DETEKSI MUTASI GEN VOLTAGE GATED SODIUM CHANNELAedes aegypti SEBAGAI PENANDA RESISTENSI INSEKTISIDA SINTETIK PIRETROID
Ahmad Ghiffari1 Humairo Fatimi2
Abstract
Aedes aegypti is the vector of various pathogens, including, yellow fever virus, and dengue virus. More than 100 countries had experienced 500.000 dengue hemorrhagic fever cases (DHF) occur annually throughout the world with an average of 24,000 deaths cases. Until now, drug or vaccine yet to be discovered and vector control is an alternative way to break the chains of disease. The use of insecticides have managed to lower the case but unfortunately there have been some outbreak events, is alleged due to the insectisida resistance.
Insecticides resistance can be detected in two ways, through the detection of changes in detoxification enzymes and of gene mutations in voltage gated sodium channel. Detection of enzymes means that the amount of enzymes that detoxify are found elevate in the biochemical essays. The enzyme elevation will make the amount of insecticide is reduced and not capable of killing capability. Detection using an enzyme shown to be effective way but that there are also resistance that not accompanied with the enzyme elevation, alleging that related with mutation. The second insecticide detection is in gene mutations in voltage gated sodium channel gene (VGSC) which can detect changes in the insecticide target cells.
The first target cell mutation is reported on the Musca domestica flies, where the flies
enzymatic is not elevated but it has been resistant to the insecticide spraying. In Aedes
aegypti, the point mutation genes related to insecticides resistance are found in seven point mutations, one of them will be described in this literature review.
Keyword: Aedes aegypti, insecticide resistance, VGSC mutation detection
THE MUTATION DETECTION OF VOLTAGE GATED SODIUM CHANNEL GENE AS AN INDICATION OF Aedes aegypti RESISTANCE TO SYNTHETIC PYTRETROID
Abstrak
Aedes aegypti merupakan vektor berbagai patogen, diantaranya yellow fever dan
virus dengue fever. Lebih dari 100 negara pernah mengalami kasus dan 500 ribu kasus
demam berdarah dengue (DBD) dengan rata-rata jumlah kematian sebanyak 24.000
kasus. Sampai saat ini obat maupun vaksin belum ditemukan dan pengendalian vektor
merupakan alternatif cara untuk memutus rantai penularan. Penggunaaan insektisida
sintetik piretroid pernah berhasil menurunkan kasustetapi incidence rate beberapa tahun
terakhir sulit diturunkan dan terjadi beberapa kejadian luar biasa, diduga terjadi resistensi. Resistensi bisa dideteksi melalui dua cara yaitu melalui deteksi perubahan enzim detoksifikasi dan deteksi mutasi gen voltage gated sodium channel. Deteksi perubahan enzim yaitu deteksi peningkatan kadar enzim yang mendetoksifikasi insektisida sehingga jumlah insektisida menjadi berkurang dan tidak mampu membunuh. Deteksi menggunakan enzim terbukti efektif namun beberapa tahun terakhir dilaporkan kejadian resistensi yang tidak disertai peningkatan enzim detoksifikasi sehingga diduga telah terjadi resistensi yang berhubungan langsung pada sel target insektisida. Cara deteksi
insektisida dengan deteksi mutasi gen voltage gated sodium channel (VGSC) dapat
menilai langsung perubahan pada sel target tempat kerja insektisida.
1Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya, 2Balai Besar Laboratorium Kesehatan Sumsel
Mutasi sel target pertama diketahui terjadi pada lalat M. domestica, lalat yang secara enzimatik tidak resistensi namun ternyata telah kebal dengan penyemprotan insektisida, Sampai saat ini telah ditemukan 26 titik mutasi yang berhubungan dengan resistensi VGSC oleh insektisida piretroid, namun pada titik yang berbeda pada masing-masing
serangga. Pada Aedes aegypti diketahui mutasi gen terjadi pada tujuh titik mutasi, salah
satunya yang berkaitan dengan timbulnya resistensi terhadap insektisida sintetik piretroid akan djelaskan pada penulisan tinjauan pustaka ini.
Kata Kunci: Aedes aegypti, resistensi insektisida, deteksi mutasi VGSC
TINJAUAN PUSTAKA
Aedes aegypti
Larva Ae.aegypti terdiri atas kepala, toraks dan abdomen. Pada ujung abdomen
terdapat segmen anal dan sifon. Ada 4 tingkat (instar) sesuai dengan pertumbuhan larva tersebut, Instar IV berukuran paling besar 5 mm dengan mempunyai ciri-ciri yaitu: Pelana yang terbuka pada segmen anal; Terdapat sifon pada segmen ke-8. Sifon mempunyai
sepasang ventral tuft dan dilengkapi dengan pectin; Pada segmen ke-8 juga terdapat
comb scale yang berduri lateral sebanyak 8-21. Bentuk individu dari comb scale seperti duri; Pada segmen-segmen abdomen tidak dijumpai adanya rambut-rambut berbentuk kipas (palmate hair).9,10
Larva Ae.aegypti bergerak sangat lincah dan sangat sensitif terhadap rangsang getar
dan cahaya. Bila ada rangsangan, larva segera menyelam selama beberapa detik kemudian muncul kembali ke permukaaan air. Larva mengambil makanannya di dasar
tempat penampungan air sehingga disebut pemakan makanan di dasar (bottom feeder).
Pada saat larva mengambil oksigen dari udara, larva menempatkan sifonnya di atas permukaan air, larva berada di posisi membentuk sudut dengan permukaan air sehingga
abdomennya terlihat menggantung di atas permukaan air.11 Secara bertahap larva
berkembang mulai dari larva instar I, II, III dan IV. Setiap pergantian instar ditandai
dengan pengelupasan kulit yang disebut ekdisis. Dalam keadaan optimal (250C-270C)
perkembangan larva sekitar 6-8 hari. Perkembangan instar I ke instar II berlangsung dalam waktu 2-3 hari, kemudian instar II ke instar III dalam waktu 2 hari, instar III ke instar IV dalam waktu 2 hari dan perubahan dari instar IV menetas menjadi pupa dalm waktu 2 hari.12
Insektisida Sintetik Piretroid
Insektisida berasal dari kata insect, yang berarti serangga sedangkan cide berarti membunuh. Dengan kata lain pengertian insektisida adalah semua bahan atau campuran bahan yang digunakan untuk membunuh, mengendalikan, mencegah, menolak atau
mengurangi serangga.3 Sintetik Piretroid adalah insektisida asal tumbuh-tumbuhan yang
berasal dari bubuk bunga matahari (Chrysanthemum cinerariafollium) yang telah
dimodifikasi pada gugus ester. Sintetik Piretroid mulai diperkenalkan tahun 1980-an dan berkembang pesat di pasaran karena kemampuan akumulasi toksisitas di lingkungan
yang rendah. Diperjualbelikan dalam bentuk konsentrat, wettable powders, granules, dan
penggunaan concentrates for ultra low volume. Banyak digunakan untuk pengendalian
serangga di pertanian, perumahan, perkantoran dan bahkan tempat makan.13
Shampoo), tetramethrin (Petscription Aerosol Flying Insect Spray), resmethrin (Scourge Insecticide), dphenothrin (Seargent’s Flea Shop), tralomethrin (Chemisco Flea Killer), Deltramethrin (Deltox), S-Bioallethrin (Off Mosquito Coil), Permethrin (elimite, ounce Ambush, Dragnet, Raid, Vape, Forcemagic.).Tipe II: Utamanya berefek syaraf pusat dan menghambat neurotransmitter GABA, misalnya: cypermethrin, cyfluthrin, deltamethrin, cypermethrin (raid, Sweep, Amno), Cyfluthrin (Intruder), Fenvalerate (Tricomin), Enfenvalerate (Asana), Lamda Cyhalothrin (Karate, icon 25EC)
Resistensi Sintetik Piretroid
Resistensi Insektisida Piretroid pada Ae. aegypti meluas di seluruh dunia dan terjadi
dengan berbagai macam cara. Bermula di Brazil, Thailand dan di Indonesia. Mekanisme resistensi Sintetik Piretroid ada dua mekanisme utama yaitu terjadinya resistensi insektisida piretroid: peningkatan metabolik detoksifikasi terhadap insektisida (metabolic resistance), dan perubahan sensitifitas pada target site (target resistance).2
Metabolic Resistance adalah resistensi karena penurunan kemampuan detoksifikasi yang sering berhubungan dengan aktifitas enzim monooksigenase yang menghasilkan
resistensi secara spesifik, dan aktivitas enzim glutathione S transferase yang secara tidak
spesifik. Metabolic resistance terjadinya dikarenakan adanya mutasi pada protein-protein
enzim yang menyebabkan metabolisme ekskresi insekta meningkat dan menyebabkan enzim untuk memetabolisir insektisida meningkat. Tiga enzim yang berhubungan dengan
detoksifikasi insektisida antara lain cytochrome P450 monooxygenases (P450s),
glutathione S-transferases (GSTs) dan carboxy/cholinesterases (CCEs). Peningkatan
ekspresi enzim P450s akibatnya adanya mutasi pada gen CYP6M6, CYP6Z6, CYP9J23
dan CYP9J22; enzim glutathione S-transferase pada gen GSTe7 dan enzim carboxy/cholinesterase pada CCEae3A pada mulanya diprediksi sebagai satu-satunya
mutasi yang berhubungan dengan resistensi sintetik piretroid. Berdasarkan hasil
penelitian Brengues et al (2003)15 mendapatkan hasil yang berbeda dimana pada
penggunaan The Aedes detox cip DNA-microarray16 pada Ae. aegypti resisten sintetik piretroid tidak terjadi peningkatan ekspresi gen-gen di atas. Hal ini menunjukkan akan adanya mutasi gen lain yang berhubungan dengan terjadinya resistensi namun tidak berhubungan dengan resistensi, sesuai dengan penelitian terakhir yang menyatakan telah terjadinya resistensi target.
Target Resistance adalah resistensi karena terjadi penurunan sensitifitas pada target
site, dimana terjadi mutasi gen yang menyebabkan penghalangan antara ikatan
insektisida dengan sel target/voltage gated sodium channel (VGSC). Dalam hal ini terjadi
penurunan afinitas VGSC dalam mengikat metabolik insektisida sintetik piretorid.18
Struktur voltage gated sodium channel adalah protein transmembrane yang terdapat pada
sel syaraf dan sel otot dan berperan pada potensial aksi sel. VGSC merupakan bagian
dari protein superfamily. Protein superfamily lainnya adalah voltage gated calcium
channel (Cav) dan voltage gated kalium channel (Kv).19 Subunit penyusun voltage gated sodium channel adalah rantai polipeptida yang teridiri dari lebih 1800 asam amino. VGSC terdiri dari empat domain homologous (I-IV) masing-masing terdiri dari satu sampai enam
Gambar 1. Struktur Voltage Gated Sodium Channel(Shuyi, LQ. 2004)
Prinsip kerja VGSC yaitu meneruskan potensial aksi menjadi signaling pada sel syaraf lainnya. Potensial aksi dimulai pada saat serabut syaraf terstimulasi maka VGSC akan terbuka dan ion natrium yang bermuatan positif bergerak ke dalam sel mengubah potensial istirahat (polarisasi) menjadi potensial aksi (depolarisasi) sehingga terbentuk membrane potential, beberapa milidetik kemudian channel/lubang kembali menutup dan sinyal diteruskan ke sel syaraf selanjutnya. Bila digunakan insektisida piretroid maka yang
seharusnya channel tertutup maka akan tetap terbuka, sehingga sodium tetap banyak
berada di dalam sel sehingga menyebabkan discharge aksi potensial yang terjadi
terus-menerus di dalam syaraf serangga menyebabkan hiperexitability dan kejang pada
serangga.22
Gambar 2. Cara Kerja Sintetik Piretroid pada VGSC(Krischik, V. A, 2004)
Mutasi sel target pertama diketahui terjadi pada lalat M. domestica, lalat yang secara
enzimatik tidak resistensi namun ternyata telah kebal dengan penyemprotan insektisida,
2. Mutasi Ile1011Val dimana susunan ATA pada kodon pengkode isoleusin berubah
menjadi GTA (valin).24
3. Mutasi F1552C dimana susunan TTC pada kodon pengkode fenil alanin berubah
menjadi TGC (cysteine).25,26
4. Mutasi F1534C dimana susunan TTC pada kodon pengkode fenil alanin berubah
menjadi TGC (cysteine).1,26
5. Mutasi Val1023Gly dimana kodon pengkode valine berubah menjadi glycine.27
6. Mutasi Val1016Gly dimana pada kodon pengkode valine berubah menjadi glycine.28,29
7. Mutasi F1023C dimana susunan TTC pada kodon pengkode fenilalanin berubah
menjadi TGC (cysteine).28
Gambar 3. Mutasi Gen Voltage-Gated Sodium Channel Berhubungan Dengan
Knockdown Resistance (Soderlund, D.M., and D.C. Knipple. 2003)
Mutasi Titik Val1016Gly
Val1016Ile dan Val1016Gly terletak pada exon ke-21, domain II segment hidrofobik 6 gen voltage gated sodium channel. Mutasi Val1016Ile adalah perubahan pada kodon pengkode valine menjadi isoleucine, dimana terjadi transisi basa guanin dengan adenin pada susunan GTA menjadi ATA.2,24 Beberapa penelitian di wilayah Amerika Latin dan
Amerika Tengah menunjukkan terjadinya mutasi titik Val1016Ile pada gen voltage gated
sodium channelAedes aegypti. Martins et al (2009)20 dan Lima et al (2011)30 menemukan mutasi titik Val1016Ile pada gen voltage gated sodium channel Aedes aegypti di Brazil. Penelitian lainnya yaitu Saveedra et al24 di Amerika Latin, Marcombe et al31 di Martinique Island, Garcia et al32 di Meksiko dan Harris et al1 di Grand Cayman juga menemukan
bahwa terjadi mutasi titik pada kodon yang sama pada gen VGSC Aedes aegypti yang
berhubungan dengan resistensi sintetik piretroid.
Mutasi Val1016Gly adalah perubahan pada kodon pengkode valine menjadi glycine,
dimana terjadi transisi basa timin dengan guanin pada susunan GTA menjadi GGA.
Berdasarkan hasil penelitian Rajatileka et al33 dan Srisawat et al19, ditemukan mutasi titik Val1016Gly pada gen VGSC Aedes aegypti yang berhubungan dengan resistensi sintetik piretroid di Thailand. Penelitian Kawada et al28 juga menemukan hal yang sama untuk
Gambar 4. Lokasi mutasi kdr pada Aedes aegypti (Kasai, 2011)
Adanya mutasi pada Val1016Ile gen VGSC dengan menggunakan teknik
pemeriksaan PCR akan terlihat dengan adanya gambaran dua pita (band) dengan
panjang 82 bp dan 102 bp untuk resisten heterozigot atau satu pita (band) dengan
panjang 82 bp untuk resisten homozigot. Sementara wild type akan tampak satu pita
dengan panjang 102 bp.
Gambar 5. Hasil PCR Aedes aegypti.24
Sedangkan pada mutasi pada Val1016Ile gen VGSC dengan menggunakan teknik
pemeriksaan PCR akan terlihat dengan adanya gambaran dua pita (band) dengan panjang 80 bp dan 60 bp untuk resisten heterozigot atau satu pita (band) dengan panjang
80 bp untuk resisten homozigot. Sementara wild type akan tampak satu pita dengan
panjang 60 bp.
DAFTAR PUSTAKA
1. Harris, A.F., Rajatileka S, and Ranson H. 2010. Pyrethroid Resistance in Aedes
aegypti from Grand Cayman. Am. J. Trop. Med. Hyg 83(2): 277–284
2. Martins, A.J., de Andrade R.M.M., Linss J.G.B, Peixoto A.A.., and Valle D. 2009. Voltage-Gated Sodium Channel Polymorphism and Metabolic Resistance in
Pyrethroid-Resistant Aedes aegypti from Brazil, Am. J. Trop. Med. Hyg., 81(1): 108–
115
3. Sembiring, Odentara. 2009. Efektifitas beberapa Jenis Insektisida terhadap Nyamuk Aedes aegypti. Tesis Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.
4. Kementerian Kesehatan RI, Dirjen PP & PL. 2010. Peraturan Menteri Kesehatan RI
125 bp
6. Che, M.A, R.P. Penilla, and D.A. Rodriguez. 2009. Insecticide Resistance and Glutathione S-Transferases in Mosquitoes: A review. African Journal of Biotechnology 8 (8): 1386-1397
7. Da Cunha, M.P., J.B.P. Lima, W.G. Brogdon, G.E. Moya, and D. Valle. 2005.
Monitoring of Resistance to The Pyrethroid Cypermethrin in Brazilian Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) Population Collected Between 2001 and 2003. Mem Inst Oswaldo
Cruz 100: 441-444
8. Soderlund, D.M., and D.C. Knipple. 2003. The Molecular Biology of Knockdown
Resistance to Pyrethroid Insecticides. Insect Biochemistry and Molecular Biology
33:563-577
9. CDC. 2011. Egg of the Yellow Fever Mosquito, Aedes aegypti (Linnaeus)
10. CDC. 2011. Pupa of the Yellow Fever Mosquito, Aedes aegypti (Linnaeus)
11. Sungkar, S. 1994. Pengaruh jenis tempat penampungan air terhadap kepadatan dan
perkembangan larva Aedes aegypti. Thesis Program Pascasarjana Universitas
Indonesia
12. Hestiningsih, R. 2003. Materi Kuliah Pengendalian Vektor. Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Diponegoro, Semarang.
13. WHO. 1990. D-Phenothrin. Environmental Health Criteria. Geneva
14. Djojosumarto, P. 2008. Teknik Aplikasi Pestisida Pertanian. Kanisius, Yogyakarta. 15. Brengues, C., Hawkes N.J., Chandre F., McCarroll L., Duchon S., Guillet P., Manguin
S., Morgan J.C., and Hemingway J.. 2003. Pyrethroid and DDT Cross-Resistance in Aedes aegypti is Correlated with Novel Mutations in The Voltage-Gated Sodium Channel Gene. Medical and Veterinary Entomology 17: 87-94
16. Strode, C., Wondji C.S., David J.P., Hawkes N.J., Lumjuan N., Nelson D.R., Drane D.R.., Karunaratne S., Hemingway J., and Black W.C.. 2008. Genomic Analysis of
Detoxification Genes in The Mosquito Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol
38(1):113-123
17. O’Reilly, A.O., B.P.S. Khambay, M.S. Williamson, L.M. Field, B.A. Wallace and T.G.E.
Davies. 2006. Modelling Insecticide Binding Sites in The Voltage-Gated Sodium
Channel. Biochem. J. 396: 255–263
18. Ishaaya, I. 2001. Biochemical Site of Insecticide Action and Resistance. Springer, German.
19. Martins, A.J., R.M.M. de Andrade, J.G.B Linss, A.A. Peixoto., and D. Valle. 2009a. Voltage-Gated Sodium Channel Polymorphism and Metabolic Resistance in
Pyrethroid-Resistant Aedes aegypti from Brazil, Am. J. Trop. Med. Hyg., 81(1): 108–
115
20. Martins, A.J., and D. Valle. 2011. The Pyrethroid Knockdown Resistance. Laboratório
de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, Instituto Oswaldo Cruz
21. Shuyi, LQ. 2004. Tetradoxin : Concepts of Ion Channels and Action Potential. Department of Chemistry Imperial College London
22. Safar, R. 2010. Insektisida dan Resistensi, Buku Parasitologi Kedokteran. Yrama Widya, Bandung.
23. Krischik, V. A., and J. Davidson. 2004. IPM (Integrated Pest Management) of Midwest Landscapes. University of Minnesota, Minnesota Agricultural Experiment Station, St. Paul, MN
24. Saavedra, R.K., M.L. Urdaneta, S. Rajatileka, M. Moulton, A.E. Flores, S.I. Fernandez, J. Bisset, M, Rodriguez, P.J. McCall, M.J. Donnelly, H. Ranson, J. Hemingway, and W.C Black. 2007. A Mutation in The Voltage-Gated Sodium Channel
Gene Associated With Pyrethroid Resistance in Latin American Aedes aegypti. Insect
Mol Biol 16:785-798
25. Yanola, J., P. Somboon, C. Walton, W. Nachaiwieng, and L. Prapanthadara. 2010. A
Novel F1552/C1552 Point Mutation in The Aedes aegypti Voltage-Gated sodium
26. Yanola, J., P. Somboon, C. Walton, W. Nachaiwieng, P. Somwang, and L. Prapanthadara. 2011. High Throughput Assays for Detection of The F1534C Mutation
in The Voltage Gated Sodium Channel Gene in Permethrin Resistant Aedes aegypti
and The Distribution of This Mutation Throughout Thailand. Tropical Medicine and
International Health 16(4):501–509
27. Chang, C., W.K. Shen, T.T. Wang, Y.H. Lin, E.L. Hsu, and S.M. Dai. 2009. A Novel Amino Acidsubstitution in A Voltage-Gated Sodium Channel is Associated with Knock
Down Resistance to Permethrin in Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol,
39:272-278
28. Kawada, H., Y. Higa, and O. Komagata. 2009. Widespread Distribution of A Newly Found Point Mutation in Voltage-Gated Sodium Channel in Pyrethroid Resistant Aedes aegypti Populations in Vietnam. PloS Neglected Tropical Diseases 3, 5271–7 29. Srisawat, R., N. Komalamisra, and Y, Eshita. 2010. Point Mutations in Domain II of
The Voltage-Gated Sodium Channel Gene in Deltamethrin Resistant Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae). Applied Entomology and Zoology 45, 275–282
30. Lima, E.P., Paiva M.H.S., de Araújo A.P., da Silva É.V.G., da Silva U.M., de Oliveira, A.E.G. Santana, C.N.Barbosa, C.C.P. Neto, M.O.F Goulart, C.S. Wilding, Ayres L.N.,
and Santos M.A.V.M.. 2008. Insecticide Resistance in Aedes aegypti Populations
from Ceará, Brazil. Parasites & Vectors 4(5):1-12
31. Marcombe, S., Poupardin R., Darriet F., Reynaud S., Bonnet J., Strode C., Brengues C., Yébakima A., Ranson H., Corbel V.and David J.V.. 2009. Exploring The Molecular Basis of Insecticide Resistance in The dengue Vector Aedes aegypti: A Case Study in Martinique Island (French West Indies). BMC Genomics 10:494
32. Garcia, G.P., A.E. Flores, S.I. Fernandez, R.K. Saavedra, S.G. Reyes, F.S. Lozano, B.J. Guillermo, M.M. Casas, J.M. Ramsey, R.J. Garcia, G.M. Domínguez, H. Ranson, J. Hemingway, L. Eisen, and W.C. Black. 2009. Recent Rapid Rise of a Permethrin
Knock Down Resistance Allele in Aedes aegypti in Mexico. PloS Negl Trop Dis 2009,
3:e531
