10
III. MATERI DAN METODE PENELITIAN
A.Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cover glass, object glass, cawan petri, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, Beaker glass, pipet tetes,
pipet ukur, bor gabus ukuran 5 mm, rak tabung reaksi, corong, sprayer alkohol, pembakar spirtus, jarum ose, filler, baki, mikropipet, tip, pH meter, hot plate and stirer, timbangan analitik, mikroskop cahaya, mikroskop stereo,
kompor listrik, desikator, oven, inkubator, autoklaf, microcentrifuge, spectrophotometer, rotary evaporator, dan Laminar Air Flow.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah dua isolat aktinomisetes hasil isolasi dari serasah mangrove Daerah Segara Anakan Cilacap, medium Starch Casein Nitrate Agar (SCN), medium Starch Casein Nitrate (SCN) cair, medium Yeast Extract Malt Extract (YEME) cair, dan Oatmeal cair, medium Tryptone Soy Agar (TSA), medium Protease Agar (PA), medium Starch Agar (SA), medium MM (Medium Mineral) + lemak, medium Urea Agar, medium SIM (Sulfide Indole Motility), medium basal, 1 % galaktosa, 1 % sukrosa, 1 % raffinosa, 1 % mannitol, 1 % arabinosa, 1 % xyiosa, 0,1 % KNO3, 2 M NaOH, 2 M HCl, nistatin, akuades steril, alkohol 70%, alkohol 96%, reagen lugol’s iodine, etil asetat, etanol, larutan A (asam sulfanilat), larutan B (alfanaftilamin), serbuk Zn, kertas Whatman No.1, alumunium foil, spirtus, kapas, tissue, label, wrapper, kutex.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto, dan Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Jenderal Soedirman selama bulan Juli – November 2014.
B. Metode Penelitian
1.Metode Percobaan
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif dengan tahapan peremajaan isolat aktinomisetes hasil isolasi dari serasah mangrove
11
daerah Segara Anakan Cilacap, identifikasi isolat aktinomisetes potensial (karakter makromorfologi, mikromorfologi, dan uji biokimiawi), produksi pigmen aktinomisetes pada tiga medium yang berbeda, ektraksi pigmen ektraseluler dan intraseluler, perbandingan warna dari ekstrak pigmen dengan standar warna universal, dan karakterisasi pigmen aktinomisetes dengan metode UV-VIS.
2. Cara Kerja
2.1. Peremajaan dan Pemilihan Isolat Aktinomisetes
Isolat aktinomisetes yang digunakan dalam penelitian adalah hasil isolasi dari serasah mangrove kawasan Segara Anakan Cilacap. Dua isolat aktinomisetes hasil isolasi diremajakan dengan menggunakan medium SCN dan diinkubasi selama 14 hari pada suhu 30o C. Setelah tumbuh, diamati warna koloni tampak atas dan tampak bawah, serta kemampuannya dalam menghasilkan pigmen warna intraseluler maupun ekstraseluler. Dua isolat aktinomisetes diperbanyak secara strik kontinu pada medium SCN dan diinkubasi selama 8 hari dengan suhu 30o C sebagai kultur induk.
2.2 Identifikasi Isolat Aktinomisetes
2.2.1 Pengamatan Morfologi Koloni
Karakter makromorfologi isolat aktinomisetes diamati menggunakan mikroskop stereo meliputi bentuk koloni, permukaan koloni, ukuran, pigmentasi ke substrat, miselium substrat, miselium aerial, margin dan elevasi. Struktur yang diamati kemudian dibandingkan dengan buku Bergey’s manual of Determinative Bacteriology.
2.2.2 Pengamatan Morfologi hifa dengan Pembuatan Preparat HSC
(Buchanan & Gibbons, 1974)
Disiapkan cawan berisi kapas, object dan cover glass yang sudah disterilisasi, kemudian pada bagian tengah object glass ditetesi dengan medium TSA. Setelah medium padat, isolat aktinomisetes
12
diulas pada medium dengan jarum inokulum lurus kemudian ditutup dengan cover glass. Bagian tepi cover glass diberi kutex. Preparat diinkubasi di dalam cawan petri steril berisi kapas lembab pada suhu 30oC selama 3 hari atau sampai ada pertumbuhan yang maksimal sehingga dapat diamati. Pertumbuhan aktinomisetes diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100x.
2.2.3 Uji Biokimiawi (Sunatmo, 2009)
Uji biokimiawi yang dilakukan meliputi uji enzimatis (uji hidrolisis amilum, uji hidrolisis kasein, uji hidrolisis lemak, dan uji urease), uji penggunaan karbohidrat (galaktosa, raffinosa, sukrosa, mannitol, arabinosa, dan xilosa), uji reduksi nitrat dan uji produksi H2S.
2.2.3.a. Uji Hidrolisis Amilum
Isolat yang diuji diinokulasikan secara strik kontinu ke dalam medium Starch Agar (SA) secara aseptis. Kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30oC. Setelah masa inkubasi, ditetesi reagen
lugol’s iodine. Diamati adanya zona jernih pada medium yang mengindikasikan hasil positif.
2.2.3.b. Uji Hidrolisis Kasein
Isolat yang diuji diinokulasikan secara strik kontinu ke dalam medium Protease Agar (PA) secara aseptis. Kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30oC. Setelah masa inkubasi, diamati adanya zona jernih yang terbentuk pada medium yang mengindikasikan hasil positif.
2.2.3.c. Uji Hidrolisis Lipid
Isolat yang diuji diinokulasikan secara strik kontinu ke dalam medium MM + lemak secara aseptis. Kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30oC. Setelah masa inkubasi, diamati adanya bintik merah di bawah koloni dan perubahan warna medium menjadi kuning yang mengindikasikan hasil positif.
2.2.3.d. Uji Urease
Isolat yang diuji diinokulasikan ke dalam medium Urea Agar secara aseptis. Kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30oC.
13
Setelah masa inkubasi, diamati adanya perubahan warna medium menjadi merah muda pekat yang mengindikasikan hasil positif.
2.2.3.e. Uji Penggunaan Karbohidrat
Isolat yang diuji diinokulasikan pada medium basal dengan penambahan masing-masing 1% galaktosa, 1% sukrosa, 1 % raffinosa, 1 % mannitol, 1 % arabinosa, dan 1 % xilosa. Inkubasi dilakukan selama 7 hari pada suhu 30oC. Setelah masa inkubasi diamati adanya pertumbuhan kultur pada medium.
2.2.3.f. Uji Reduksi Nitrat
Isolat aktinomisetes diinokulasikan pada medium TSB semi solid yang ditambahkan 0,1 % KNO3. Setelah inkubasi selama 7 hari pada suhu 30oC, kultur kaldu nitrat ditambah 5 tetes Larutan A dan 5 tetes Larutan B. Kemudian diamati adanya perubahan warna menjadi merah yang mengindikasikan hasil positif. Kultur yang tidak berubah warna ditambahkan serbuk Zn dan diamati adanya perubahan warna yang terjadi. Perubahan warna kultur menjadi merah mengindikasikan hasil negatif, dan apabila tidak terjadi perubahan warna pada kultur mengindikasikan hasil yang positif.
2.2.3.g. Uji Produksi H2S
Isolat aktinomisetes diinokulasikan dengan stab inoculation pada medium SIM. Inkubasi dilakukan selama 7 hari pada suhu 30oC. Interpretasi positif ditunjukan dengan adanya warna hitam sepanjang arah inokulasi.
2.3. Produksi Pigmen Aktinomisetes pada 3 Medium yang Berbeda
(Palanichamy et al. 2011)
Kultur induk aktinomisetes di potongmenggunakan bor gabus ukuran 5 mm. Produksi pigmen dilakukan dengan cara menginokulasikan masing-masing 5 plug kultur induk ke dalam 100 ml medium cair SCN, YEME, dan Oatmeal. Proses produksi dilakukan dengan fermentasi diam selama 21 hari pada suhu ruang.
Bobot awal dan akhir dari isolat aktinomisetes diukur beratnya. Pengukuran dilakukan dengan menyaring 5 plug kultur induk beserta
14
medium pertumbuhan menggunakan kertas saring Whatman No.1, kemudian dikeringkan menggunakan oven selama 90 menit pada suhu 70oC. Setelah itu, kertas saring distabilkan suhunya dalam desikator dan ditimbang berat keringnya.
2.4. Ekstraksi Pigmen Aktinomisetes
2.4.1. Ekstraksi Pigmen Intraseluler Aktinomisetes Menggunakan Etanol 96% (Velmurugan et al. 2009)
Sebanyak satu gram miselium yang ditambahkan dengan akuades steril disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Miselium yang telah ditambahkan etanol 96%, lalu disokletasi. Setelah itu diuapkan dengan rotary evaporator.
2.4.2 Ekstraksi Pigmen Ekstraseluler Aktinomisetes Menggunakan
Etanol 96% (Palanichamy et al. 2011)
Derajat keasaman kultur cair setelah masa inkubasi diatur hingga 12 menggunakan NaOH 2 M dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit. Supernatan diambil dan pH diatur kembali hingga 2 menggunakan HCl 2 M kemudian endapan yang terbentuk disaring mneggunakan kertas Whatman No.1. Endapan selanjutnya diekstrak menggunakan etanol 96%, kemudian dipanaskan pada suhu 80o C.
2.5. Perbandingan Warna Dari Ekstrak Pigmen dengan Standar Warna
Universal (Ahmad et al. 2012)
Stabilitas ekstrak pigmen diuji pada berbagai kondisi pH, mulai dari pH asam (pH 3), netral (pH 7), dan basa (pH 11). Kemudian warna yang dihasilkan dibandingkan dengan strandar warna universal (Munsell Colour Chart Book).
2.6.Karakterisasi Pigmen Aktinomisetes dengan Ultraviolet-visible
Spectrophotometry (UV-VIS) (Ahmad et al. 2012)
Ekstrak pigmen dianalisis menggunakan UV-VIS untuk mengetahui spektrum penyerapan dari warna yang dihasilkan. Pengukuran dilakukan
15
pada panjang gelombang 350-800 nm. Puncak serapan maksimum masing-masing pigmen dideteksi untuk mengetahui panjang gelombang () maksimum dan perbandingan dengan pigmen lain.
C.Metode Analisis
Hasil yang didapatkan dianalisis menggunakan metode deskriptif dengan cara membandingkan positivitas hasil yang didapatkan dengan hasil dari penelitian-penelitian sebelumnya yang berkaitan. Identifikasi genus aktinomisetes hasil penelitian dibandingkan dengan buku Bergey’s Manual of Determinative of Bacteriology.
16
D.Bagan Alir Penelitian
Pemurnian dan Pemilihan Isolat Aktinomisetes Hasil Isolasi dari
Serasah Mangrove
Produksi Pigmen Aktinomisetes pada Berbagai Medium
Karakterisasi Pigmen Aktinomisetes Menggunakan
UV-VIS dan FT-IR Pengamatan
Makromorfologi
Pengamatan Mikromorfologi
Uji Biokimiawi
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology
Genus Aktinomisetes
Dua Isolat Aktinomisetes Terpilih
Identifikasi Aktinomisetes
Ekstraksi Pigmen Ekstraseluler Aktinomisetes dengan
Etil asetat Ekstraksi Pigmen
Intraseluler Aktinomisetes dengan
Etanol
Perbandingan Warna Dari Ekstrak Pigmen dengan Standar
Warna Universal
Warna dari ekstrak pigmen, panjang gelombang maksimum
pigmen aktinomisetes.
