commit to user
xliii
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan yaitu pada bulan Januari – Juli 2014, bertempat di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Ekstraksi dan pengujian keberadaan metabolit sekunder dilakukan di laboratorium Kimia Farmasi Akademi Farmasi Nasional Surakarta.
B. Jenis dan Subjek Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental, yaitu uji sitotoksisitas ekstrak etanol daun benalu kersen (D. pentandra L. Miq.) terhadap sel lestari Raji yang merupakan sel model kanker nasofaring, selanjutnya dilakukan uji Doubling Time untuk mengetahui penghambatan ekstrak uji terhadap pertumbuhan sel Raji dalam kelipatan waktu inkubasi (24, 48 dan 72 jam).
C. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Laminar air flow cabinet
(LAFC), timbangan analitik, inkubator CO2, refrigerator, mikroskop cahaya,
mikroskop inverted, mikroplate 96 sumuran, kamera digital, mikropipet, sentrifuge, hemositometer (Neubauer), tissue culture flask 50 ml, vortex, alat gelas, conical tube,
deck glass, tabung Eppendorf, Bunsen Buchner, pipa kapiler, pinset (Crown inox), refluks (Electromantle), pipet tetes, siter glass (kolom kromatografi), penyemprot, blender, rotary evaporator, flakon, inkubator, plat KLT, silika gel, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Reader, oven, blue tip dan yellow tip.
2. Bahan
a. Bahan Utama
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun benalu kersen (D. pentandra L. Miq.) segar yang diambil daun ke-4 sampai ke-10 dari
commit to user
xliv
ujung ranting yang tumbuh di pohon kersen di daerah Kecamatan Jebres, Kotamadya Surakarta. Sedangkan sel uji yang digunakan pada penelitian ini adalah sel Raji yang diperoleh dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT), Universitas Gajah Mada.
b. Bahan untuk Ekstraksi
Bahan pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah etanol 96%. c. Bahan untuk Uji Sitotoksisitas dan Doubling Time
Bahan yang digunakan untuk uji sitotoksisitas adalah ekstrak dari daun benalu (D. pentandra L Miq.), 0,25 % DMSO, kultur sel Raji, media RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640, alkohol 70%, NaOH, Phosphate Buffer Saline (PBS),
Fetal Bovine Serum (FBS) 10%, Penicillin/Streptomycin 2%, fungizon, Natrium bikarbonat, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), HCl 0,01%, MTT {3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide}, dan aquades.
d. Bahan untuk Penentuan Keberadaan Senyawa Senyawa Aktif
Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak dari daun benalu kersen (D. pentandra L Miq.), serbuk magnesium, HCl 2N, air suling, reagen Mayer, FeCl 10%, kloroform, asam sulfat pekat, asam asetat anhidrat. Sedangkan untuk penentuan senyawa kuersetin digunakan bahan yang di antaranya adalah n-butanol, asam asetat, etanol 96%, standar kuersetin, akuabides, dan kertas saring. Alat-alat yang digunakan adalah KLT otomatis, pelat KLT silika GF 254, bilik kromatografi ukuran 20×20 cm, pipa kapiler, lampu UV dengan panjang gelombang 366 nm, botol penyemprot, rotary evaporator, dan peralatan kaca.
D. Cara Kerja
1. Persiapan Sampel
Daun disortir dan dipisahkan antara daun yang kering dengan yang segar, kemudian dicuci dengan air hingga bersih. Daun yang telah dibersihkan dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung dengan cara ditutup dangan kain hitam (Lampiran 3B) yang bertujuan supaya kandungan kimia di dalam daun tidak teroksidasi langsung oleh paparan sinar matahari. Pengeringan dilakukan selama 6 hari, yang kemudian dilanjutkan di dalam inkubator dengan suhu 50oC. Andriyani dkk (2010) menjelaskan bahwa pengeringan bahan uji dapat membuat simplisia tidak
commit to user
xlv
mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lama, kadar air yang berkurang dalam proses pengeringan reaksi enzimatik yang terhenti dapat mencegah penurunan mutu atau perusakan simplisia. Penggunaan inkubator bertujuan untuk mempercepat proses pengeringan tanpa dipengaruhi oleh keadaan cuaca. Sebelum diekstraksi, bahan uji dicuci, dikeringkan di bawah sinar matahari tidak langsung dilanjutkan menggunakan lemari pengering pada suhu antara 40o-60oC, kemudian diserbukkan dengan penggiling serbuk.
Daun benalu (D. pentandra L. Miq.) dilakukan penggilingan hingga halus dan diayak, selanjutnya sampel yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 100 g dan dimaserasi dalam 750 ml etanol 96% selama 5 hari sambil diaduk-aduk. Dilakukan penyaringan dengan kertas saring. Ekstrak yang diperoleh dilakukan pengeringan dengan Rotavapour hingga kental. Hasil ekstrak berwarna kental hitam kehijauan (Lampiran 3F) dicuci dimasukkan ke dalam wadah bermulut lebar tertutup untuk mempermudah pengambilan (Lazuardi, 2007; Katrin dkk., 2005).
Metode maserasi banyak digunakan untuk mengisolasi komponen polar maupun non polar dalam suatu bahan alam karena metode ini pengerjaannya mudah, menghasilkan rendamen yang cukup tinggi, serta kemungkinan rusaknya senyawa kimia yang terkandung di dalam suatu bahan alam dapat dihindari karena tidak disertai pemberian panas (Sundari, 2010).
2. Uji Sitotoksisitas dan Doubling Time Sel Raji (Djajanegara, 2008; Diastuti dkk., 2009)
a. Pembuatan media kultur sel lengkap (MK)
Media kultur sel lengkap dibuat dengan cara mencampurkan 10 ml FBS 10%, 0,5 ml Fungizone 0,5%, dan 2 ml Penstrep 2% kemudian ditambahkan RPMI sampai 100 ml. Selanjutnya media kultur disimpan pada suhu 4°C.
b. Preparasi sel
Sel yang inaktif dalam wadah cryotube diambil dari tangki nitrogen cair dan segera dicairkan pada suhu 37ºC. Cryotube dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium tumbuh RPMI lebih kurang 10 ml. Suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 750 rpm selama 5 menit, kemudian bagian supernatan dibuang. Pellet ditambah 5 ml medium penumbuh RPMI,
commit to user
xlvi
diresuspensi hingga homogen, selanjutnya sel ditumbuhkan dalam beberapa tissue culture flask kecil (3-4 buah). Sel diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu
37ºC. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan lagi hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.
c. Pemanenan sel
Setelah jumlah sel pada tissue culture flask kecil cukup, medium penumbuh dibuang dan sel dicuci koloninya dengan cara ditambah larutan PBS secukupnya dan jika perlu resuspensikan perlahan. Larutan PBS (jika sel dalam tissue culture flask kecil dianggap bersih) dibuang. Selanjutnya sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril dan diambil 10 μl untuk dihitung jumlah selnya menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium kultur sehingga diperoleh konsentrasi sel sebesar yang diperlukan (2 x 104 sel per 100 µl) dan siap untuk penelitian.
Kerapatan sel Raji sebesar 2 x 104 sel per 100 µl didapatkan dengan cara menghitung dengan meggunakan haemocytometer dengan mencampurkan 10 μl suspensi sel pada perbesaran 100 X. Penghitungan sel dilakukan pada 4 bilik hitung yang masing-masing terdiri dari 16 kotak dan diambil rata-ratanya, kemudian dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor koreksi untuk setiap bidang besar (volumenya 10-4ml). Jumlah sel dihitung dengan rumus :
d. Uji Sitotoksisitas dengan MTT Assay
Sel diambil dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Sel yang telah dipanen
kemudian kemudian dihitung jumlahnya dan diencerkan dengan Media Kultur (MK) sesuai kebutuhan dengan mengikuti protokol penghitungan sel (2 x 104 sel per 100 µl). Sel ditransfer ke dalam sumuran 96 well-plates, masing-masing 100 μl, disisakan 3 sumuran kosong (jangan diisi sel). Keadaan sel diamati dengan mikroskop inverted untuk melihat distribusi sel dan dokumentasikan. Sel diinkubasi di dalam inkubator selama 24 jam (agar sel pulih kembali setelah panen). Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Setelah sel normal kembali, segera dibuat seri konsentrasi
commit to user
xlvii
sampel untuk perlakuan (termasuk kontrol sel dan kontrol DMSO). Plate yang telah berisi sel diambil dari inkubator CO2. Seri konsentrasi sampel dimasukkan
ke dalam sumuran (triplo), sebanyak 100 µl ekstrak uji ditambahkan ditambahkan pada well sel uji dan well blanko (MK), kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO2 (lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap
sel, jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24 jam (waktu inkubasi total: 24-48 jam). Menjelang akhir waktu inkubasi, kondisi sel didokumentasikan untuk setiap perlakuan. Reagen MTT sebanyak 0,5 mg dilarutkan dalam 1 ml PBS (untuk 1 buah 96 well plate). Media sel tanpa dibuang kemudian ditambahkan reagen MTT sebanyal 10 μL ke dalam setiap sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel). Sel diinkubasi selama 2-4 jam di dalam inkubator CO2. Kondisi sel diperiksa dengan mikroskop inverted, jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper 100 μL SDS 10% dalam
0,1 N HCl. Plate dibungkus dengan kertas atau alumunium foil dan diinkubasi di tempat gelap pada temperatur kamar selama semalam. ELISA reader dihidupkan kemudian tunggu proses progressing hingga selesai. Pembungkus plate dan tutup plate dibuka kemudian dimasukkan ke dalam ELISA reader. Absorbansi masing-masing sumuran dibaca dengan ELISA reader dengan λ=550-600 nm
dan menekan tombol START. ELISA reader dimatikan setelah proses selesai. Hitung prosentase sel hidup dan analisis harga IC50 dengan Excell (Regresi
linear dari log konsentrasi) atau SPSS (Probit/Logit). Buat grafik log konsentrasi vs prosentase sel hidup dengan chart type scatter dan chart subtype compare pairs of values. Cari persamaan regresi linier dari grafik tersebut dengan menambilkan add trendline-regresi linier. Lihat parameter r pada persamaan regresi linier. Jika r lebih besar dari r tabel maka persamaan regresi linier memenuhi standar untuk mencari IC50. Masukan y = 50% pada persamaan regresi linier dan cari x nya kemudian dihitung antilog dari konsentrasi tersebut sehingga diperoleh IC50 (CCRC, 2012).
e. Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel (Uji Doubling Time)
Uji ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak benalu kersen terhadap proliferasi sel Raji dengan cara kerja yang sama dengan metode MTT, namun terdapat penambahan inkubasi selama 24; 48; 72 jam (Khoiriyah,
commit to user
xlviii
2011), serta jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji proliferasi sel adalah 1,5 x 104 sel/sumuran (1,5 x 104 sel/100μl MK) (CCRC, 2010).
3. Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia bertujuan mengetahui kandungan flavonoid, alkaloid, tanin, saponin dan terpenoid dalam ekstrak benalu kersen, yang mempunyai efek penghambatan terhadap pertumbuhan kanker.
Identifikasi flavonoid dilakukan dengan cara ditambahkan serbuk Mg dan 2 ml HCl 2N pada 2 mL larutan ektrak. Senyawa flavonoid akan menunjukkan warna jingga sampai merah. Identifikasi Alkaloid dilakukan dengan cara 3 ml larutan ekstrak ditambahkan dengan 1 ml HCl 2N dan 6 ml air suling, kemudian dipanaskan selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat diperiksa dengan pereaksi Mayer terbentuk endapan putih. Identifikasi saponin dilakukan dengan ditambahkan aquades. Kemudian dikocok vertikal selama 10 detik. Hasil uji positif jika timbul busa stabil selama beberapa menit (Harborne, 1987 dalam Sukandar dkk., 2008).
Skrining fitokimia tanin dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL larutan ekstrak uji direaksikan dengan FeCl3 10%, adanya tanin ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan. Skrining fitokimia terpenoid dan steroid dilakukan dengan cara bahan uji dilarutkan dengan kloroform, setelah itu ditambahkan dengan asam asetat anhidrat sebanyak 0,5 ml. Selanjutnya ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Adanya triterpenoid ditandai dengan terbentuknya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan, sedangkan adanya steroid ditandai dengan terbentuknya cincin biru kehijauan (Padmasari dkk., 2013).
4. Identifikasi Golongan Senyawa Kuersetin
Identifikasi golongan senyawa kuersetin pada daun benalu (D. pentandra L Miq.) dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT). KLT yang digunakan terbuat dari silika gel dengan ukuran 20 cm x 20 cm GF254 (Merck). Ekstrak kental hasil ekstraksi dilarutkan dengan etanol 96% p.a, kemudian ditotolkan sepanjang plat dengan menggunakan pipet mikro pada jarak 1 cm dari garis bawah dan 1 cm dari garis atas. Selanjutnya dielusi dengan menggunakan eluen yang yang memberikan
commit to user
xlix
hasil pemisahan terbaik pada KLT yaitu n-butanol : asam asetat: air (BAA) dengan perbandingan (4:1:5). Hasil KLT kemudian diangin-anginkan dan diperiksa di bawah sinar UV pada panjang gelombang 366 nm. Pembanding rutin yang dipakai dalam mengisolasi ialah kuersetin, yang merupakan pembanding rutin yang biasanya dipakai untuk mengisolasi senyawa flavonoid (Koirewoa dkk., 2012). Hasil KLT kuersetin memiliki noda warna hijau kekuningan setelah diperiksa di bawah sinar UV pada panjang gelombang 366 nm dengan pereaksi semprot alumunium (III) klorida 5% dalam etanol (Andriani, 2011).
Hasil yang diperoleh dari kromatografi lapis tipis berupa noda atau bercak yang teridentifikasi sebagai harga Rf (Retention factor). Harga Rf dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Rf =
(Indrowati & Soegihardjo, 2005).
E. Analisa Data
1. Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel
Data yang diperoleh dari hasil pembacaan ELISA reader berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversikan dalam % kehidupan sel (viabilitas) dengan rumus:
Keterangan :
A= Absorbansi kontrol sel B= Absorbansi kontrol media
C= Absorbansi kontrol sel + Ekstrak uji D= Absorbansi kontrol media + Ekstrak uji
Viabilitas (kehidupan) sel dihitung untuk masing-masing seri konsentrasi dan kontrol pada tiap-tiap waktu inkubasi. Persen viabilitas sel dinyatakan dengan IC50,
(Ningsih, 2011). Data jumlah sel yang hidup pada jam 24, 48 dan 72 dibuat grafik antara jumlah sel yang hidup dan lama waktu inkubasi (jam). Potensi antiproliferasi bahan uji diketahui dengan analisis statistik untuk mengetahui perbedaan viabilitas
commit to user
l
sel pada tiap-tiap waktu inkubasi akibat perlakuan sampel dengan berbagai seri konsentrasi terhadap kontrol sel. Untuk menguji apakah ada hubungan antara konsentrasi ekstrak etanol daun benalu kersen dengan laju kematian dan laju proliferasi sel Raji, data yang didapat dianalisis secara statistik dengan uji korelasi Spearman menggunakan program SPSS (Stastitical Product and Service Solutions)
versi 17.0 (Hadiyah, 2009). Uji Korelasi Pearson memiliki syarat yang harus dipenuhi, di antaranya adalah distribusi sebaran datanya harus normal (p>0,05), hal ini dapat diketahui dengan menggunakan uji normalitas. Jika distribusi sebaran datanya tidak normal maka uji korelasi bisa menggunakan uji alternatif yaitu Uji Spearman (Dahlan, 2009).
