VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) ON RABBIT MENISCUS INJURY IN THE WHITE-WHITE ZONE EXPRESSED HIGHER BLOOD VESSELS DISTRIBUTION AND BRIDGING COLLAGEN TYPE 1 AFTER
SUTURING MENISCUS
PUTU FERYAWAN MEREGAWA*, KG MULYADI RIDIA*
BAGIAN ORTHOPAEDI DAN TRAUMATOLOGI FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS UDAYANA, BALI, INDONESIA
Meniscus is fibrocartilage tissue, form like a couple of C letter and located between femur and tibia. Incident of meniscus injury in Netherland is about 1000 patients a year, in England and Wales are about 25.000 patients a year. Meniscus injury can occured in outer/vascularized area (red – red zone) with good prognostic and inner/avascular area (white – white zone) with bad prognostic. General treatment of meniscus injury in avascular area is menisectomy, it will be destroyed the articular surface of the knee joint cartilage.
Administration the Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) will be increased proliferation of endothelial cells, fibroblast cells, collagen fibers type 1, and good prognostic for healing of meniscus injury in white – white zone.
Experimental study with randomized post – test only control group design which used 38 male New Zealand Rabbits. They are divided into 2 groups (18 rabbits as control group and 18 rabbits as treatment group). They adapted for 1 week, then control group had sharp incision and sutured in white – white zone meniscus only, and treatment group had administration VEGF after done sharp incision and sutured in white – white zone meniscus.
In the next 3 weeks, all rabbits sacrificed and taken the meniscus for examining the expression of blood vessels distribution and bridging collagen type 1 by histopathology and immunohistochemistry examination.
The average median number for blood vessels distribution after administration VEGF in sutured white – white zone meniscus is about 11.00 (interquartile range 2.00) and without VEGF is about 5.00 (interquartile range 1.00). In the treatment group with VEGF, 18 rabbits (100%) showed bridging collagen type 1, and control group showed in 6 rabbits (33.33%).
For inferential test with Mann-Whitney U test between treatment group with VEGF and control group without VEGF, showed significant different for blood vessels distribution in white – white zone meniscus, with p=0.000 (p < 0.05). Analysis for bridging collagen type 1 between treatment group with VEGF and control group without VEGF, showed significant different, with p=0.000 (p < 0.05).
Administration VEGF on rabbit meniscus injury in the white – white zone after suturing, expressed higher blood vessels distribution and bridging collagen type 1 when compare with suturing only without VEGF.
Keywords: VEGF, meniscus injury in the white – white zone, blood vessels distribution, bridging collagen type 1, suturing.
INTRODUCTION
Meniskus adalah suatu jaringan fibrokartilago berbentuk huruf C berpasangan yang terletak diantara femur dan tibia pada masing – masing lutut. Cedera meniskus ditandai dengan adanya robekan dari meniskus. Salah satu robekan meniskus (nomor dua tersering setelah tipe vertikal longitudinal /bucket handle) karena penyebab traumatik adalah tipe robekan vertikal radial (transverse)5
Penanganan cedera meniskus tipe vertikal radial sampai saat ini masih menimbulkan efek samping yang buruk, karena penanganannya berupa tindakan partial atau total menisectomy, yang tidak mampu mengembalikan fungsi meniskus kembali seperti semula, dan juga akan mempercepat efek buruk kerusakan permukaan tulang rawan sendi lutut di kemudian hari.
Tindakan ini dilakukan karena robekan meniskus tersebut terjadi secara keseluruhan pada daerah sentral/white – white zone (avaskular) dan sedikit melebar melewati daerah perifer/red
– red zone (vaskular), sehingga tidak dapat dilakukan perbaikan dengan cara menggunakan teknik repair dengan penjahitan karena robekannya terjadi pada daerah sentral/white – white zone (avaskular) yang sangat sulit terjadinya proses angiogenesis24.
Material and Method
This is an Experimental study with randomized post – test only control group design which used 38 male New Zealand Rabbits. They are divided into 2 groups (18 rabbits as control group and 18 rabbits as treatment group). They adapted for 1 week, then control group had sharp incision and sutured in white – white zone meniscus only, and treatment group had administration VEGF after done sharp incision and sutured in white – white zone meniscus. In the next 3 weeks, all rabbits sacrificed and taken the meniscus for examining the expression of blood vessels distribution and bridging collagen type 1 by histopathology and immunohistochemistry examination.
Data yang didapatkan pada penelitian dianalisis sebagai berikut : 1. Analisis Deskriptif
2. Analisis Inferensial :
a. Uji Homogenitas = test of the equality of variances = f – test (Levene’s test for equality of variance).
b. Uji normalitas data dengan Shapiro Wilks.
c. Jika didapatkan data berdistribusi normal maka untuk uji parametrik compare means menggunakan independent – samples t – test, dan bila tidak berdistribusi normal dapat digunakan uji Mann – Whitney U.
RESULT
Analisis penelitian mencakup sebaran data secara deskriptif sebaran pembuluh darah dan bridging kolagen tipe I daerah white – white zone meniskus kelinci. Selanjutnya data yang terkumpul dilakukan analisis secara statistik dengan SPSS For Windows Version 22.0.
1. Analisis Deskriptif
Analisis data secara deskriptif bertujuan untuk memperoleh gambaran yang lebih jelas mengenai distribusi dan simpangan baku dari masing-masing variabel penelitian.
a. Distribusi frekuensi subjek penelitian masing – masing kelompok
Kelompok Frekuensi (n) Persentase (%)
Perlakuan 18 50.00 (dengan VEGF)
Kontrol 18 50.00
(tanpa VEGF)
Total 36 100
Dari distribusi di atas dapat dilihat bahwa total jumlah subjek penelitian adalah sebanyak 36 dengan kelompok perlakuan dengan pemberian VEGF adalah sebanyak 18 atau 50.00 % dari total seluruh subjek dan kelompok kontrol tanpa pemberian VEGF sebanyak 18 atau 50.00%.
b. Data deskriptif sebaran pembuluh darah pada masing – masing kelompok perlakuan dan kontrol
Kelompok
Variabel
Kelompok Kelompok Kontrol Perlakuan dengan tanpa VEGF
VEGF (n=18) (n=18)
Mean ± SD Mean ± SD
Sebaran Pembuluh Darah 10.94 ± 1.10 4.44 ± 0.70
Rata – rata sebaran pembuluh darah pada white – white zone meniskus kelinci paska penjahitan setelah mengalami cedera pada kelompok perlakuan dengan VEGF sebesar 10.94
± 1.10. Sedangkan rata – rata sebaran pembuluh darah pada kelompok kontrol tanpa VEGF adalah sebesar 4.44 ± 0.70.
c. Data deskriptif bridging kolagen tipe I pada masing – masing kelompok perlakuan dan kontrol
Kelompok
Variabel
Kelompok Kelompok Kontrol Perlakuan dengan tanpa VEGF
VEGF (n=18) (n=18)
n (%) n (%)
Bridging Kolagen Tipe I
Ada 18 (100) 6 (33.3)
Tidak Ada 0 (0) 12 (66.7)
Pada kelompok perlakuan dengan VEGF, sebanyak 18 subjek (100%) didapatkan adanya pembentukan bridging kolagen tipe I pada white – white zone meniskus kelinci paska penjahitan setelah mengalami cedera. Sedangkan pada kelompok kontrol, sebanyak 6 subjek (33.33%) terjadi pembentukan bridging kolagen tipe I.
2. Analisis Inferensial
Analisis ini bertujuan untuk melakukan generalisasi hasil penelitian ke populasi. Uji statistik inferensial yang digunakan pada penelitian ini adalah independent t – test bila data berdistribusi normal dan varian datanya homogen. Apabila data tidak berdistribusi normal, dilakukan uji Mann – Whitney U dan uji Chi – Square. Penilaian hasil uji menggunakan 95%
CI dan nilai p pada batas kemaknaan 0.05.
a. Uji Normalitas
Variabel – variabel penelitian pada kelompok perlakuan dan kontrol dilakukan uji normalitas. Dengan jumlah data sebanyak 36 (n < 50), maka uji normalitas yang digunakan terhadap sebaran pembuluh darah pada white – white zone dan bridging kolagen tipe I pada white – white zone meniskus kelinci adalah Shapiro – Wilk test, sedangkan uji homogenitas varian data dilakukan dengan menggunakan Levene’s test.
Uji normalitas data variabel – variabel penelitian dengan Shapiro – Wilk
Variabel Kelompok N P Keterangan
Sebaran Pembuluh Darah Perlakuan 18 0.003 Tidak
Normal
Kontrol 18 0.000 Tidak
Normal
Tabel di atas menunjukkan bahwa data sebaran pembuluh darah tidak berdistribusi normal, dimana nilai p < 0.05.
3. Uji Komparabilitas Sebaran Pembuluh Darah
Untuk variabel sebaran pembuluh darah dilakukan uji komparabilitas untuk data dua kelompok dengan uji non – parametrik Mann – Withney U test karena data sebaran tidak berdistribusi normal.
a. Hasil uji komparabilitas data post – test variabel sebaran pembuluh darah untuk kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann – Whitney U
Kelompok Mann- Whitney U
Variabel Perlakuan Kontrol
(n=18) (n=18) Nilai Z Nilai p
Mean ± SD Mean ± SD Sebaran
Pembuluh
10.94 ± 1.10 4.44 ± 0.70
Darah -5.231 0.000
Hasil uji Mann – Whitney U test menunjukkan adanya perbedaan sebaran pembuluh darah yang bermakna pada white – white zone meniskus antara kelompok perlakuan dengan
VEGF dan kelompok kontrol tanpa VEGF, dan perbedaan ini secara statistik berbeda bermakna dengan nilai p < 0.05.
b. Uji Komparabilitas Bridging Kolagen Tipe I
Untuk variabel bridging kolagen tipe I yang merupakan data nominal dilakukan uji kemaknaan untuk data dua kelompok dengan uji non – parametrik Chi – Square.
Hasil uji komparabilitas data post – test variabel bridging kolagen tipe I untuk kelompok perlakuan dan kontrol
Kelompok
Kelompok Kelompok Nilai p
Variabel Perlakuan Kontrol tanpa dengan VEGF VEGF
(n=18) (n=18)
n (%) n (%)
Bridging
Kolagen tipe IAda 18 (100) 6 (33.3) 0.000
Tidak Ada 0 (0) 12 (66.7)
Total 18 (100) 18 (100)
Hasil analisis menunjukkan adanya perbedaan bridging kolagen tipe I pada white – white zone meniskus antara kelompok perlakuan dengan pemberian VEGF dengan kelompok kontrol tanpa VEGF secara statistik bermakna dengan nilai p < 0.05.
RESULT
a. Pengaruh Pemberian VEGF Terhadap pada cedera meniskus kelinci di white – white zone mengekspresikan sebaran pembuluh darah lebih tinggi paska penjahitan meniskus
Hasil uji Mann – Whitney U test menunjukkan adanya perbedaan sebaran pembuluh darah yang bermakna pada white – white zone meniskus antara kelompok perlakuan dengan VEGF dan kelompok kontrol tanpa VEGF, dan perbedaan ini secara statistik berbeda bermakna dengan nilai p < 0.05.
Hasil dari penelitian diatas dapat kita simpulkan bahwa adanya suatu cedera pada meniskus akan menyebabkan terjadinya proses angiogenesis secara alamiah, dan proses tersebut akan bertambah baik lagi kualitasnya, jika kita berikan VEGF tambahan. Sehingga pemberian VEGF terhadap cedera meniskus di white – white zone menyebabkan terjadinya ekspresi sebaran pembuluh darah yang lebih tinggi paska penjahitan meniskus. Hal ini dapat kita sesuaikan dengan penelitian yang dilakukan oleh Albornoz & Forriol (tahun 2012), menyatakan bahwa ketika terjadi suatu cedera meniskus baik di dalam daerah vaskular (red – red zone) maupun avaskular (white – white zone) akan menyebabkan terjadinya pelepasan growth factor oleh sel – sel pada daerah yang mengalami cedera dan disertai oleh pelepasan mediator – mediator inflamasi, sehingga menyebabkan sel – sel meniskus akan mengalami proses proliferasi, migrasi, diferensiasi, dan sintesis matriks sel meniskus. Dengan pemberian rekombinan protein growth factor (VEGF) dalam dosis besar dan berulangkali akan menyebabkan perangsangan meniskus untuk mengalami proses angiogenesis yang lebih baik dan tentu saja akan menstimulus terjadinya proses penyembuhan meniskus4
Adapun juga teori penelitian yang dikemukakan oleh Bao dan kawan – kawan (tahun 2009), dimana VEGF berikatan dengan 2 reseptor Tyrosinkinase, yaitu reseptor Flt-1 dan KDR pada permukaan sel endotelial dan pembuluh darah yang sudah matang dalam suatu proses penyembuhan cedera serta akan menginduksi fosforilasi dan memicu migrasi dari sel endotelial dan proses angiogenesis. VEGF akan menginduksi pergerakan membran sel endotelial, proses kemotaksis, proliferasi dari sel endotelial, vasodilatasi, degradasi membran sel basal, dan migrasi sel endotel. Kemudian akan terjadi pembentukan pipa – pipa kapiler darah serta diikuti pembentukan anastomosis pararel dari kapiler dan akhirnya terjadi pembentukan membran sel basal yang baru6
Selain itu, terdapat hasil penelitian yang dilakukan oleh Wolf Petersen dan kawan – kawan (tahun 2004), menyatakan bahwa penelitian yang dilakukan yaitu dengan pemberian VEGF paska penjahitan pada avaskular area dari cedera meniskus domba Merino menunjukkan terjadinya suatu peningkatan ekspresi VEGF, proses stimulus dari proliferasi sel endotel pembuluh darah dan proses angiogenesis. Namun penelitian tersebut membantah terjadinya proses penyembuhan pada daerah avaskular (white – white zone) meniskus domba (Petersen et al., 2004). Hal ini dapat disimpulkan, karena robekan meniskus pada domba tersebut dilakukan secara longitudinal (bucket handle), sehingga tidak terjadi suatu stimulus dalam pembentukan proses angiogenesis yang menyeberang dari daerah vaskular (red – red zone) menuju ke daerah avaskular (white – white zone). 22
b. Untuk Pengaruh pemberian VEGF terhadap cedera meniskus kelinci di white – white zone dalam mengekspresikan bridging kolagen tipe 1, dianalisis dengan membandingkan antara kelompok perlakuan dengan pemberian VEGF dengan kelompok kontrol tanpa pemberian VEGF
Untuk variabel bridging kolagen tipe I yang merupakan data nominal dilakukan uji kemaknaan untuk data dua kelompok dengan uji non-parametrik Chi-Square. Hasil analisis menunjukkan adanya perbedaan bridging kolagen tipe I antara kelompok perlakuan dengan VEGF dengan kelompok kontrol tanpa VEGF secara statistik bermakna dengan nilai p < 0.05.
Hasil dari penelitian diatas dapat kita simpulkan bahwa pemberian VEGF terhadap cedera meniskus di white – white zone menyebabkan bridging kolagen tipe 1 lebih tinggi paska penjahitan. Hal ini dapat kita perkirakan dimana proses awal dari adanya suatu cedera meniskus pada daerah vaskular (red – red zone) maupun avaskular (white – white zone) adalah akan terjadinya suatu proses angiogenesis yang melibatkan peran VEGF secara alamiah. Hal tersebut akan bertambah baik jika cedera tersebut kita berikan rekombinan protein VEGF tambahan, yang tentu saja akan menyebabkan terjadinya proses angiogenesis yang lebih baik, dan merangsang terbentuknya pembuluh darah baru yang lebih banyak, sehingga meniskus akan banyak mengandung sel – sel fibroblas. Seperti halnya penelitian yang dilakukan oleh Makris dan kawan – kawan (tahun 2011) dan Fox dan kawan – kawan (tahun 2012), menyatakan bahwa kandungan histologi meniskus secara umum terutama pada red – red zone mengandung banyak sel – sel fibroblas. Sel – sel tersebut akan bertambah banyak jika terdapat peran VEGF yang baik dalam membentuk suatu proses angiogenesis. Sehingga sel – sel fibroblas tersebut akan memproduksi matriks ekstraselular serat kolagen tipe 1 yang berlimpah 5,9. Akhirnya dapat kita simpulkan bahwa dengan adanya sebaran pembuluh darah yang lebih banyak akibat pemberian VEGF, akan menginduksi pergerakan membran sel endotelial, proses kemotaksis, proliferasi dari sel endothelial, vasodilatasi, migrasi sel endotel, dan pembentukan membran sel basal yang baru yang lebih baik dan berkualitas, sehingga menyebabkan banyaknya pembentukan sel – sel fibroblas, yang kemudian akan berakibat dengan peningkatan produksi matriks extraselular serat kolagen tipe 6. Sehingga menyebabkan terjadinya bridging kolagen tipe 1 dari red – red zone menuju ke white – white zone meniskus.
Selain itu, penelitian yang dilakukan oleh Kim dan kawan – kawan (tahun 2016), menyimpulkan bahwa efek dari VEGF adalah meningkatkan pembentukan pembuluh darah dan akan membentuk suatu kerangka proliferasi sel – sel regenerasi jaringan setelah mengalami cedera, serta meningkatkan pembentukan proliferasi fibroblas dan deposisi atau endapan serat kolagen pada suatu cedera meniskus23
DAFTAR PUSTAKA
1. Snoeker BA, Bakker EW, Kegel CA, Lucas C. Risk factors for meniscal tears: a systematic review including meta-analysis. journal of orthopaedic & sports physical therapy. 2013;43(6):352-67.
2. Stavrou ZP, Stavrou PZ. Management of Synovial Disorders. European Surgical Orthopaedics and Traumatology: Springer; 2014. p. 301-18.
3. Feeley BT, Gallo RA, Sherman S, Williams RJ. Management of osteoarthritis of the knee in the active patient. Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons.
2010;18(7):406-16.
4. de Albornoz PM, Forriol F. The meniscal healing process. Muscles, ligaments and tendons journal. 2012;2(1):10.
5. Makris EA, Hadidi P, Athanasiou KA. The knee meniscus: structure–function, pathophysiology, current repair techniques, and prospects for regeneration.
Biomaterials. 2011;32(30):7411-31.
6. Bao P, Kodra A, Tomic-Canic M, Golinko MS, Ehrlich HP, Brem H. The role of vascular endothelial growth factor in wound healing. Journal of Surgical Research.
2009;153(2):347-58.
7. Hauser RA, Phillips HJ, Maddela HS. The Case for Utilizing Prolotherapy as First-Line Treatment for Meniscal Pathology. Journal of Prolotherapy. 2010;2(3):416-37.
8. Howell R, Kumar NS, Patel N, Tom J. Degenerative meniscus: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options. World journal of orthopedics. 2014;5(5):597.
9. Fox AJ, Bedi A, Rodeo SA. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports health. 2012;4(4):340-51.
10. Brindle T, Nyland J, Johnson DL. The meniscus: review of basic principles with application to surgery and rehabilitation. Journal of athletic training. 2001;36(2):160.
11. Rath E, Richmond JC. The menisci: basic science and advances in treatment. British journal of sports medicine. 2000;34(4):252-7.
12. Johnson KE, Wilgus TA. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis in the regulation of cutaneous wound repair. Advances in wound care. 2014;3(10):647-61.
13. Gao C, Harvey E, Chua M, Chen B, Jiang F, Liu Y, et al. MSC-seeded dense collagen scaffolds with a bolus dose of VEGF promote healing of large bone defects.
metabolism. 2013;500(5):10-5.
14. Gelse K, Pöschl E, Aigner T. Collagens—structure, function, and biosynthesis.
Advanced drug delivery reviews. 2003;55(12):1531-46.
15. Kruger TE, Miller AH, Wang J. Collagen scaffolds in bone sialoprotein-mediated bone regeneration. The Scientific World Journal. 2013;2013.
16. Bode M. Characterization of type I and type II collagens in human tissues. 2002.
17. Xiong J, O'Brien CA. Osteocyte RANKL: new insights into the control of bone remodeling. Journal of Bone and Mineral Research. 2012;27(3):499-505.
18. Polewski MD, Johnson KA, Foster M, Millán JL, Terkeltaub R. Inorganic pyrophosphatase induces type I collagen in osteoblasts. Bone. 2010;46(1):81-90.
19. Wallace JM, Erickson B, Les CM, Orr BG, Holl MMB. Distribution of type I collagen morphologies in bone: relation to estrogen depletion. Bone. 2010;46(5):1349-54.
20. Howarth M, Chinnapen DJ, Gerrow K, Dorrestein PC, Grandy MR, Kelleher NL, et al.
A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. Nature methods. 2006;3(4):267.
21. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. Shock.
1999;12(6):479.
22. Petersen W, Pufe T, Stärke C, Fuchs T, Kopf S, Raschke M, et al. Locally applied angiogenic factors–a new therapeutic tool for meniscal repair. Annals of Anatomy- Anatomischer Anzeiger. 2005;187(5):509-19.
23. Kim J-H, Kim T-H, Kang MS, Kim H-W. Angiogenic Effects of Collagen/Mesoporous Nanoparticle Composite Scaffold Delivering VEGF165. BioMed research international.
2016;2016.
24. Mordecai, S.C., Al-Hadithy N., Ware H.E., Gupte C.M. (2014). Treatment of Meniscal Tears : An Evidence Based Approach. World Journal Orthopaedy, 5 (3), 233 - 239
