4.DINAMIKA DISTRIBUSI GLIKOKONJUGAT PADA GONAD WALET LINCHI SELAMA PERIODE 12 BULAN

(1)

Pendahuluan

Ovarium merupakan tempat perkembangan folikel, ovulasi dan luteinisasi. Semua proses tersebut meliputi proses pembelahan sel, kematian sel, migrasi sel dan perlekatan sel-sel ovarium (Kimura et al. 1999). Selama proses tersebut berlangsung, terjadi perubahan glikokonjugat pada setiap tahapan perkembangan folikel. Pada testis, glikokonjugat berperan pada proses spermatogenesis, pengaturan konformasi protein, transport ion melalui membran, perlindungan terhadap agen proteoloitik, pengenalan sel serta mengikat hormon dan glikoprotein lainnya (Schulte and Spicer 1985). Dengan demikian keberadaan glikokonjugat pada ovarium dan testis dapat menjadi penanda aktivitas kedua organ tersebut.

Metode pewarnaan histokimia lektin merupakan salah satu metode yang sangat baik untuk menganalisa jenis karbohidrat melalui residu gula yang lebih spesifik pada jaringan. Metode ini memiliki sensitivitas dan spesifitas yang lebih tinggi dalam membedakan komponen gula serta mampu mengidentifikasi perbedaan yang sedikit pada struktur glikokonjugat (Kiernan 1990, Munoz et al. 1999). Oleh karena itu pada penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap dinamika distribusi glikokonjugat pada testis dan ovarium walet linchi selama 12 bulan.

Pada penelitian ini digunakan 7 macam lektin yang terkonjugasi dengan biotin yaitu Concanavalin A (Con A), Dolichos biflorus agglutinin (DBA), Peanut agglutinin (PNA), Ricinus communis agglutinin (RCA-120), Soybean agglutinin (SBA), Ulex europaeus agglutinin (UEA-I), dan Wheat germ agglutinin (WGA) yang digunakan untuk merunut adanya ikatan gula-gula/glikokonjugat spesifik yang ada pada jaringan (Tabel 4).

(2)

Tabel 4 Jenis lektin yang digunakan dalam penelitian beserta ikatan gula spesifik Jenis lektin Ikatan spesifik

Concanavalin A (Con A) α-D-glukosa, α-D-manosa (glukosa, manosa) Dolichos biflorus agglutinin (DBA) GalNac, 1-3 GalNac (asetilgalaktosamin) Peanut agglutinin (PNA) Gal ß 1-3 GalNac (galaktosa, asetilgalaktosamin) Ricinus communis agglutinin (RCA-120) Gal ß, 1-4 GlcNAc (galaktosa, asetilglukosamin) Soybean agglutinin (SBA) Siaα, 2-6Gal/GalNAc (asam sialat,

asetilgalaktosamin) Ulex europaeus agglutinin (UEA-I) α-L-Fuc (fukosa)

Wheat germ agglutinin (WGA) ß-D-GlcNAc (asetilglukosamin)

Bahan dan Metode

Pengambilan sampel dilakukan setiap bulan pada 3 ekor burung jantan dan 3 ekor burung betina selama 12 bulan. Burung dianestesi per inhalasi dengan cara dimasukkan ke dalam stoples berisi kapas yang telah diberi larutan eter. Segera setelah pingsan, berat badan masing-masing burung walet ditimbang menggunakan timbangan digital. Sampel gonad (testis dan ovarium) dikeluarkan dari tubuh burung, selanjutnya direndam dalam botol berisi larutan paraformaldehida 4% selama 3 X 24 jam. Setelah itu sampel organ dipindahkan ke larutan alkohol 70% yang digunakan sebagai larutan penyimpan sampai dengan pemrosesan selanjutnya.

Untuk pengamatan mikroanatomi dilakukan proses histologi rutin. Dimulai dari dehidrasi, sampel direndam di dalam alkohol dengan konsentrasi bertingkat, mulai dari alkohol 70%, 80%, 90% sampai 100%, dilanjutkan dengan larutan silol dan kemudian ditanam dalam parafin (embedding) menjadi blok parafin. Blok parafin dipotong serial dengan ketebalan 5 µm dengan menggunakan mikrotom dan dilekatkan pada gelas obyek kemudian diinkubasikan semalam dalam inkubator 40 C. Setelah sampel melekat pada gelas obyek, maka sampel siap untuk diwarnai. Proses pewarnaan didahului dengan proses rehidrasi yang bertujuan untuk mengembalikan cairan ke dalam sampel organ. Proses rehidrasi dimulai dari larutan silol, dilanjutkan dengan larutan alkohol 100%, 90%. 80%, 70 %.

Selanjutnya dilakukan pewarnaan histokimia lektin untuk pengamatan terhadap dinamika perubahan distribusi dan konsentrasi glikonjugat pada proses

(3)

spermatogenesis testis dan folikulogenesis ovarium. Lektin yang digunakan adalah lektin yang terkonjugasi biotin (Biotinylated lectin kit kode VEC LK-2000, Vector Lab, USA) terdiri atas Con A, DBA, RCA, UEA, SBA, PNA dan WGA dengan dosis masing-masing 5µg/µl. Untuk memastikan spesifisitas reaksi, digunakan juga sediaan asal mencit yang diketahui mengandung karbohidrat yang ingin dideteksi sebagai sediaan kontrol positif dan kontrol negatif. Intensitas dan konsentrasi karbohidrat yang terdeteksi digolongkan secara kuantitatif menjadi -: bereaksi negatif, + : sedikit, ++ : sedang, +++: banyak

Hasil

a. Gonad Jantan (Testis)

Pada sediaan yang diwarnai dengan teknik histokimia lektin, reaksi positif ditandai dengan munculnya warna coklat dari khromogen. Reaksi positif menandakan adanya ikatan lektin dengan residu gula yang melambangkan glikokonjugat tertentu. Reaksi positif ditemukan terutama pada bagian sel Sertoli, spermatogonium, spermatosit, spermatid dan spermatozoa dengan intensitas reaksi yang bervariasi tergantung pada jenis lektin dan bulan pengambilan sampel. Distribusi dan intensitas reaksi positif dari masing-masing lektin pada sel Sertoli, spermatogonium, spermatosit dan spermatid walet linchi dapat dilihat pada tabel 5, 6, 7 dan 8.

Pada sel Sertoli, lektin WGA bereaksi positif lemah pada bulan Januari dan Februari, sedang pada bulan Maret sampai Desember bereaksi positif sedang sampai kuat. Lektin Con A bereaksi positif lemah pada bulan Januari, Februari, Mei sampai September, sedangkan pada bulan Maret, April, Oktober sampai Desember bereaksi positif sedang. Lektin RCA dan UEA bereaksi negatif pada bulan Mei sampai September dan bereaksi positif lemah pada bulan Januari sampai Maret, sedangkan pada bulan April, Oktober sampai Desember bereaksi positif sedang sampai kuat. Lektin PNA dan SBA bereaksi negatif pada bulan Januari sampai November, bereaksi positif kuat pada bulan Desember. Sedangkan lektin DBA bereaksi negatif dari bulan Januari sampai Desember (Tabel 5).

(4)

Tabel 5 Pola distribusi ikatan lektin pada sel Sertoli walet linchi

Ket : Jan: Januari, Feb: Februari, Mar: Maret, Apr: April, Mei: Mei, Jun: Juni, Jul: Juli, Ags: Agustus, Sep: September, Okt: Oktober, Nov: November, Des:Desember. -: negatif, + : sedikit, ++ : sedang, +++: banyak. PNA: Peanut agglutinin, WGA: Wheat germ agglutinin, SBA: Soybean agglutinin, DBA: Dolichos biflorus agglutinin, Con A: Concanavalin A, RCA: Ricinus communis agglutinin, UEA: Ulex europaeus agglutinin.

Pada spermatogonium, hanya lektin Con A dan SBA yang bereaksi positif. Lektin Con A bereaksi positif lemah pada setiap bulan. Lektin SBA bereaksi negatif pada bulan Juni sampai September dan bereaksi positif sedang pada bulan September sampai Mei. Lektin PNA, WGA, DBA, RCA dan UEA bereaksi negatif pada spermatogonium (Tabel 6).

Tabel 6 Pola distribusi ikatan lektin pada sel spermatogonium walet linchi

Jenis Bulan

Lektin Jan Feb Mar Apr Mei Jun Jul Ags Sep Okt Nov Des

PNA - - - +++ WGA + + ++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ SBA - - - +++ DBA - - - - Con A + + ++ +++ + + + + + ++ ++ + RCA + + ++ +++ - - - ++ ++ +++ UEA + + + ++ - - - ++ +++ Jenis Bulan

PNA - - - - WGA - - - - SBA ++ ++ ++ ++ ++ - - - ++ ++ ++ ++ DBA - - - - Con A + + + + + + + + + + + + RCA - - - - UEA - - - -

(5)

Tabel 7 Pola distribusi ikatan lektin pada sel spermatosit walet linchi

Pada bulan Januari sampai Desember, sel spermatosit dengan lektin WGA bereaksi positif sedang sampai kuat, sedangkan lektin Con A dan RCA bereaksi positif lemah sampai sedang. Lektin PNA, SBA dan DBA bereaksi negatif pada bulan Juni sampai September, sedangkan pada bulan lain bereaksi positif lemah sampai kuat. Lektin UEA bereaksi positif dengan intensitas sedang pada bulan Maret, April, Oktober, November dan Desember, dan pada bulan lainnya bereaksi negatif (Tabel 7).

Pada sel spermatid, lektin WGA, Con A dan RCA bereaksi positif setiap bulan dengan intensitas sedang sampai kuat. Lektin PNA, SBA dan DBA bereaksi positif lemah sampai kuat dan bereaksi negatif pada bulan Juni sampai September. Sedangkan lektin UEA bereaksi negatif pada bulan Januari dan Februari dan bereaksi positif pada bulan Maret sampai Desember dengan intensitas lemah sampai sedang (Tabel 8).

Jenis Bulan

PNA +++ + + ++ ++ - - - + ++ ++ +++ WGA ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ SBA +++ + + ++ ++ - - - + ++ ++ +++ DBA + + + + + - - - - + + + Con A + + ++ ++ ++ + + + + ++ ++ ++ RCA +++ +++ ++ +++ ++ + + + + ++ ++ ++ UEA - - ++ ++ - - - ++ ++ ++

(6)

Tabel 8 Pola distribusi ikatan lektin pada sel spermatid testis walet linchi

Jenis Bulan

PNA ++ ++ ++ ++ ++ - - - + ++ ++ ++ WGA +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ SBA ++ ++ ++ +++ ++ - - + + ++ ++ +++ DBA + + ++ +++ + - - - - + ++ +++ Con A +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ RCA +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ UEA - - ++ ++ + + + + + ++ ++ ++ WGA WGA Januari Desember Desember Mei WGA WGA

(7)

PNA PNA PNA SBA SBA SBA Januari Januari Mei Mei Desember Mei Desember Januari

Gambar 12 Pola distribusi ikatan lektin WGA, PNA, SBA dan UEA pada sampel testis walet linchi bulan Januari, Juni dan Desember. Lektin WGA, PNA dan SBA bereaksi negatif pada spermatogonium, pada sel Sertoli bereaksi positif sedikit pada bulan Januari dan bereaksi positif sedang sampai kuat pada Juni dan Desember. Lektin UEA bereaksi negatif pada sel Sertoli, sel spermatogonium dan sel spermatid pada bulan Januari dan Juni sedangkan bereaksi positif sedang sampai kuat pada bulan Desember. Bar Januari : 25 µm , Juni & Desember : 50 µm

Lektin UEA bereaksi negatif pada spermatid pada Bulan Januari dan Mei, dan bereaksi positif sedang sampai kuat pada spermatid dan spermatozoa Bulan Desember Bar Januari : 25 µm. Mei dan Desember : 50 µm

Juni WGA Januari WGA Juni WGA Desember Januari UEA Juni UEA Desember UEA PNA Januari PNA PNA Desember Januari SBA Juni SBA Desember SBA

(8)

b. Gonad Betina (Ovarium)

Pada sediaan yang diwarnai dengan teknik histokimia lektin, reaksi positif ditandai dengan munculnya warna coklat dari khromogen. Reaksi positif menandakan adanya ikatan lektin yang melambangkan glikokonjugat dengan berbagai residu gula. Reaksi positif ditemukan terutama pada bagian oosit, sel granulosa dan membran perivitelin dengan intensitas reaksi yang bervariasi tergantung pada jenis lektin dan bulan pengambilan sampel.

Distribusi dan intensitas reaksi positif dari masing-masing lektin pada oosit, sel granulosa dan membran perivitelin ovarium walet linchi dapat dilihat pada Tabel 9, 10 dan 11 .

Pada oosit, lektin SBA bereaksi positif sedang setiap bulannya. Lektin Con A dan RCA bereaksi positif sedang pada bulan Januari sampai Agustus, kemudian bereaksi positif kuat pada bulan September sampai Desember. Lektin PNA bereaksi positif lemah sampai sedang pada bulan November sampai Mei dan bereaksi negatif pada bulan Juni sampai Oktober. Sedang lektin DBA dan UEA bereaksi negatif setiap bulannya.

Tabel 9 Pola distribusi ikatan lektin pada oosit walet linchi

Jenis Bulan

PNA ++ ++ + + + + + + ++ ++ ++ ++ WGA ++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ SBA ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ DBA - - - - Con A ++ ++ + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ RCA ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ UEA - - - - UEA UEA UEA

(9)

Pada oosit, lektin SBA bereaksi positif sedang setiap bulannya. Lektin Con A dan RCA bereaksi positif sedang pada bulan Januari sampai Agustus, kemudian bereaksi positif kuat pada bulan September sampai Desember. Lektin PNA bereaksi positif lemah sampai sedang pada bulan November sampai Mei dan bereaksi negatif pada bulan Juni sampai Oktober. Sedang lektin DBA dan UEA bereaksi negatif setiap bulannya (Tabel 9).

Tabel 10 Pola distribusi ikatan lektin pada sel granulosa ovarium walet linchi

Ikatan lektin pada sel granulosa (Tabel 10) dan membran perivitelin (Tabel 11) mempunyai pola yang sama. Lektin SBA bereaksi positif sedang setiap bulannya. Lektin Con A dan RCA bereaksi positif sedang pada bulan Januari sampai Agustus dan bereaksi positif kuat pada bulan September sampai Desember. Lektin PNA bereaksi positif lemah pada bulan Maret sampai Agustus dan bereaksi positif sedang pada bulan September sampai Januari. Lektin WGA bereaksi positif kuat pada bulan Februari sampai Mei dan bereaksi positif sedang pada bulan Juni sampai Januari. Sedangkan lektin DBA dan UEA bereaksi negatif dari bulan Januari sampai Desember.

Jenis Bulan

PNA ++ ++ + + + - - - + + WGA ++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ SBA ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ DBA - - - - Con A ++ ++ + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ RCA ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ UEA - - - -

(10)

Tabel 11 Pola distribusi ikatan lektin pada membran perivitelin walet linchi

Jenis Bulan

PNA ++ ++ + + + + + + ++ ++ ++ ++ WGA ++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ SBA ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ DBA - - - - Con A ++ ++ + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ RCA ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ UEA - - - -

(11)

Gambar 13 Pola distribusi ikatan lektin Con A, WGA, SBA dan RCA pada folikel ovarium walet linchi bulan Juli, Oktober dan Februari. Lektin Con A, WGA, SBA bdan RCA bereaksi positif sedang sampai kuat pada oosit dan membran perivitelin, pada bulan Juli, Oktober dan Februari. Bar Juli dan Oktober : 10 µm ; Februari : 50 µm

b

a

o Juli mp Oktober Juli Februari Juli Juli Oktober Juli Oktober Juli Februari Februari Februari

b

c

a

c

b

a

o

c

b

a

(12)

Pembahasan

Sebagian dari proses-proses penting pada jaringan dan organ seperti pertumbuhan, pergerakan, morfologi dan diferensiasi sel dikontrol oleh materi yang terdapat pada permukaan sel. Karbohidrat mempunyai struktur molekul pembeda sebagai pembawa informasi. Karbohidrat kompleks yang terdapat pada permukaan sel mempunyai kemampuan untuk membawa informasi penting dalam proses pengenalan sel. Reseptor spesifik gula juga terdapat pada permukaan sel dan dapat berinteraksi dengan gula pada sel yang spesifik yang berkontak dengan sel tersebut (Brandley and Schnaar 1986). Karbohidrat kompleks glikokaliks dibentuk dari monosakarida terutama heksosa (glukosa, galaktosa, mannosa dan fukosa), gula N-asetilamino (N-asetilglukosamin dan N-asetilgalaktosamin) dan asam sialat. Karbohidrat dalam bentuk kompleks (glikokonjugat) berperan penting dalam berbagai proses metabolisme tubuh, antara lain regenerasi dan diferensiasi sel, perlekatan dan komunikasi antar sel, dan proses fungsional lainnya. Glikokonjugat dapat ditemukan pada semua jaringan tubuh hewan, terutama pada sekresi kelenjar dan permukaan sel (Goldstein et al. 1977).

Pada testis, lektin WGA, Con A, dan RCA bereaksi positif lemah sampai kuat pada semua sel di tubuli seminiferi dari bulan Januari sampai Desember. Hal ini mengindikasikan keberadaan karbohidrat dengan residu gula asetilgalaktosamin, mannosa, glukosa dan galaktosa dalam proses spermatogenesis. Karbohidrat-karbohidrat tersebut kemungkinan terkait dalam proses spermatogenesis. Karbohidrat dengan residu gula galaktosa berperan dalam proses adhesi dan diferensiasi sel, residu gula N-asetilgalaktosamin berperan dalam transport ion dan cairan (Spicer 1993). Karbohidrat dengan residu gula glukosa dan manosa berperan dalam transport ion. Hasil penelitian ini mirip dengan yang dilaporkan pada burung onta (Abd-Elmaksoud et al. 2008). Pada spermatosit dan spermatid lektin PNA, SBA, DBA dan UEA hanya bereaksi positif pada bulan Oktober sampai Mei, sedangkan bulan Juni sampai September bereaksi negatif. Hal ini mengindikasikan bahwa karbohidrat dengan residu gula asetilgalaktosamin, asam sialat, galaktosa dan fukosa terkait dengan aktivitas spermatogenesis pada musim berbiak.

(13)

Pada sel Sertoli, lektin RCA dan UEA bereaksi positif lemah sampai sedang pada musim berbiak dan bereaksi negatif pada musim bersarang. Hal ini mengindikasikan bahwa karbohidrat dengan residu gula galaktosa dan fukosa terkait dengan peran utama sel Sertoli saat musim berbiak yaitu dalam regulasi perkembangan sel-sel spermatogonium, sel peritubular dan sel Leydig (Skinner 1991). Pada sel Sertoli tidak ditemukan adanya residu gula asetilgalaktosamin. Pada sel spermatogonium, hanya lektin Con A yang selalu bereaksi positif dengan intensitas lemah, pada semua bulan dari Januari sampai Desember. Hal ini menunjukkan bahwa spermatogonium walet linchi mengandung karbohidrat dengan residu gula glukosa, mannosa dengan konsentrasi yang sama sepanjang tahun. Lektin SBA bereaksi positif hanya pada musim berbiak. Hal ini mengindikasikan bahwa karbohidrat dengan residu gula asam sialat dan galaktosa terlibat dalam perkembangan spermatogonium selama musim berbiak. Asam sialat berperan dalam proses pengaturan konformasi protein, transport ion melalui membran, perlindungan terhadap agen proteoloitik, pengenalan sel dan mengikat hormon dan glikoprotein lainnya (Schulte and Spicer 1985).

Pada ovarium, lektin yang memperlihatkan reaksi positif adalah PNA, WGA, RCA, Con A dan SBA dengan intensitas bervariasi dari lemah sampai kuat. Sedangkan lektin UEA dan DBA bereaksi negatif pada oosit, sel granulosa dan membran perivitelin selama 12 bulan pengamatan. Hal ini menunjukkan bahwa pada ovarium tidak terdapat residu gula asetilgalaktosamin dan fukosa, kedua residu gula tersebut tidak dibutuhkan dalam proses folikulogenesis. Lektin PNA pada oosit bereaksi positif lemah sampai sedang pada bulan November sampai Mei dan bereaksi negatif pada bulan Juni sampai Oktober. Hal ini mengindikasikan karbohidrat dengan residu gula galaktosa dan asetilgalaktosamin berperan pada oosit pada saat periode reproduksi. Pada oosit, sel granulosa dan membran perivitelin selama 12 bulan pengamatan lektin Con A, RCA, WGA dan SBA bereaksi positif sedang sampai kuat, hal ini mengindikasikan bahwa karbohidrat dengan residu gula glukosa, manosa, galaktosa, asetilgalaktosamin dan asam sialat berperan dalam proses folikulogenesis pada masa berbiak dan bersarang walet linchi.

(14)

Keberadaan glikokonjugat pada awal pertumbuhan folikel diduga berkaitan dengan proses perkembangan folikel. Pada folikel periode istirahat dan folikel periode perkembangan, glikokonjugat yang terdeteksi diduga terkait dengan penggunaannya sebagai sumber energi, tanda komunikasi antar sel dan proses yang terkait dengan perkembangan folikel. Pada folikel tahap reproduksi, glikokonjugat yang ada diduga terkait dengan proses sintesis reseptor terhadap spermatozoa (Rath et al. 2005; Tulsiani et al. 1997).

Simpulan

Distribusi dan konsentrasi glikokonjugat pada gonad walet linchi mengalami perubahan seiring dengan musim berbiak dan bersarang.