/GAPDH
antara Kelompok SO dengan UUO 14 Hari
IV.2. Analisis Statistik
Terdapat perbedaan persentase fraksi area fibrosis
interstisial, rasio fibrosis perivaskular dan ekspresi
eNOS/GAPDH pada ketiga kelompok perlakuan. Proses
fibrosis, fibrosis interstisial maupun perivaskular
terjadi paling dominan di kelompok U14 (memiliki nilai
rata-rata tertinggi). Terjadi penurunan ekspresi eNOS
pada kelompok U14 (0.36) jika dibandingkan dengan
kelompok SO (0.84), seperti yang dapat dilihat pada tabel
dan grafik di bawah.
Gambar 4.6 Grafik Perbandingan Mean Skor Fibrosis Perivaskuler pada Kelompok SO, U7, dan U14. Data dalam
bentuk rasio. ** = p>0.05
Gambar 4.7 Grafik Perbandingan Fraksi Area Fibrosis Interstisial pada Kelompok SO, U7, dan U14. Data dalam
bentuk persentase * = p<0.05
Gambar 4.8 Grafik Perbandingan Ekspresi eNOS/GAPDH pada Kelompok SO dan U14. * = p<0.05
IV.2.1. Uji Persebaran Data
IV.2.1.1. Uji Persebaran Data pada Kelompok Fibrosis
Perivaskuler
Tabel 4.2 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji Persebaran Data Kelompok Fibrosis Perivaskuler
Nilai p untuk data-data pada fibrosis perivaskuler
berada di angka 0.34101, nilai p >0.05 menandakan bahwa
hipotesis null bahwa data berada di distribusi normal
tidak tertolak, sehingga data berada pada distribusi
IV.2.1.2. Uji Persebaran Data pada Kelompok Fibrosis
Interstisial
Tabel 4.3 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji Persebaran Data Kelompok Fibrosis Interstisial
Nilai p untuk data-data pada fibrosis perivaskuler
berada di angkat 0.02188, nilai p<0.05 menandakan bahwa
hipotesis null bahwa data berada di distribusi normal
tertolak, sehingga data berada pada distribusi tidak
normal.
IV.2.1.3. Uji Persebaran Data pada Kelompok Ekspresi
eNOS/GAPDH
Tabel 4.4 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji Persebaran Data Ekspresi eNOS/GAPDH
Dapat disimpulkan bahwa data ekspresi eNOS/GAPDH
berada pada distribusi normal melihat nilai p dari uji
Saphiro-Wilk untuk data ini >0.05.
FA_FI 15 0.85703 2.772 2.016 0.02188 Variable Obs W V z Prob>z Shapiro-Wilk W test for normal data
IV.2.2. Uji Komparasi Nilai Rerata antar Kelompok
Perlakuan (SO, U7 dan U14)
IV.2.2.1 Uji Komparasi Rasio Fibrosis Perivaskuler di
kelompok SO, U7 dan U14
Studi ini menggunakan analisis one-way ANOVA untuk
menguji perbedaan nilai rata-rata rasio fibrosis
perivaskuler yang terdapat pada kelompok SO, U7, dan
U14. Perbedaan ini secara statistik tidak signifikan,
melihat nilai p = 0.1737, dikonfirmasi dengan uji post
hoc (metode Scheffe) dengan hasil yang juga tidak
signifikan (nilai p >0.05 pada ketiga kelompok).
IV.2.2.2. Uji Komparasi Fraksi Area Fibrosis
Interstisial di Kelompok SO, U7 dan U14
Studi ini menggunakan uji Kruskal-Wallis untuk
melakukan pengujian statistik terhadap perbedaan
rata-rata luas fraksi area fibrosis interstisial di kelompok
SO, U7, dan U14. Perbedaan nilai pada ketiga kelompok
ini secara statistik signifikan dengan nilai p = 0.0087.
IV.2.2.3. Uji Komparasi Ekspresi eNOS/GAPDH di kelompok
SO dan U14
Studi ini menggunakan independent sample t-test
rata-rata ekspresi eNOS/GAPD dari kelompok SO dan U14.
Didapatkan nilai rata-rata untuk kelompok SO = 0.8356 ±
0.145 dan untuk kelompok U14 = 0.3596 ± 0.105, hasil
pengujian menunjukkan hasil yang signifikan (nilai p =
0.0016).
IV.2.3. Uji korelasi
IV.2.3.1 Uji Korelasi Fibrosis Perivaskuler terhadap
Ekspresi eNOS/GAPDH
Terdapat korelasi negatif antara ekspresi
eNOS/GAPDH terhadap rasio fibrosis perivaskuler, semakin
tinggi ekspresi eNOS/GAPDH, maka rasio fibrosis
perivaskuler akan semakin menurun (nilai r=-0.4816).
Namun, secara statistik uji ini tidak signifikan karena
nilai p = 0.2270, dilakukan konfirmasi dengan uji regresi
liniar dan didapatkan hasil yang juga tidak signifikan
(nilai p = 0.227).
IV.2.3.2. Uji Korelasi Fibrosis Interstisial terhadap
Ekspresi eNOS/GAPDH
Studi ini menggunakan uji Spearman untuk menguji
korelasi antara fraksi area fibrosis interstisial dari
ketiga kelompok perlakuan (SO, U7 dan U14) dengan
menandakan korelasi negatif yang cukup kuat. Korelasi
ini secara statistik signifikan dengan nilai p = 0.0366.
IV.2.3.3. Uji Korelasi Fibrosis Interstisial terhadap
Fibrosis Perivaskuler
Pada studi ini, korelasi antara fibrosis
interstisial dan perivaskuler dari ketiga kelompok
perlakuan dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan
penggabungan serta pemisahan (hanya kelompok U14)
observasi korteks dan medulla renalis pada fibrosis
interstisial. Uji Spearman dilakukan pada data gabungan
(karena persebaran data tidak normal) dan uji Pearson
dilakukan pada data yang terpisah (karena persebaran
data yang normal).
Dari hasil pengujian data gabungan (korteks +
medulla), korelasi antara fibrosis interstisial dengan
fibrosis perivaskuler memiliki nilai rho = 0.345 yang
menandakan suatu korelasi positif, namun secara
statistik hubungan ini tidak signifikan (nilai p =
0.2143).
Dari hasil pengujian data terpisah (observasi
medulla dan korteks dibedakan) korelasi antara fibrosis
korteks dengan fibrosis perivaskuler adalah positif
(nilai r korteks = 0.4159; nilai r medulla = 0.5453).
Hubungan ini secara statistik signifikan (nilai p
korteks = 0.0386; nilai p medulla = 0.00048).
IV.3. Diskusi
Dari beberapa studi yang ada, didapatkan fakta
bahwa insidensi gagal ginjal meningkat seiring waktu.
Menurut Indonesian Renal Registry, jumlah kasus gagal
ginjal yang memerlukan terapi hemodialisis mencapai
angka 15.353 kasus pada tahun 2011. Data menyebutkan
bahwa tiga penyebab tersering dari gagal ginjal adalah
hipertensi, diabetes mellitus, dan obstruksi saluran
kemih (PERNEFRI, 2011).
Di situasi klinik, cidera ginjal akut, suatu
istilah yang diperkenalkan untuk menggambarkan seluruh
spektrum dari gagal ginjal akut masih ditegakkan dengan
menggunakan kreatinin serum dan produksi urin. Diagnosis
cidera ginjal akut ditegakkan apabila terjadi
peningkatan >0,3 gr/dL dari kreatinin serum pasien atau
peningkatan >50% dari data dasar disertai dengan
oligouria (produksi urin <0,5 mL/kg/jam). Penanda ini
merupakan suatu penanda yang tidak reliabel dan
adalah: kadar kreatinin serum bisa sangat bervariasi,
tergantung dari umur, jenis kelamin, massa otot,
metabolisme otot, medikasi dan status hidrasi;
peningkatan kreatinin serum terjadi apabila sebagian
besar parenkim ginjal sudah rusak; pada kondisi
penurunan laju filtrasi glomerulus, akan terjadi
peningkatan sekresi tubulus dari kreatinin sehingga
berujung pada overestimation fungsi ginjal; pada kondisi
perubaha laju filtrasi glomerulus yang akut, kadar
kreatinin serum gagal untuk menggambarkan fungsi ginjal
secara keseluruhan (Devarajan, Emerging urinary
biomarkers in the diagnosis of acute kidney injury,
2008).
Terapi yang ada pada saat ini masih belum efektif,
dokter hanya dapat melakukan terapi suportif berupa
hemodialisis jika pasien telah mengalami gagal ginjal,
sehingga pasien dengan gagal ginjal memiliki tingkat
morbiditas dan mortalitas yang tinggi, di mana hal ini
dapat diramalkan dari seberapa besar peningkatan
kreatinin serum dari pasien tersebut (Devarajan,
Emerging urinary biomarkers in the diagnosis of acute
Keluaran terapi yang buruk ini diakibatkan karena
intervensi yang dilakukan setelah terjadi kenaikan
kreatinin serum. Terdapat lag antara serum kreatinin dan
gagal ginjal, terutama pada kasus acute renal failure,
dikarenakan kondisi pasien yang tidak stabil (Hewitt,
Dear, & Star, 2004). Hal inilah yang mengakibatkan
keluaran yang buruk dari terapi pasien dengan gagal
ginjal dan juga peningkatan penggunaan fasilitas
hemodialisis dari tahun ke tahun. Diperlukan adanya
suatu penanda biologis baru yang lebih baik untuk
membantu dokter dalam mendiagnosis gagal ginjal.
Dalam kondisi yang ideal, suatu penanda biologis
yang baik adalah: tidak memerlukan prosedur yang invasif
dalam pemakaiannya (dapat diperoleh lewat urin atau
darah), dapat diukur dengan cepat, memiliki sensitivitas
yang tinggi untuk deteksi awal, memiliki spesifisitas
yang tinggi, dapat menjadi petunjuk untuk memulai
terapi, memiliki nilai prognosis yang luas, dan mampu
menjadi alat pemantau proses terapi (Devarajan, 2011).
Salah satu proses patologis yang dominan terjadi
pada gagal ginjal adalah fibrosis interstisial. Pada
beberapa penelitian yang telah dilakukan sebelumnya,
