Beberapa masalah dalam kultur berkaitan dengan medium kultur - Kontaminasi

Medium Kultur

Konsentrasi sel fitoplankton dalam kultur cenderung lebih besar daripada di alam  membutuhkan nutrient yang lengkap untuk menutupi kekurangan nutrisi di

alam

Kebutuhan nutrisi semua jenis mikroalga umumnya sama  mempengaruhi komposisi dalam medium sama  mempengaruhi komposisi dalam medium

Beberapa masalah dalam kultur berkaitan dengan medium kultur

- Kontaminasi

Sumber     Medium kultur (air dan nutrisi), udara, dan kultur stok

- Produksi yang tidak konsisten - Kuantitas dan kualitas

 Membutuhkan komposisi nutrisi medium yang tepat

dan teknik persiapan yang steril

Persyaratan Teknis

1. Persyaratan Biologi

- bebas kontaminasi/steril ~ bakteri, protozoa, & Jamur - sterilisasi : desinfeksi, chlorinisasi

2. Persyaratan Kimia

- Faktor Nutrisi : unsur makro, unsur mikro - Faktor Nutrisi : unsur makro, unsur mikro

- unsur makro : N, P, Si; Mikro : trace metals (Co, Mn, Fe, Zn), Vit (B12, B1, biotin)

3. Persyaratan fisika-kimia air

- intensitas cahaya, temperatur, pH, salinitas

- CO2 sources & homogenisasi (aeration)

Kondisi Umum dalam Mengkultur Alga Mikro

Parameter Kisaran Optimum

Suhu (°C) 16-27 18-24

Salinitas (g.l

^-1

) 12-40 20-24

Intensitas cahaya (lux) 1,000-10,000

(bergantung pada volume dan kepadatan sel dalam

kultur)

2,500-5,000

Fotoperiode

(terang:gelap     jam)

16:8 (minimum) 24:0 (maximum)

pH 7-9 8.2-8.7

Hal penting dalam menyiapkan Kultur Media

Semua larutan harus dibuat dalam gelas kaca.

Medium umumya disiapkan dari larutan stok dari macronutrien, trace metals, dan vitamin, yang ditambahkan pada volume air yang lebih besar untuk menghindari penguapan.

untuk menghindari penguapan.

Medium yang digunakan umumnya dalam bentuk larutan atau solid dengan menambahkan 1.0-1.5

% agar.

Komposisi Nutrisi Medium

Makronutrien



Umumnya membutuhkan rasio N : Si : P = 16 :16:1



Nitrogen

- Sumber : Urea Ca (NH2)2, KNO3

- Nitrat (NO3) dan ammonium (NH4)  sering dimanfaatkan oleh mikroalga.

- Membantu dalam pembentukan asid amino (protein) dan enzim-enzim

- Ammonium bersifat

toxic

bila konsentrasinya >100 mM, sehingga konsentrasi ammonium yang digunakan harus lebih rendah 

konsentrasi ammonium yang digunakan harus lebih rendah 



Fosfat

- Sumber  TSP (triple Super Phosphat), Ca(HPO4)2, Na2HPO4, NPK

- Bentuk  senyawa anorganik yang terlarut (ortofosfat dan polifosfat) dan senyawa organik yang berupa partikulat.

- Komponen DNA, RNA, ADP, dan ATP.

- Merupakan faktor pembatas.



Silikat

- Sumber : SiO3

- Hanya digunakan oleh diatom, Silicofalgellates, dan beberapa chrysophyta

 sebagai bahan pembentuk rangka luar.

- Berpengaruh terhadap proses pembentukan klorofil a pada C. gracilis

- memicu pembentukan trigliserida

Kalsium (Ca)

penting dalam mitosis selama sel membelah dan membentuk kalsium pektat ditengah

lamela dari lapisan sel yang membentuk sel tetangga

tetangga

kalium (K)

untuk mengaktifkan beberapa enzim yang

berperan dalam proses fotosintesis dan

respirasi

Mikronutrien

 Mikronutrien Anorganik  Terdiri dari trace metals  Berguna untuk pembentukan enzim.

besi (Fe)

Peranan besi antara lain:

1. Besi merupakan bagian proses katalisis dari banyak enzim oksidasi reduksi.

2. Besi sangat penting dalam pembentukan klorofil, meskipun bukan bagian dari molekul klorofil

3. Besi penting dalam protein heme (sitokrom dan sitokrom oksidase) rangkaian pemindahan elektron dengan cara menambah dan melepaskan elektron pada proses oksidasi

dan reduksi.

4. Besi didapatkan pada sejumlah enzim oksidasi yang penting (katalase dan peroksidase) 5. Besi dijumpai pada flavoprotein, feredoksin.

Komposisi Nutrisi Medium

5. Besi dijumpai pada flavoprotein, feredoksin.

magnesium (Mg)

Magnesium memiliki beberapa fungsi penting, antara lain : - stabilisasi partikel-partikel ribosom

- terlibat dalam sejumlah reaksi enzimatik dengan kapasitas yang bervariasi,

1. dalam reaksi yang menyangkut pemindahan fosfat dari ATP,  penghubung enzim terhadap dari ATP dan penghubung enzim terhadap substratnya.

2. mengubah konstanta keseimbangan reaksi dengan cara berikatan dengan produk , misal pada reaksi-reaksi kinase tertentu serta bekerja membentuk kompleks dengan suatu inhibitor enzim.

- merupakan aktivator enzim-enzim pada reaksi pemindahan fosfat (kecuali fosforilase), sintesis asam nukleat, karboksilasi dan dekarboksilasi. Magnesium juga

- merupakan komponen molekul klorofil yang penting untuk fotosintesis.

Sulfur (S)  penting dalam pembentukan protein dimana residu ikatan di sulfida diantara sistein dan metionin dikontribusikan untuk struktur tersier.Sulfur juga terdiri atas vitamin tiamin dan biotin serta koenzim A yang merupakan komponen penting dalam respirasi dan metabolisme asam lemak.Dalam bentuk besi protein sulfur sangat penting dalam reaksi transfer elektron dalam fotosintesis dan fiksasi nitrogen.

Boron (Bo) berhubungan dengan translokasi dan penyerapan gula

Mangan (Mn) berperan serta sebagai aktivator beberapa enzim respirasi, dalam reaksi metabolisme nitrogen dan fotosintesis (berkaitan dengan pelepasan elektron dari air dalam pemecahannyamenjadi hidrogen dan oksigen). Mengaktifkan nitrat reduktase

nitrogen dan fotosintesis (berkaitan dengan pelepasan elektron dari air dalam pemecahannyamenjadi hidrogen dan oksigen). Mengaktifkan nitrat reduktase

Seng (Zn)  merupakan aktivator dari sejumlah besar enzim diantaranya ADH (Alkohol Dehidrogenase) yang mengkatalisis reduksi asetaldehid menjadi etanol, karbon anhidrase yang mengkatalisis hidrasi karbon dioksida menjadi bikarbonat. Seng tersebar luas dalam tanah namun sukar diperoleh jika kondisi pH-nya meningkat. Seng ini terlibat secara langsung dalam sintesis hormon asam aindol asetat (IAA).

Klor (Cl)mutlak diperlukan dalam fotosintesis.

Molibdenum (Mo)  Peranan yang sangat penting dari Mo ini adalah dalam reduksi nitrat dan fiksasi nitrogen

Tembaga (Cu)  Tembaga dapat dijumpai dalam plastosianin yang penting dalam fotosintesis dan berperan katalitik khusus dalam tumbuhan serta merupakan bagian dari enzim-enzim seperti polifenol oksidase dan asam askorbat oksidase.

 Mikronutrien Organik : vitamin thiamin (B ₁ ), cyanocobalamin (B ₁₂ ), dan Biotin  kofaktor dalam pembentukan enzim

 EDTA sebagai chelator agent  pengikat unsur EDTA sebagai chelator agent  pengikat unsur

logam supaya tetap dalam bentuk ter-ion

dalam air sehingga dapat dimanfaatkan oleh

mikroalga  mudah dimanfaatkan oleh

mikroalga

Elemen Symbol kimia Asal

Macronutrient Hidrogen Carbon Oksigen Nitrogen Potassium Calsium Magnesium

H C O N K Ca Mg

H₂O CO₂ O₂, CO₂ NO^3-, NH⁴⁺

K⁺ Ca²⁺

Mg²⁺

Makronutrient dan Mikronutrient yang dibutuhkan oleh mikroalga

Magnesium Phosphorus Sulfur

Silikat

Micronutrient Chlorine Boron Besi

Magnesium Zinc

Tembaga Nikel

Molybdenum

Mg P S Si

Cl B Fe Mn

Zn Cu Ni Mo

Mg²⁺

HPO^4-, HPO₄^2-

SO₄^2- SiO₂

Cl^- BO₃^3- Fe²⁺, Fe³⁺

Mn^2- Zn²⁺

Cu²⁺

Ni²⁺

Mo₄^2-

Jenis Medium

Premix

Komersial

Medium Premix

Medium yang umumnya digunakan untuk memproduksi kultur alga dalam skala kecil (skala lab)

Umumnya dapat digunakan untuk mengkultur bermacam-macam mikroalga

Terdapat dua macam medium premix yang umum

Terdapat dua macam medium premix yang umum digunakan :

 Medium Walne

 Medium Guillard

Komposisi Medium Walne (1)

Constituents Quantities

Solution A (at 1 ml per liter of culture)

Ferric chloride (FeCl₃) 0.8 g^(a)

Manganous chloride (MnCl₂, 4H₂O) 0.4 g

Boric acid (H₃BO₃) 33.6 g

EDTA^(b), di-sodium salt 45.0 g

Sodium di-hydrogen orthophosphate (NaH₂PO₄, 2H₂O) 20.0 g

Sodium nitrate (NaNO₃) 100.0 g

Solution B 1.0 ml

Make up to 1 litre with fresh water^(c) Heat to dissolve

Solution B

Zinc chloride (ZnCl₂) 2.1 g

Cobaltous chloride (CoCl₂,6 H₂O) 2.0 g

Ammonium molybdate ((NH₄)₆Mo₇O₂₄, 4H₂O) 0.9 g

Cupric sulphate (CuSO₄, 5H₂O) 2.0 g

Concentrated HCl 10.0 ml

Make up to 100 ml fresh water^(c) Heat to dissolve

Make up to 1 litre with fresh water^(c)

Solution C (at 0.1 ml per liter of culture)

Vitamin B

₁

0.2 g

Solution E 25.0 ml

Make up to 200 ml with fresh water

^(c)

Solution D (for culture of diatoms-used in addition to solutions A and C, at 2 ml

Komposisi Medium Walne (2)

Solution D (for culture of diatoms-used in addition to solutions A and C, at 2 ml per liter of culture)

Sodium metasilicate (Na

₂

SiO

₃

, 5H

₂

O) 40.0 g

Make up to 1 litre with fresh water

^(c)

Shake to dissolve Solution E

Vitamin B

₁₂

0.1 g

Make up to 250 ml with fresh water

^(c)

Solution F (for culture of Chroomonas salina - used in addition to solutions A and C, at 1 ml per liter of culture)

Sodium nitrate (NaNO

₃

) 200.0 g

Guillard’s F/2 medium

Nutrients Final concentration (mg.l^-1seawater)^a Stock solution preparations

NaNO₃ 75 Nitrate/Phosphate Solution

Working Stock: add 75 g NaNO₃ + 5 g NaH₂PO₄ to 1 liter distilled water (DW)

NaH₂PO₄.H₂O 5

Na₂SiO₃.9H₂O 30 Silicate Solution

Working Stock: add 30 g Na₂SiO₃ to 1 liter DW Na₂C₁₀H₁₄O₈N₂.H₂O

(Na₂EDTA)

4.36 Trace Metal/EDTA Solution

Primary stocks: make 5 separate

CoCl .6H O 0.01 1-liter stocks of (g.l^-1DW) 10.0 g CoCl , 9.8 g

CoCl₂.6H₂O 0.01 1-liter stocks of (g.l^-1DW) 10.0 g CoCl₂, 9.8 g CuSO₄.5H₂O 0.01 CuSO₄, 180 g MnCl₂, 6.3 g Na₂MoO₄, 22.0 g ZnSO₄ FeCl₃.6H₂O 3.15

MnCl₂.4H₂O 0.18 Working stock: add 1 ml of each primary stock solution + 4.35 g Na₂C₁₀H₁₄O₈N₂ + 3.15 g FeCl₃to 1 liter DW

Na₂MoO₄.2H₂O 0.006 ZnSO₄.7H₂O 0.022

Thiamin HCl 0.1 Vitamin Solution

Primary stock: add 20 g thiamin HCl + 0.1 g biotin + 0.1 g B₁₂to 1 liter DW

Biotin 0.0005

B₁₂ 0.0005 Working stock: add 5 ml primary stock to 1 liter DW

Medium Spirulina (Air Tawar)

g/L

Na ₂ CO ₃ 5

NaCl 5

KNO ₃ 2

NAHCO ₃ 1

K SO 1

K ₂ SO ₄ 1

Urea 0.02

2(NH ₄ )PO ₄ 0.1

MgSO ₄ .7H ₂ O 0.2

CaCO ₃ 0.02

FeSO ₄ .7H ₂ O 0.005

Medium Chlorella (Air Tawar)

Makronutrien

g/L

KNO

₃

2

MgSO

₄

.7H

₂

O 0.2

KH

₂

PO

₄

1.25

KH

₂

PO

₄

1.25

Mikronutrien

FeSO

_4.7

H

₂

O 3 mg

H

₃

BO

₃

2.85 mg

MnCl

₂

1.81 mg

ZnSO

₄

.7H

₂

O 0.82 mg

CuSO

₄

.5H

₂

O 0.078 mg

3(NH

₄

).0,7MoO

₃

.4H

₂

O 0.171 mg

Medium Komersial

Merupakan medium alternatif yang digunakan untuk memproduksi mikroalga dalam skala besar

Mengurangi jumlah tenaga kerja untuk persiapan medium

 mempengaruhi biaya pengeluaran

Hanya mengandung nutrien assensial yang paling penting

Hanya mengandung nutrien assensial yang paling penting

bagi pertumbuhan mikroalga

Kombinasi fertilizer yang digunakan untuk kultur masal alga laut

Fertilizers Concentration (mg.l^-1)

A B C D E F

Ammonium sulfate 150 100 300 100 - -

Urea 7.5 5 - 10-15 - 12-15

Calcium superphosphate 25 15 50 - - -

Clewat 32 - 5 - - - -

N:P 16/20 fertilizer - - - 10-15 - -

N:P:K 16-20-20 - - - - 12-15 -

N:P:K 14-14-14 - - - - - 30

Medium Komersial yang umum digunakan (Air Laut)

Urea 30 ppm

ZA (Chlorella) 30-40 ppm

MSP 10 ppm

FeCl

₃

1-5 ppm

EDTA 1-5 ppm

EDTA 1-5 ppm

Silikat (diatom) 10-15 ppm

KNO

₃

40-50 ppm

Vit B

₁₂

dan Biotin

Medium diatas umumnya digunakan sebagai pupuk

dalam kultur massal Chaetoceros sp. dan Chlorella

sp.

Jenis pupuk yang umum digunakan dalam kultur masal

Kultur masal mikro alga (indoor)

Kultur masal mikro alga (outdoor)