PJ'iWdlIv portonwan dan Prosontasl DmIah FWlDslnnal TBknls Non PWJBJIU,19 DosombBr 2008
-
ISSN :1410·6381PRE PARAS I 99mTc-HUMAN IMMUNOGLOBULIN G YANG AKAN DIGUNAKAN
SEBAGAI PREP ARA T PENA TAH INFEKSI/INFLAMASI
Laksmi A, Widyastuti W, Sri Setyawati, Maskur, Agus A, Gina M. PRR - BAT AN
ABSTRAK
PREP ARASI99mTc - HUMAN IMMUNOGLOBULIN G YG AKAN DIGUNAKAN
SEBAGAI PREP ARA T PENA TAH INFEKSI/INFLAMASI , Telah dilakukan preparasi
99mTc_Human Immunoglobulin G (99mTc_hIgG) yg akan digunakan sebagai penatah
infeksi/inflamasi. Preparasi 99mTc_hIgGini dilakukan dengan melalui beberapa tahapan yaitu:
Reduksi hIgG menggunakan merkaptoetanol dg perbandingan molar hIgG terhadap
merkaptoetanol 1:2000, pemurnian melalui kolom PD-I0, hasil pemurnian diukur serapannya
dengan spektrometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan pelabelan hIgG dengan Tc 99m , yang mana pada pelabelan ini ditambahkan kit MDP sebagai sumber Sn(lI) dan
co-ligand serta larutan perteknetat Tc-99m dari generator Mo-99/Tc-99m. Hasil penandaan
dianalisis dengan kromatografi lapis tipis/kromatografi kertas untuk mengetahui kemumian
radiokimianya. Untuk mengetahui stabilitas sediaan di dalam tubuh dilakukan uji stabilitas
dalam serum manusia selama 1,2 dan 3jam .Hasil analisis dengan kromatografi lapis
tipis/kromatografi kertas diperoleh kemurnian radiokimia 99mTc_hIgGlebih besar 95%. Hasil
pengujian kestabilan dalam serum manusa menunjukkan kemurnian radiokimia masih stabil sampai 3 jam dan dari pengamatan didapatkan hasil reduksi hIgG masih cukup stabil sampai 3 bulan
ABSTRACT
PREP ARA TION OF 99mTc HUMAN IMMUNOGLOBULIN G AS
INFECTION/INFLAMMATION IMAGING AGENT. /Prep~ation of 99mTc -Human
Immunoglobulin G(99mTq_hIgG) and its analysis have been carried out.This preparation
needs several steps, first reducing hIgG using mercaptoetanol with molar ratio 2000:1,
purification using PD-I0 column ( sephadex G-25,Pharmacia), and the reduced hIgG was
labeled with 99mTcand MDP as transchelator. The radiochemical purity of 99mTc_hIgG was analysed using TLC/paper chromatography. The stability in the body was carried out by using fresh human serum after 1 ,2 and 3 hours incubation. the raqiochemical purity of 99mTc_hIgG
analysed with TLC/paper chromatography was higher than 95 %. The stability of labeled
hIgG in fresh human serum was stable after 1 ,2, 3 hours incubation and the reduced hIgG was stable until 3 months
PM. P8rtml11JandaD Prosentasl Umlah FIIDIIsionalToknls Non PIlll8lltl.18 Daswnbor 2006
---PENDAHULUAN
ISSN :1410 - 6381
Radiofarmaka telah menunjukkan manfaat yang nyata dan spesifik dalam pelayanan kesehatan, terutama untuk keperluan diagnosis dan terapi, antara lain penyakit kanker, infeksi / inflamasi dan lain lain.
Akhir akhir ini penelitian/pengembangan mengenai radiofarmaka penyidik infeksi dan
irrt1amasi berkembang dengan pesat, misalnya monoklonal antibodi bertanda, fragmen
antibodi, peptida kemotaktik dan antibiotik bertanda [ 1 ].
Inflamasi jaringan dengan atau tanpa infeksi merupakan gangguan yang bersifat
heterogen dan dapat melibatkan berbagai organ dalam tubuh dengan manifestasi klinik yg
bervariasi. Inflamasi adalah suatu respon yang terjadi pada jaringan yang terluka untuk
membawa molekul dan sel dari sistem imun ke tempat terjadinya kerusakan, sedangkan
infeksi adalah inflamasi yang disertai dengan kontaminasi mikro-organisme [2]. Pada
umumnya diagnosis infeksi tidak sulit terutama apabila sudah terbentuk abses, namun
demikian pada keadaan tertentu diagnosis menjadi sulit seperti pada penderita dengan keluhan, gejala klinik dan dari pemeriksaan fisik ditemukan gambaran yang tidak khas. Pada keadaan
demikian modalitas pencitraan untuk deteksi dan penentuan lokasi inflamasi/infeksi menjadi
suatu hal yang penting dalam klinik, karena dapat memberikan informasi yang penting dalam
pengelolaan penyakit sekaligus dapat memberikan konfirmasi eradikasi infeksi setelah
pemberian antibiotik [3].
Pada saat ini beberapa modalitas diagnostik dapat digunakan untuk deteksi dan
lokalisasi infeksi. Teknik diagnostik tersebut dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok ,
yaitu kelompok yg didasarkan pada perubahan anatomis dan fisiologis. Kelompok yang
didasarkan pada perubahan anatomis misalnya pencitraan menggunakan sinar-x konvensional, USG, CT dan MRI, sedangkan kelompok yang didasarkan pada perubahan fisiologis adalah
p{mcitraan menggunakan teknik kedokteran nuklir. Pada pencitraan menggunakan
radionuklida akan diperoleh informasi berupa perubahan yang terjadi dalam proses
patofisiologi dan patobiokimia pada penderita. Kelebihan pencitraan dengan teknik kedokteran
nuklir dibandingkan dengan pencitraan anatomis adalah, tidak dipengaruhi oleh perubahan
anatomi dan secara rutin dapat dilakukan pada seluruh tubuh tanpa memberikan paparan radiasi tambahan [3].
PCUS_ PortBD\JJ311 dan ProsontaslllmIah FWloslonal Toknls Non POIIODtl.18 DOS8m/Jor 2008
-
ISSN ;1410·5381Penandaan monoklonal antibodi dengan IIlIn diperkenalkan oleh Locker dkk. [4]dan
Rusckowski dkk. [5], tetapi secara umum prosedur penandaan dengan IllIn cukup mmit.
P,;:ncitraan dengan III In lamban sampai 24 jam serta menghasilkan kualitas pencitran yang
sub-optimal[6]. Adanya kelemahan penggunaan IlIIn telah merangsang peneliti untuk
menggunakan 99mTc yang mempakan radionuklida ideal untuk pencitraan menggunakan
kamera gamma. Dibandingan dengan 11IIn, 99mTcmemberikan beberapa keuntungan seperti
paparan radiasi yang diterima penderita relatif lebih rendah, kualitas pencitraan lebih baik dengan pencitraan lebih pendek, serta diagnostik dapat ditegakkan lebih cepat dalam beberapa
jam dengan akurasi cukup tinggi dibandingkan dengan I11In yang memerlukan waktu 24 jam
[7]. Dalam penelitian ini dilaporkan hasil preparasi 99mTc_hIgG beserta uji kemumian
radiokimia uji kestabilan dalam semm manusia yg akan digunakan sebagai preparat penatah
infeksi/inflamasi. Diharapkan penelitian ini dapat menyumbangkan tambahan informasi
dalam pengembangan Radiofarmaka penatah infeksi/inflamasi.
BAHAN DAN TATA KERJA
Bahan dan Peralatan
Bahan yg digunakan ialah SnCh.2H20 (Merck), MDP ( fluka) , kolom PD-IO (
st::phadex G-25 Pharmacia), Merkaptoetanol ( Sigma), hIgG (Sandoz), air demin, air
bidestilasi steril ( IPHA), larutan HCI 0,01 N,larutan PBS O,OIM pH 7,4,gas nitrogen dan lain lain.
Alat yang digunakan ialah peralatan gelas standar, tabung mikro, Syringe dan pipet
eppendorf berbagai ukuran, timbangan , Ph meter, HPLC ( Shimadzu ) dengan kolom SE, Spektrometer UV, peralatan kromatografi kertas/lapis tipis dan lain-lain.
Tata kerja
Reduksi dan pemurnian hIgG.
Sebanyak 500 !1llarutan hIgG yg mengandung 50 mg/ml hIgG direduksi dengan cara
Pr1ls1!11JJJPBl'twnuan dan Prosontasillmlah FWlDSlonaJ Toknls Non PonoIIU,18 Dosombor 2008
iii--~-
ISSN :1410 • 638130 menit dalam suhu kamar, hasil reduksi dilewatkan pada kolom PD-I0 yang telah diaktifkan , kemudian dielusi dengan larutan PBS O,OIM pH 7,4 yang telah dijenuhkan dengan gas
ni.trogen, eluat ditampung tiap Iml yang masing masing fraksi diukur serapannya dengan
spektrometer UV pada panjang gelombang 280 nm, fraksi yang mengandung hIgG dihitung kadarnya dari persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi standar hIgG.
P,mandaan 99mTc_ hIgG
Ke dalam kit MDP (PRR) ditambahkan larutan NaCI fisiologis ( salin ) hingga
volume akhir 5 ml kemudian divortex, kemudian tambahkan sebanyak 3-10 III ke dalam
tabung mikro yang mengandung (10-50) III 5490 ppm larutan hIgG yang telah direduksi
,kemudian tambahkan sebanyak (2-3) mCi larutan 99mTc dari generator Mo99!fc-99m,
diinkubasi dalam suhu kamar selama 30 menit
AJilalisa
Fraksi hIgG yang telah direduksi diidentifikasi dg HPLC menggunakan kolom
'size
exlusion'(SE) BIORAD dengan eluen larutan PBS pH 7 dan detektor UV pada panjang
gelombang 280 nm yang prinsip pemisahannya berdasarkan perbedaan berat molekul untuk
spesi yang berat molekulnya lebih besar akan terelusi lebih awal, hasilnya dibandingkan
dengan hIgG yang belum direduksi, kemurnian radiokimia diuji dengan kromatografi kertas
dengan eluen aseton untuk menentukan %99mTcbebas dan kromatografi lapis tipis dengan
eluen buffer sitrat 0,15 M pH 5,5 untuk menentukan % 99mTc02 , dg demikian kemurnian radiokimia 99mTc- hIgG dapat dihitung. Untuk mengetahui stabilitas sediaan di dalam tubuh
dilakukan uji stabilitas dalam serum manusia dengan cara mereaksikan sediaan yang telah
ditandai dengan 99mTcdengan serum manusia dan PBS , diinkubasi selama 1, 2, 3 jam dan hasilnya dianalisis kromatografi kertas / kromatografi lapis tipis
pros_ PW'tanwan dan Prosontasillmlah FW\lJsJonaI ToknIs NDn PonoDtI, 18 Dosombor 2006 iiii-
--HASIL DAN PEMBAHASAN.
ISSN:14ID - 6381
HasH pengujian dengan HPLC untuk hIgG standar menunjukkan puncak tunggal pada
menit ke 9,017 ditunjukkan pada Gambar 1 dan untuk hIgG hasH reduksi menunjukkan
puncak pada menit ke 16,763 dan 20.417 yang ditunjukkan pada Gambar 2, hal ini
menunjukkan bahwa telah terjadi fragmentasi molekul pada hIgG hasil reduksi atau ikatan disulfida pada antibodi terse but telah tereduksi.
~1,,--,'don'irn_(MNT)
10 II
in
311
Gambar 1. Kromatogram HPLC hIgG standar kolom SE250 BIORAD, eluen buffer phospat pH 7 , detektor UV dengan panjang gelombang 280 nm
10 1$
Gambar 2. Kromatogram HPLC hIgG hasil reduksi kolom SE250 BIORAD, eluen buffer phospat pH 7 , detektor UV dg panjang gelombang 280 nm
ProsldllJJ pcrtumuan dan Prosontaslllrnlah FWloslonai Tokllls Non PonuDtl.18 Dosamllor 2DD8
-
ISSN :1410 . 6381Hasil pengujian kemurnian radiokimia dengan kromatografi kertas untuk 99mTe_hIgG
dapat dilihat pada Tabel 1 . Dad Tabel 1 dapat dilihat untuk nomer pereobaan 1 sid 3
k{:murnian radiokimia di atas 95% hal ini menunjukkan bahwa· baik hasil reduksi hIGg
,metoda analisis maupun metoda penandaan dan komposisi sediaan yang digunakan eukup bagus.untuk selanjutnya dipilih formula pereobaan 3 , karena dengan kandungan hIgG yg lebih keeil kemurnian radiokimianya tidak jauh berbeda hal ini bisa lebih menghemat jumlah hIgG yang dipakai.
Tabel 1. Hasil Analisis Kemurnian Radiokimia dg TLC No. lar 5490 ppmAktivitas I/I/IDTc (%hIgGI/l/nlTc_hIgGlar
reduksi(J!l) MDP mCi) (J!I) 1 50 10 2,47 _.•.. 98,9 2 25 5 2,21 98,8 3 103 2,47 97,8
Hasil uji stabilitas sediaan dalam serum manusia dan dalam PBS dapat dilihat pada
Gambar 3 , dad Gambar 3 ini dapat dilihat bahwa baik dalam serum manusia ataupun dalam
PHS setelah diinkubasi dalam 1 jam, 2 jam maupun 3 jam kemurnian radiokimia sediaan
relatif konstan
I
rata2 diatas 95% , hal ini menunjukkan bahwa sediaan Te-99m hIgG yangdihasilkan eukup stabil dalam dalam tubuh manusia , diharapkan sediaan ini bisa digunakan
prosldlJJJ pertwnuan dan PrDSontasl 11m/aft FWluslonaJ Jokola Non PonoJJtJ.18 DDSombor 2006 _ n 98 97 % Tc-99m 96 hlgG 95 94 9
dim PBS
&Idim serum
ISSN :1410 • 6381
Gambar 3. Uji stabilitas 99mTc_hIgG dalam serum manusia dan dalam PBS
Pengamatan stabilitas hasil reduksi dapat dilihat pada Gambar 4, pengamatan stabilitas hasil reduksi ini sangatlah penting , karena hal ini menyangkut masa kadaluwarsa dari hasil
reduksi , sehingga bisa memperkirakan berapa banyak hIgG yang ingin di reduksi dan kapan
kira-kira reduksi ulang harus kita lakukan lagi sesuai dengan ~~butuhan atau pesanan,
pengujian stabilitas hasil reduksi dilakukan dengan cara melakukan penandaan sediaan
dengan Tc-99m dan di lakukan analisis kemurnian radiokimia dengan kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis, dari Gambar 4 dapat dilihat bahwa dari sampai rentang waktu 3bulan
(01/05/06 sid 03/08/06) hasil kemurnian radiokimia99mTc-hIgG ternyata masih cukup tinggi
yaitu masih di atas 92% hal ini menunjukkan bahwa hasil reduksi hIgG masih cukup stabil sampai rentang waktu 3 bulan.
Pro_ PurtBmuan dan PrllS!lJ!aslllr~IUJIgslonal TBknlsNDnPonoIIt118DOS8IIIII8r2008
-uji stabilitas hlgG hasil reduksl
9910/: 98 97 96 kemurnian 95 radiokimia Tc- 94 99m-lgG 93 92 91 90 89 10/5/2006 7/6/2006 28/06/06 19/07/06 waktu pengujian ISSN :1410 • 6381
Gambar 4. Pegamatan stabilitas hasil reduksi hIgG dalam rentang waktu 3 bulan Reduksi dilakukan pada tanggal 01/05/06
KESIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil kromatogram HPLC dan ditunjang dengan hasil penandaan hIgG dg Tc-99m
dapat dikctahui bahwa reduksi hIgG dengan menggunakan merkaptoetanol dengan
perbandingan moll :2000 dan pemurnian dengan kolom PD-IO (sepadex g-25, Pharmacia) ,
(:ukup berhasil . Hasil penandaan dapat dilihat dari hasil uji kemumian radiokimia yang
mencapai lebih dari 95%, menunjukkan bahwa selain hasil reduksi yg cukup herhasil juga
metode penandaan dan metode analisis cukup baik.Dari uji stabilitas sediaan dalam tubuh
dapat disimpulkan bahwa sediaan ini cukup stabil dalam tubuh manusia. Dari pengamatan
selama kurang lebih 3 bulan dapat disimpulkan hasil reduksi WgG ini masih cukup stabil
sampai rentang waktu 3 bulan. Dari semua hasil analisis dan pengamatan tersebut dapat
diharapkan sediaan 99mTc_hIgG ini bisa digunakan untuk sediaall radiofarmaka penatah
infeksi/inflamasi. Untuk itu perlu dilanjutkan dengan uji biodistribusi dan uji klinis lebih lanjut serta diharapkan pellelitian illi juga dapat mellyumbangkan tambahan illformasi dalam pengembangan Radiofarmaka penatah infeksi/inflamasi.
prosIIIIIJJ portmnuan dan PrusontasllimIaII FWiDSlonaJToknls Non PonOUtl. 18 Dosombor 2006
..
---DAFT AR PUSTAKA
ISSN :1410 - 5381
1. H.J.J.M. RENEN,F.H.M.Corstens, W.J.G.Oyen, et al.,"New concepts infection! inflamation imaging ",QJ Nucl Med 2001,45:167-73.
2. ROITT 1M. Essential immunology. 6th edn. Oxfort: Blackwell Scientifik 1989.
3. A. HUSSEN S KARTAMIHARJA. Peranan Teknik Kedokteran Nuklir dalam Penentuan
fokus Infeksi. Kumpulan Makalah Pertemuan Ilmiah Dwi tahunan PKBNI-PKNI-BATAN, Jakarta, 2002, 103-111.
4. LOCKER JT,Seybold K, Andres RY, et al. Imaging of inflamantory and infectious lession
after injection of radioiodinated monoclonal anti granulocyte antibodies. Nuc/ Med
Commun. 1986;7:659-670.
5. RUSCKOWSKI M, Fitz B, Hnatowich DJ. Lokalization of infection using strepavidin and
biotin; an alternatiive to nonspesific polyclonal immunoglobulin.
J
Nuc/ Med.1992;33: 1810-1815.
6. PALESTRO ,CJ, Weiland FL, Seabold JE et al. Localizing infection with a teclmetium -99m-Iabeled peptide: initial results. Nuc Med Commun 2001; 22(6):695-701.
7. FOGELMAN, 1., Bone scaning in clinical Nuclear Medicine,3d ed, Maisey, Britton and
Coiler Eds, Chapman
&
Hall Medical, London, 1991:147-150.T~mya - Jawab :
1. Penanya : Anna R (PRR - BAT AN)
Pertanyaan
Pada proses pelabelan HigG-TC99m diperlukan Coligand kit MDP sebagai sumber Sn (II).
Apakah Sn (II) hanya dapat diperoleh dari kit MDP saja? Apakah kit MDP hanya sebagai sumber Sn (II) saja atau ada yang lain?
Jawaban : Laksmi A (PRR - BAT AN)
Sebagai sumber Sn bisa dipakai kit pirostan (phirophospat). Selain sebagai sumber Sn kit
MDP dipakai juga sebagai co-ligand/chelator, yaitu untuk mengurangi kemungkinan
terhidrolisisnya Tc-99m menjadi TC02 yang berbentuk koloid yang membuat lambatnya
