Protein Ppt - Repository Universitas Ahmad Dahlan

Analisis

Obat, Makanan dan Kosmetika

Oleh

Hari Susanti, S.Si.,M.Si.,Apt

Fakultas Farmasi

Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta

PROTEIN

I. Struktur Umum Protein

Berdasarkan struktur diatas,



Protein mempunyai sifat amfoter,

dan dengan asam dan basa akan membentuk garam

yang dapat mengalami ionisasi



Gugus -NH

₂

bebas melekat pada ujung kiri dan gugus

-COOH bebas melekat pada ujung kanan molekul

H₂N HC

R

C O

H

N C

R

C O

H C

R

C

OH O H

N

II. Struktur Molekul Protein

Protein

terdiri dari

asam amino-asam amino

,

terikat bersama-sama dalam bentuk

ikatan peptida

(-CO-NH-) melalui

proses kondensasi

.

Pada pembentukan ikatan peptida

, air dilepaskan dari H

pada gugus



-NH

₂

suatu asam amino

dan dari OH pada

gugus



-COOH

asam amino yang lain

CH₂

glisin

glisin H₂C NH₂

C O OH N H H C O OH CH₂ H₂C NH₂

III. Sifat Koloid Larutan Protein

IV. Klasifikasi Protein

1. Berdasarkan komposisi

a. Simple Protein. Protein murni yang ditemukan di alam, yang jika terhidrolisis membentuk beberapa asam amino utama atau derivatnya

contoh: albumin, globulin, prolamin, protamin.

b. Conjugated Protein. Simple Protein yang terikat dengan molekul nonprotein

contoh: kromoprotein, glikoprotein, fosfoprotein, nukleoprotein.

c. Derived Protein. Protein yang padanya melekat gugus

artifisial (artificial group) hasil dari aktivitas panas, enzim, dan reagen kimia

contoh: pepton, coagulated protein. 2. Berdasarkan fungsi fisiologinya

a. Protein struktural d. Enzim

b. Protein kontraktil e. Antibodi

V. Fungsi Protein

1. Komponen membran dinding sel dan

mitokondria.

2. Komponen darah.

3. Komponen hemoglobin.

4. Enzim (katalis biologis).

5. Hormon.

VI. Komposisi Protein

C

= 50-55%,

H

= 6-7,3%,

O

= 19-24%,

N

= 13-19%,

S

= 0-4%.

Protein juga dilaporkan mengandung

P

,

Fe

,

Cu

,

I

,

IX. Analisis Kualitatif

Analisis kualitatif protein tidak cukup dilakukan dengan beberapa reaksi warna saja melainkan

harus diikuti dengan uji tertentu yang terkait dengan tertentu yang terdapat pada protein.

1. Uji Komposisi Suatu Protein

a. Uji komposisi secara umum

Protein (serbuk) dipanaskan dalam tabung reaksi kering. Warna hitam residu menandakan adanya karbon; bau

amoniak (membirukan kertas lakmus merah) menandakan

adanya nitrogen dan hidrogen; kertas yang mengandung

Pb-asetat menjadi berwarna hitam menandakan adanya

sulfur.

b. Uji terhadap nitrogen organik --- uji Lassaigne

2. Reaksi Warna Untuk Protein

a. Uji Biuret

CuSO₄ dalam suasana basa bereaksi dengan senyawa yang mengandung dua atau tiga ikatan peptida membentuk

kompleks berwarna violet.

Reaksi ini bersifat tidak mutlak spesifik untuk ikatan peptida; juga diberikan oleh semua senyawa yang mempunyai dua atau lebih ikatan peptida.

Asam amino  negatif : tidak mempunyai ikatan peptida

Dipeptida  negatif : hanya mempunyai satu ikatan peptida Warna yang dihasilkan  karena terbentuknya kompleks

koordinasi antara Cu2+, gugus karbonil dan gugus –NH- yang

b.

Uji Millon

Reagen Millon + larutan protein



pertama-tama

protein diendapkan sebagai garam-merkuri (endapan

berwarna putih). Pada pemanasan dengan nyala api kecil



endapan berubah seperti warna merah-daging (+)

Hanya protein yang mengandung tirosin

yang mengalami

hidrolisis yang memberikan reaksi positif

.

Gugus hidroksifenil (-C

₆

H

₄

OH) pada tirosin merupakan

gugus yang merespon uji ini. Karenanya uji Millon

c. Uji Hopkins-Cole

Gugus indol pada triptofan merupakan gugus

yang merespon uji ini. Gugus aldehid pada asam glioksilik membantu merubah gugus indol menjadi senyawa

berwarna violet.

Uji Hopkins-Cole ini selanjutnya dijadikan uji terhadap triptofan. H C asam glioksalik + O COOH triptofan N H H₂ C HC

d. Uji Liebermann

Jika HCl pekat ditambahkan pada protein (padatan), kemudian dididihkan, dan ditambah beberapa tetes larutan sukrosa, maka warna violet akan terlihat jika protein mengandung triptofan. Mirip dengan uji

Hopkins-Cole, gugus aldehid di sini berasal dari kerja HCl terhadap gula

e. Uji Acree-Rosenheim

Uji ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi formaldehid dalam susu. Protein yang

mengandung triptofan pada susu, dengan adanya

formaldehid (mempunyai gugus aldehid),

memberikan hasil positif (ditunjukkan dengan

f. Uji p-DAB Ehrlich

Ehrlich menyarankan digunakannya p-DAB (p-dimetil-aminobenzaldehid) sebagai aldehid untuk uji triptofan. g. Uji Diazo Ehrlich

Pada penambahan larutan protein yang mengandung histidin atau tirosin, dan larutan dibuat basa dengan NH₄OH  terjadi

warna merah hingga orange. Histidin akan memberikan warna merah hingga orange; tirosin memberikan warna orange terang.

h. Uji Sulfur

Jika larutan protein dididihkan dengan campuran larutan KOH atau NaOH dan Pb-asetat, endapan berwarna hitam akan terbentuk jika terdapat asam amino yang mengandung sulfur (misalnya sistein dan metionin). Larutan basa kuat memutus ikatan sulfur pada asam amino, membentuk K₂S, yang

dengan Pb-asetat membentuk PbS, senyawa berwarna hitam.

i. Uji Molisch

Uji ini ditujukan untuk beberapa KH, tetapi baik juga

digunakan untuk keperluan memperoleh larutan protein murni yang berasal dari glikoprotein.

j. Uji Ninhydrin

Selain oleh protein, hasil positif juga diberikan oleh peptone, asam amino, dan amin primer lainnya, termasuk

amoniak. C C C O O N C C O_ C O C C C O O OH OH ninhidrin

R HC COOH

NH₂

- H2O

-asamamino

R C OH O

senyawa komplek berwarna

k. Uji Biuret

 untuk senyawa yang mengandung dua gugus karbamil

(-CONH₂) yang berikatan secara langsung maupun melalui satu atom nitrogen atau atom karbon.

Protein _ mengandung pasangan gugus CONH.

 Senyawa yang terbentuk di-postulat sebagai berikut :

OH

NH₂ CO.

NH

NH2 CO.

Cu

K

OH

H₂N

HN

K

.OC

H₂N .OC

OH OH

Senyawa yang mirip yang mengandung (menempati gugus –CONH₂) gugus –CSNH₂, -C(NH)NH₂, -CH₂NH_{2 } juga (+)

3. Reaksi pengendapan untuk protein

a. Denaturasi dengan panas dan pH ekstrim

b. Pembentukan endapan dengan logam berat (antara lain: HgCl₂, AgNO₃)

c. Pembentukan endapan dengan reagen bersifat asam (antara lain: asam fosfotungstat, asam pikrat)

d. Endapan dengan ferrosianida

e. Endapan dengan alkohol

R HC C

NH₃+ protein

+ O

O _ AgNO_{3 R} H_{C C}

NH₂

perak proteinat O

O Ag + HNO3

R HC C

NH₃+ protein

+ O

O _ H+- pikrat R HC C +_NH

2

protein pikrat O

OH + H+

X. Analisis Kuantitatif

1. Volumetri

a. Metode Kjeldahl

Yang ditentukan _ kandungan nitrogen, bukan protein

Kandungan protein suatu substansi _ hasilnya dikali dengan faktor kimia untuk meng-konversi nitrogen ke kadar protein. Karena rata-rata kandungan nitrogen dalam protein adalah 16%,

maka 16 mg N₂ setara dengan 100 mg protein: 1 mg N₂ setara dengan 100/16 setara dengan 6,25 mg protein. Contoh perhitungan :

Jika makanan tertentu mengandung nitrogen sebanyak 2%, maka kandungan protein dalam makanan tersebut adalah sama dengan 2 X 6,25, atau = 12,5%.

Karena lain protein lain pula jumlah kandungan nitrogennya, maka faktor perkalian lainnya dapat digunakan untuk

Modifikasi metode Kjeldahl Yang biasa digunakan :

sampel dipanaskan dengan H₂SO₄ pekat, Na₂SO₄ dan

sejumlah kecil CuSO₄. Setelah digestasi berjalan sempurna, nitrogen berada dalam bentuk (NH4)₂SO₄. Ketika NaOH ditambahkan pada residu, H₂SO₄ dinetralkan dan NH₃

dibebaskan. NH₃ ini didestilasi dan dilewatkan dalam suatu larutan standar asam (jumlahnya terukur), dan dari asam yang dinetralkan, sebagaimana biasanya titrasi maka

kelebihan asam dititrasi dengan larutan standar basa. Modifikasi lainnya :

Mengumpulkan amoniak yang dibebaskan ke dalam larutan

asam borat yang mengandung indikator (misalnya campuran bromkresol dan merah metil). Asam borat bereaksi dengan amoniak membentuk amonium borat, karenanya terjadi

pergeseran pH larutan ke arah basa. Dengan menggunakan indikator yang spesifik maka larutan ini dapat dititrasi

b. Titrasi formol untuk alanin

Formaldehid bereaksi dengan gugus amino(-NH₂) membentuk senyawa monometilol dan senyawa dimetilol.

-NH2 + HCHO  -NH(CH2OH)

-NH(CH₂OH) + HCHO _ -N(CH₂OH)₂

Formaldehid tidak bereaksi dengan gugus amino bermuatan (-NH₃+), sehingga efek penambahan formaldehid adalah

menggeser pK gugus amino ke pH lebih rendah. pH titik akhir titrasi asam amino dengan larutan standar NaOH menjadi berkurang sehingga dapat ditetapkan (indikator PP).

2. Spektrofotometri a. Metode Biuret

Larutan protein + reagen Biuret, dicampur dan dihangatkan pada suhu 37 oC selama 10 menit. Kemudian didinginkan

b. Metoda Folin-Lowry

Protein bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteau

membentuk senyawa kompleks berwarna. Pembentukan warna disebabkan karena reaksi alkaline copper dengan protein sebagaimana uji biuret dan reduksi fosfomolibdat oleh tirosin dan triptofan yang terdapat pada protein.

Metode ini umumnya digunakan pada analisis biokimia. c. Serapan pada daerah UV

1). Serapan pada 210 nm. 2). Serapan pada 280 nm.

3. Metoda Pengikatan Zat Warna

Pada kondisi tertentu, gugus-gugus yang bersifat asam dan basa pada makromolekul protein berinteraksi dengan

gugus-gugus pada zat warna organik yang mengalami disosiasi, misalnya radikal asam dari asam sulfonik, membentuk endapan yang berwarna. Fenomena

4. Turbidimetri

Pada turbidimetri, intensitas cahaya yang dilewatkan melalui

larutan turbid diukur vs intensitas cahaya yang melalui larutan murni.

Turbidimetri digunakan sebagai metode untuk menentukan protein sederhana. Jika semua kondisi pengujian adalah

konstan, maka konsentrasi dapat ditentukan hanya dari kurva kalibrasi.

Metoda turbidimetri untuk menetapkan protein dapat digunakan terutama untuk keperluan clinical analysis.