41
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), karena faktor kondisi lingkungan dapat diseragamkan (homogen), kecuali faktor perlakuan yang diberikan. Berdasarkan teori perancangan himpunan perlakuan bahwa perlakuan yang diperkirakan berpengaruh paling baik selaras dengan hipotesis yang diajukan sebelum penelitian harus diletakkan di antara minimal dua perlakuan lain yang bertaraf lebih rendah dan lebih tinggi, tetapi diperkirakan mempunyai pengaruh kurang baik dibanding perlakuan hipotesis tersebut.67 Oleh sebab itu kosentrasi ekstrak daun meniran pada penelitian ini disusun menjadi 7 taraf, yaitu :
S0 = aquadest steril tanpa ekstrak daun meniran (kontrol) 0% S1 = konsentrasi ekstrak daun meniran 10%
S2 = konsentrasi ekstrak daun meniran 20% S3 = konsentrasi ekstrak daun meniran 30% S4 = konsentrasi ekstrak daun meniran 40% S5 = konsentrasi ekstrak daun meniran 50% S6 = konsentrasi ekstrak daun meniran 60%
67
Sedangkan jumlah ulangan ditentukan berdasarkan rumus federer: (t-1)
(r-1) ≥15, dimana (t) adalah perlakuan dan (r) adalah ulangan.68 Berdasarkan hal
tersebut maka diperoleh jumlah ulangan sebanyak 3 kali, sehingga total unit penelitian ini adalah 7 taraf 3 kali ulangan = 21 unit. Adapun perhitungan ulangan adalah sebagai berikut :
(t – 1) (r –1) ≥ 15 (7 – 1) (r –1) ≥ 15 6r –6 ≥ 15 6r ≥ 15 + 6 r ≥ r ≥ 3,5 = 3
B. Populasi dan Sampel
Populasi pada penelitian ini adalah semua Mikroorganisme Staphylococcus aureus yang berasal dari Laboratorium Biologi STAIN (Sekolah Tinggi Agama Islam Negeri) Palangkaraya, sedangkan sampel penelitian adalah sebagian dari mikroorganisme Staphylococcus aureus yang ditumbuhkan pada 25 medium lempeng NA di Laboratorium Mikrobiologi STAIN Palangka Raya, dan untuk populasi daun meniran adalah semua tumbuhan meniran yang ada pada wilayah kota Palangka
68
Raya, dan sampel penelitian adalah sebagian daun meniran yang ada pada wilayah Jalan Pilau Palangka Raya, adapun jumlah daun didapatkan sebanyak 1kg daun meniran.
C. Instrumen Penelitian
Alat dan bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Alat-alat yang digunakan adalah :
Tabel 3.1 Alat yang digunakan dalam penelitian
No Alat Jumlah
16 Jarum Inokulasi (berkolong) 4
No Alat Jumlah
40 Cotton Bed Secukupnya
2. Bahan-bahan yang digunakan adalah :
Tabel 3.2 Bahan yang digunakan dalam penelitian
No Bahan Jumlah
10 Vaselin Secukupnya
11 Kultur murni Staphylococcus aureus 1 tabung
D. Teknik Pengumpulan Data
Pengambilan data dari hasil penelitian dilakukan pada saat biakan Staphylococcus aureus yang masing-masing berjumlah 21 unit yang berumur 1x24 jam, 2x24 jam, 3x24 jam, dan 4x24 jam setelah pemberian perlakuan.
Data diambil dari semua unit penelitian, yaitu berupa hasil pengukuran lebar zona hambat (dengan satuan milimeter), yang dimaksud dengan zona hambat disini adalah jarak antara sisi terluar paper disc yang mengandung ekstrak daun Meniran dengan koloni biakan Staphylococcus aureus dipermukaan medium lempeng NA. Dalam hal ini yang diukur adalah jarak koloni biakan Staphylococcus aureus yang terdekat dengan paper disc.
E. Analisis Data
Teknik analisis data yang digunakan untuk menguji hipotesis adalah analisis varians (ANAVA). Langkah-langkah pengujian hipotesis menggunakan analisis varians, seperti bawah ini:
1. Membuat data hasil pengamatan
Tabel 3.3 Contoh tabel data hasil pengamatan
No Perlakuan Ulangan Total Rata-rata
1 2 3
2. Membuat data hasil penelitian pada Uji ANAVA
Tabel 3.4 Contoh tabel ringkasan Analisis Variansi
Sumber Keragaman Db JK KT FHitung
FTabel 5% Perlakuan
Galat Total
Keterangan :
= Berbeda Nyata Tn = Tidak Berbeda Nyata
3. Pengujian Hipotesis
Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini disusun dalam bentuk hipotesis statistik, yaitu :
H0 = Perlakuan pemberian kosentrasi ekstrak daun meniran tidak mempunyai pengaruh yang nyata terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus.
H1 = Perlakuan pemberian kosentrasi ekstrak daun meniran mempunyai pengaruh yang nyata terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus.
Hipotesis statistik ini diuji dengan cara membandingkan harga FHitung dengan FTabel. Adapun kriteria pengujian hipotesis adalah sebagai berikut: a) Jika harga Fhitung ≤ Ftabel 1 % atau 5 % berarti H0 diterima, sedangkan H1
b) Jika harga Fhitung ≥ Ftabel 1 % atau 5 % berarti H0 ditolak, sedangkan H1 diterima dan dinyatakan bahwa perlakuan yang diberikan berpengaruh nyata atau sangat nyata.69
4. Uji Lanjut
Apabila F Hitung ≥ F tabel 5% maka dapat dinyatakan perlakuan yang diberikan berpengaruh nyata, sehingga dapat dilanjutkan dengan uji Beda Jarak Nyata Duncan (BJND).
F. Diagram Alur Penelitian
Langkah-langkah dalam pengumpulan data yang diawali dengan tahapan pendahuluan, perlakuan, dan pengujian yang dijelaskan dalam alur diagram pada halaman 48:
69
G
Gambar 3.1 Diagram Alur Penelitian
Tahapan
Penelitian
Pemberian ekstrak daun Meniran pada koloni biakan Staphylococcus aureus
Pengamatan ekstrak daun Meniran pada koloni biakan Staphylococcus aureus
1. Tahapan Penelitian
2. Tahapan Perlakuan
3. Pengolahan dan analisis data
Menganalisis data hasil penelitian
a. (ANAVA) Analisis varians
b. (Uji BJND) Beda Jarak Nyata Duncan
Membuat Kesimpulan
Pembuatan ekstrak daun Meniran (Phyllanthus niruri, L.)
Pembuatan kultur murni Staphylococcus aureus
Penyiapan Medium Lempeng NA (Nutrien Agar)
Pembuatan Medium Miring NA (Nutrien Agar)
49 G.Jadwal Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2014 sampai dengan April 2014. Jadwal kegiatan penelitian disusun dalam Tabel 3.5 sebagai berikut :
Tabel 3.5 Jadwal Penelitian
No Kegiatan
Bulan / Tahun
2013 2014
November Desember Maret April Mei Agustus
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
3. Penyusunan laporan
H. Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian ini dilakukan dalam 2 tahapan, meliputi tahapan pendahuluan dan tahapan perlakuan, dengan langkah-langkah sebagai berikut:
1. Tahapan Pendahuluan
a. Pembuatan medium miring dan medium lempeng NA (Nutrien Agar) sebagai bahan kultur stok Bakteri Staphylococcus aureus.
Dalam Pembuatan medium ini, yang digunakan sebagai bahan kultur stok Bakteri Staphylococcus aureus ini berjumlah 5, medium miring sebanyak 3 tabung, sedangkan pada medium lempeng sebanyak 2 cawan. Dalam pembuatan kultur stok ada beberapa hal yang perlu disiapkan yaitu:
1) Menyiapkan alat-alat yang bersih, kering, dan steril, seperti: Tabel 3.6 Tabel Alat pembuatan medium miring dan medium lempeng NA (Nutrien Agar)
No Alat Jumlah
10 Karet Gelang Secukupnya
11 Kertas Sampul Secukupnya
12 Gelas Selai 1
13 Hot Plate 1
14 Neraca Digital 1
2) Menimbang komponen medium dengan menggunakan timbangan neraca digital, adapun untuk volume yang diinginkan yaitu:
a) Beef extract 0,135 gram b) Becto Peptone 0,225 gram c) Agar powder 0,675 gram d) Aquades 45 ml
Perhitungan:
Formula Medium Nutrien Agar (NA)
(catatan: harus memperhitungkan terlebih dahulu dengan seksama medium yang ingin diperlukan berdasakan perbandingan dari formula Medium NA (Nutrien Agar) diatas).70
70
Noor hujjatusnaini, Petunjuk PraktikumMikrobiologi. Palangka Raya: STAIN, 2012, h. 2
Komposisi pembuatan Medium Miring dan lempeng yaitu: Tabel 3.7 Tabel Perhitungan untuk pembuatan medium miring dan medium lempeng NA (Nutrien Agar)
Medium Miring Medium Lempeng
Jumlah Tabung X 5ml (5
(10 ini merupakan lebihan apabila jumlah yang ada masih kurang untuk medium)
Jadi Total Pembuatan Medium NA, berjumlah 1,035gr ditambah Aquadest 45 ml
3) Menimbang bahan seperti beef extract, becto peptone, dan agar powder, pada timbangan Neraca Digital sesuai dengan komposisi yang dibutuhkan serta diperhitungkan.
5) Memasukan larutan sebanyak 5 ml ke dalam 3 tabung reaksi (medium miring) dan 10 ml untuk 2 Cawan (medium lempeng) dengan menggunakan mikropipet, kemudian setelah itu menutup setiap tabung dengan sumbat kapas yang telah dibungkus kain kasa, dan untuk cawan dibungkus kertas kraf dengan mengikatnya menggunakan karet gelang.
6) Mensterilisasikan seluruh tabung reaksi (3 tabung) dan Cawan (2 cawan) yang sudah berisi larutan medium ke dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15 lb (pound) selama 15 menit. 7) Setelah proses sterilisasi selesai, selanjutnya bahan-bahan
dibiarkan selama 1-2 jam.
8) Meletakkan tabung reaksi dalam keadaan miring dengan kemiringan 45o dengan menyandarkannya pada tepian nampan. Sedangkan pada cawan diletakan dengan posisi datar saja dengan keadaan kertas kraf yang telah dibuka, setelah medium jadi kemudian dimasukan ke dalam lemari es, dan cawan sebelumnya telah dibungkus kembali dengan menggunakan kertas kraf dan di ikat menggunakan karet gelang.
b. Pembuatan Kultur murni Staphylococcus aureus
Sebelum pembuatan kultur murni dilakukan, ada beberapa hal yang perlu dipersiapkan yaitu:
1) Dalam pembuatan kultur murni ini pengerjaannya di lakukan didalam LAF di Laboratorium Miikrobiologi. Sebelum menggunakan LAF, ada beberapa hal yang harus dikerjakan yaitu:
a) LAF terlebih dahulu harus disterilkan, dengan menggunakan alkohol 70% pada ruang LAF dengan menyeluruh.
b) Kemudian Menutup pintu LAF, lalu menghidupkan lampu ultraviolet selama 2 jam, setelah dua jam berakhir kemudian menghidupkan blower LAF selama 1 jam, (diupayakan jangan ada dalam ruangan selama menghidupkan Lampu UV dan Blower, untuk menghindari radiasi). Setelah selesai kemudian mematikan blower dan menunggu selama ½ jam.
c) Kemudian setelah blowering selesai, kegiatan selanjutnya masukan seluruh alat dan bahan yang akan digunakan kedalam LAF
d) Setelah semuanya selesai, barulah LAF siap digunakan.71
71
2) Menyiapkan alat-alat yang bersih, kering, dan steril: Seperti, Jarum Inokulasi, sarung tangan, Spritus, korek, dan Gelas Selai.
a) Pembuatan kultur murni Staphylococcus aureus dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut :
1) Menyediakan 3 medum miring dan 2 medium lempeng. 2) Menyiapkan koloni bakteri Staphylococcus aureus yang akan
diremajakan.
3) Menulis nama koloni bakteri pada medium miring dan lempeng yang telah dipersiapkan.
4) Kemudian Secara aseptik menginokulasikan koloni bakteri tersebut ke medium miring dan lempeng, dengan arah zig-zag.
5) Menyimpan koloni bakteri tersebut ke dalam inkubator dengan suhu dan waktu yang telah disesuaikan.72
c. Pembuatan medium NB (Nutrien Broth)
1) Menyiapkan alat-alat yang bersih, kering, dan steril:
Tabel 3.8 Tabel Alat Pembuatan medium NB (Nutrien Broth)
No Alat Jumlah
1 Pengaduk Besi 1
2 Beaker Glass 50 ml 1
3 Gelas Selai 1
4 Tabung Reaksi (Pendek) 4
72
No Alat Jumlah
5 Mikropipet 1
6 Tip Mikropipet 2
7 Magnetik Stirer 1
8 Kapas Secukupnya
9 Kain Kasa Secukupnya
10 Hot Plate 1
11 Neraca Digital 1
12 Inkubator 1
2) Menimbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis atau neraca digital untukvolume yang diinginkan, yaitu :
a) Beef extract 0,09 gr b) Becto Peptone 0,15 gr c) Aquadest 30 ml
3) Melarutkan semua bahan tersebut didalam Beaker Glass 50ml yang telah berisi Aquadest sebanyak 30ml, kemudian mengaduknya secara konstan serta meletakannya diatas hot plate stirrer, Selama 10-15 menit sampai homogen
4) Memasukan larutan sebanyak 5 mlke dalam 4 tabung reaksi (medium NB) dengan menggunakan mikropipet, kemudian setelah itu menutup setiap tabung dengan sumbat kapas yang telah dibungkus kain kasa.
6) Setelah proses sterilisasi selesai, selanjutnya bahan-bahan dibiarkan selama 15 menit terlebih dahulu, agar medium dingin. 7) Kemudian Medium Nutrien Broth dimasukan ke Inkubator
dengan suhu dan waktu yang telah disesuaikan.
8) Menunggu selama 1-2 hari atau 2x24 jam, jika medium tetap bersih dan tidak ditumbuhi jamur atau bakteri, maka medium dapat digunakan.
d. Pembuatan medium Lempeng NA (Nutrien Agar)
Pembuatan Medium lempeng NA (Nutrien Agar) ini digunakan sebagai bahan untuk proses perlakuan bakteri Staphylococcus aureus nantinya. Dalam pembuatan medium, ada beberapa hal yang perlu disiapkan yaitu:
1) Menyiapkan alat-alat yang bersih, kering, dan steril, Seperti: Tabel 3.9 Tabel Alat Pembuatan medium Lempeng NA (Nutrien Agar)
No Alat Jumlah
1 Pengaduk Besi 1
2 Beaker Glass 250 ml 1
3 Cawan Petri 26
4 Mikropipet 1
5 Tip Mikropipet 2
6 Magnetik Stirer 1
7 Karet Gelang Secukupnya
8 Kertas Sampul Secukupnya
9 Gelas Selai 1
10 Hot Plate 1
11 Neraca Digital 1
2) Menimbang komponen medium dengan menggunakan timbangan neraca digital, adapun untuk volume yang diinginkan yaitu:
a) Beef extract 0,81 gram b) Becto Peptone 1,35 gram c) Agar powder 4,05 gram d) Aquadest 270 ml
3) Menimbang bahan seperti beef extract, becto peptone, dan agar powder, pada timbangan Neraca Digital sesuai dengan
komposisi yang dibutuhkan serta diperhitungkan.
4) Melarutkan semua bahan tersebut didalam Beaker Glass 300ml yang telah berisi Aquadest sebanyak 270ml, kemudian mengaduknya secara konstan serta meletakannya diatas hot plate stirrer, Selama 10-15 menit sampai homogen.
5) Memasukan larutan sebanyak 10 ml ke setiap masing-masing Cawan yang berjumlah 26 cawan dengan menggunakan mikropipet, kemudian setelah itu cawan yang telah berisi medium dibungkus dengan kertas kraf dan mengikatnya menggunakan karet gelang.
7) Setelah proses sterilisasi selesai, selanjutnya bahan-bahan dibiarkan selama 1-2 jam, dengan bungkus yang telah dibuka. 8) Setelah medium jadi kemudian dibungkus kembali dengan
kertas kraf dan mengikatnya menggunakan karet gelang, setelah itu dimasukan ke dalam lemari es.
9) Menunggu selama 1-2 hari atau 2 x 24 jam, jika medium tetap bersih dan tidak ditumbuhi jamur atau bakteri, maka medium dapat digunakan.
e. Inokulasi Bakteri dari Kultur Stok ke Medium NB
Dalam proses Inokulasi ini, pengerjaannya di lakukan didalam LAF di Laboratorium Mikrobiologi, dan sebelum menggunakan LAF, ada beberapa hal yang harus dipersiapkan yaitu:
1) LAF terlebih dahulu harus disterilkan, dengan menggunakan alkohol 70% pada ruang LAF dengan menyeluruh.
3) Kemudian setelah blowering selesai, kegiatan selanjutnya masukan seluruh alat dan bahan yang akan digunakan kedalam LAF
4) Setelah semuanya selesai, barulah LAF siap digunakan.73 Dalam Proses Inokulasi dari kultur stok Staphylococcus aureus ke medium NB ada beberapa langkah yaitu sebagai berikut :
1) Menyiapkan alat-alat yang bersih, kering, dan steril: Seperti, Jarum Inokulasi, sarung tangan, Spritus, korek, dan Gelas Selai, dan Biakan Bakteri Staphylococcus aureus dari Kultur Stok
2) Menyediakan Kultur Stok Bakteri Staphylococcus aureus yang ada pada 2 medum miring dan 2 medium lempeng.
3) Menulis nama koloni bakteri pada medium NB yang telah dipersiapkan.
4) Kemudian Secara aseptik menginokulasikan koloni bakteri dari kultur stok tersebut ke Masing-masing medium NB
5) Menyimpan koloni bakteri tersebut ke dalam inkubator dengan suhu dan waktu yang telah disesuaikan74.
f. Pembuatan ekstrak daun Meniran
Sebelum tahapan ini dilakukan, ada beberapa hal yang perlu disiapkan yaitu: Menyiapkan alat-alat yang bersih, kering,
73
Noor Hujjatusnaini, Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Palangka Raya: STAIN, 2012, h. 5 74Fressty Yoesnita Affianti, “
dan sterilSeperti: (Alat) Blender, Timbangan, Baskom, Panci, (Bahan) Alkohol 90% sebanyak 3 liter, Ekstrak (Daun Meniran)
Langkah-langkah kerja dalam menyiapkan ekstrak daun Meniran adalah sebagai berikut:
1) Menyiapkan dan mencuci 1000gr daun meniran yang segar sampai bersih, kemudian di keringkan selama 1 hari.
2) Sebelum proses memblender dilakukan, daun meniran ditimbang terlebih dahulu, sampai didapatkan berat 1000gr / 1kg.
3) Memblender daun Meniran sebanyak 1000 gr dengan menambahkan 3000 ml alkohol 90 %, kemudian didiamkan selama 2 hari (proses Maserasi).
4) Menyaring suspensi tersebut dengan menggunakan kain bersih, kemudian menyaringnya kembali dengan menggunakan kertas saring.
5) Hasil saringan dimasukan pada Beaker Glass 1000ml,
6) Kemudian melakukan proses penguapan ekstrak dengan cara sederhana, yaitu menggunakan Hot Plate dengan suhu yang terkontrol 600C, untuk mengontrol suhu tersebut digunakan alat Termometer. Proses penguapan ini dilakukan selama ± 10 - 12 jam.
2. Tahapan Perlakuan dan pengamatan
Sebelum tahapan ini dilakukan, ada beberapa hal yang perlu disiapkan yaitu: Menyiapkan LAF serta alat-alat yang bersih, kering, dan steril.
Adapun Langkah-langkah kerja dalam menyiapkan ekstrak daun Meniran adalah sebagai berikut :
a) Menyiapkan 10 ml ekstrak daun meniran dengan kosentrasi 60%, yaitu dengan cara mencampurkan 6 ml stok induk ekstrak daun meniran dengan 4 ml akuades steril, yang bagian daun meniran adalah 6 ml dalam 10 ml volume atau 60 %, dimana perhitungan kosentrasi setiap perlakuan digunakan rumus: M1V1 =M2V2.
b) Menyiapkan 10 ml ekstrak daun meniran dengan kosentrasi 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, dan 0 % sebagai kontrol perlakuan.75
c) Pemberian ekstrak daun Meniran pada koloni biakan Staphylococcus aureus
Langkah-langkah kerja dalam memberikan ekstrak daun Meniran pada koloni biakanStaphylococcus aureus adalah sebagai berikut :
a) Menyiapkan 21 cawan medium lempeng NA, dan memberikan kode-kode perlakuan pada setiap cawan.
75
b) Menyiapkan paper disc dengan ukuran diameter 2 cm sebanyak 21 buah, kemudian merendamnya ke dalam 7 beaker glass yang masing-masing beaker gelas berisi 10 ml larutan ekstrak daun meniran dengan kosentrasi yang berbeda, yaitu 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50%, 60%. Dan pada kosentrasi 0 % yang berfungsi sebagai kontrol. Perendaman dilakukan selama 30 menit.
c) Menginokulasikan kultur murni Staphylococcus aureus yang telah berumur 2x24 jam pada masing-masing 21 medium NA, dengan menggunakan Cotton Bad.
d) Meletakkan masing-masing 1 buah paper disc yang telah direndam selama 30 menit tersebut ke bagian tengah-tengah permukaan cawan yang berisi medium NA yang sudah berisi bakteri Staphylococcus aureus secara aseptis sesuai dengan kode perlakuan yang diberikan.
e) Menyimpan semua cawan petri ke dalam inkubator dengan suhu 350c.
f) Melakukan pengambilan data pada saat kultur Staphylococcus aureus berumur 1 x 24 jam, 2 x 24 jam, 3 x 24 jam, dan 4 x 24 jam.76
76Fressty Yoesnita Affianti, “Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Sombung
