IDENTIFIKASI MINYAK ATSIRI DALAM KALUS DAUN LAVENDER (Lavandula officinalis Chaix) DENGAN PERLAKUAN PENAMBAHAN
HORMON NAA PADA MEDIUM MS SECARA IN VITRO IDENTIFICATION OF VOLATILE OIL IN LAVENDER (Lavandula officinalis Chaix) LEAVES CALLUS BY ADDITION OF NAA HORMONE
IN MS MEDIUM BY IN-VITRO METHOD
Ratna Agung Samsumaharto1, Andang Arif Wibawa2, Prapita Sari Wijayanti3 Fakultas Ilmu Kesehatan1, Fakultas Farmasi3
Universitas Setia Budi
ABSTRACT
Tanaman lavender (Lavandula officinalis Chaix) mengandung metabolit sekunder salah satunya yaitu minyak atsiri. Minyak lavender dapat digunakan sebagai antiseptik, anti radang, penolak serangga (repellant dan antifeedent). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh hormon NAA dalam menginduksi kalus daun lavender dan merangsang pembentukan minyak atsiri dalam kalus daun lavender. Percobaan ini dilakukan dengan teknik kultur jaringan tanaman. Bagian tanaman lavender yang digunakan untuk eksplan adalah daun yang masih segar dan sehat. Sterilisasi eksplan dilakukan dengan menggunakan Dithane M-45, Agript, alcohol, dan larutan bayclyn sebagai anti jamur dan desinfektan. Penanaman eksplan pada media MS dengan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh NAA yaitu 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L. Kalus dilakukan pengamatan pertumbuhannya setiap hari dan juga dilakukan evaluasi, selanjutnya dilakukan pemeriksaan kandungan kimia dengan uji kualitatif yaitu uji pendahuluan dengan reaksi warna. Uji penegasan dilakukan dengan KLT menggunakan fase gerak hesana-etil asetat (96:4) dan fase diam silika gel GF254 dan diamati bercak dengan disemprot anisaldehid-H2SO4,serta menghitung Rf-nya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa zat pengatur tumbuh NAA dengan konsentrasi yang berbeda berpengaruh dalam keberhasilan pembentukan kalus, mempercepat waktu induksi kalus dan berat kalus daun lavender. Penambahan zat pengatur tumbuh NAA 2,0 mg/l mempunyai keberhasilan pembentukan kalus 86,67%, waktu induksi kalus tercepat 5,69 hari dan rata-rata berat kalus kering terbesar 0,070 gram. Kalus hasil kultur jaringan dengan penambahan zat pengatur tumbuh NAA mengandung komponen minyak atsiri yang sama dengan tanaman asal.
Kata kunci: NAA, kalus daun lavender, minyak atsiri ABSTRACT
Lavender (Lavandula officinalis Chaix) plant contains secondary metabolite such as volatile oil. Lavender oil can be used as antiseptic, anti-inflammation, repellant and antifeedant. The experiment was aimed to know the influence of NAA hormone in inducing lavender leaves callus and stimulating volatile oil in lavender leaf callus. The experiment was done by plant tissue culture technique. The part of lavender plant that used to explant was fresh and healthy leaves. Explant sterilization was done using Dithane M-45, Agript, alcohol, and bayclin solution as antifungal and disinfectant. Explant cultivation in MS media with various NAA plant growth regulator
concentrations, i.e. 1.0 mg/L, 2.0 mg/L, 3.0 mg/L. The callus growth was observed everyday and also evaluated, and then the chemical content was analyzed by qualitative test i.e. introduction and color test. Confirmation test was done by TLC using mobile phase hexane-ethyl acetate (96:4) and stationary phase Silica Gel GF254 and the spot was observed by anise aldehyde-H2SO4 spray, and the Rf was calculated. The result of the experiment showed that NAA plant growth regulator with difference concentrations affected callus formation 86.67%, the fastest callus induction time 5.69 days, and the biggest average weight of dry callus 0.070 gram. The callus obtained from tissue culture with addition of NAA plant growth regulator
contained volatile oil component the same as mother plant. Keywords: NAA, lavender leaves callus, volatile oil.
PENDAHULUAN
Indonesia adalah salah satu negara yang memiliki keanekaragaman hayati, terutama dalam sumber daya hutan tropisnya yang sebagian besar berkhasiat sebagai bahan obat alam dan obat tradisional (Supriyadi 2001). Tumbuh-tumbuhan mempunyai peranan yang sangat besar dalam bidang kesehatan karena tumbuhan dapat memproduksi zat-zat kimia yang mempunyai kegunaan potensial dalam pengobatan. Data menyebutkan ada 50% dari obat-obat yang beredar di negara industri berasal dari tanaman (Indrayanto dan Rahman 1990).
Tanaman obat banyak digunakan, baik di bidang kosmetik maupun obat-obatan. Tanaman obat masih tetap dipelajari tidak hanya tradisi, tetapi terutama nilainya di bidang farmasi. Tanaman yang bermanfaat dalam pengobatan tradisional kemudian diteliti secara ilmiah untuk dibuktikan aktifitas teraupeutiknya, setelah terbukti berkhasiat kemudian dikembangkan menjadi suatu bentuk sediaan obat (Heyne 1987). Kurang lebih ada 30 bahan obat-obatan yang merupakan produk metabolit sekunder dari tanaman, bermanfaat dalam dunia kedokteran modern. Hampir 1500 senyawa baru yang tiap tahun diisolasi dari tanamam, 20% diantaranya mempunyai aktifitas biologis tertentu (Indrayanto 1987).
Kebanyakan produk metabolit sekunder diisolasi dari tanaman, namun banyak keterbatasan dari sumber bahan baku sehingga dipilih teknik kultur sebagai perbanyakan tanaman. Teknik kultur jaringan tanaman dalam bidang farmasi memiliki manfaat yang besar, karena dapat menghasilkan metabolit sekunder untuk upaya pembuatan obat-obatan yaitu dengan memisahkan unsur-unsur yang terdapat dalam kalus maupun protokormus misalnya alkaloid, steroid, dan terpenoid (Hendaryono dan Wijayani 1994).
Metabolit sekunder merupakan salah satu hasil dari metabolisme tanaman dimana dalam teknik kultur jaringan, metabolit sekunder juga dihasilkan. Kultur jaringan tanaman hanya mengambil jaringan yang cukup kecil dan mengembangkannya di atas media yang sesuai dalam waktu relatif singkat tanpa memerlukan area atau tanam yang cukup luas (Suryowinoto 1985). Produksi senyawa metabolit sekunder dengan teknik kultur jaringan tanaman sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor dalam tempat tumbuh (Nugroho dan Sugito 2004). Keberhasilan kultur jaringan tanaman sangat ditentukan oleh komposisi media. Sebuah media harus memenuhi sifat-sifat fisika kimia yang diperlukan untuk pertumbuhan sel atau jaringan seperti pH, selain itu juga tergantung dari umur tanaman, ukuran eksplan, jenis tanaman (Wetter dan Constabel 1991).
Syarat minimal dalam pembuatan kultur jaringan tanaman adalah menyediakan media yang sesuai baik komposisi maupun kadar untuk makro dan
mikro, gula, vitamin, senyawa organik dan asam amino. Eksplan akan tumbuh lebih baik apabila dirangsang dengat zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh merupakan suatu senyawa yang sangat penting dalam pertumbuhan tanaman (Tabata 1977). Penambahan zat pengatur tumbuh berupa hormon sitokinin seperti kinetin dan Furfuril Amino Purin (FAP) kadang dibutuhkan bersama-sama auksin seperti 2,4- Dichlorophenoxy Acetic Acid (2,4-D) atau Naphthalene Acetic Acid (NAA) untuk mendapatkan pembentukan kalus yang baik (Abidin 1989). Pembentukan dan pertumbuhan kalus yang baik dapat diperoleh dengan cara penambahan zat pengatur tumbuh dengan perbandingan yang sesuai dan tepat dari zat-zat tersebut (Hendaryono dan Wijayani 1994).
Tanaman lavender (Lavandula officinalis Chaix) merupakan tanaman dari keluarga Lamiaceae. Lavender tumbuh baik di daerah dengan ketinggian 500–1.300 m dpl. Semakin tinggi tempat tumbuhnya, semakin tinggi juga mutu minyaknya. Indonesia tidak mengusahakan lavender secara intensif, bahkan merupakan pengimpor minyak tersebut untuk bahan kosmetika, pewangi, sabun, dan parfum. Tanaman ini tidak gampang ditemukan di Indonesia karena tidak dibudidayakan secara intensif dan hanya tumbuh liar di beberapa tempat. Lavender hanya dijual secara terbatas oleh beberapa pedagang tanaman hias. Bagian daun dan bunga lavender mengandung metabolit sekunder dan dapat digunakan sebagai tanaman obat maupun bahan kosmetik. Di dalam daun dan bunga tanaman lavender terdapat kandungan minyak atsiri, tanin, kumarin, flavonoid (Kardinan 2007).
Berdasarkan dari kenyataan tersebut diatas maka dilakukan suatu penelitian mengenai pemeriksaan minyak atsiri pada kalus daun lavender (Lavandula officinalis Chaix) dengan penambahan hormon NAA pada medium MS yang bervariasi konsentrasinya.
METODE PENELITIAN Bahan :
Bahan tanaman.
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman lavender yang diperoleh dari daerah Kaliurang, Yogyakarta. Bagian tanaman yang digunakan adalah daun dari tanaman lavender.
Bahan kimia untuk media kultur.
Bahan kimia yang digunakan adalah Murashige Skoog dan zat pengatur tumbuh NAA.
Bahan kimia untuk sterilisasi.
Bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi yaitu Bayclin 30% dan 15%, sabun cair, Dithane M45® (3%), Agript 1%, alkohol 70%, Tween 80, aquadest steril, dan spirtus.
Bahan kimia untuk analisis.
Bahan kimia yang digunakan untuk analisis minyak atsiri secara KLT adalah kalus lavender, petrolium eter, plat silika gel GF254, anisaldehid- H2SO4.
Alat:
Alat untuk kultur jaringan.
Autoklaf untuk sterilisasi media dengan suhu 121°C tekanan 1 atmosfer selama 15 menit dan untuk sterilisasi alat, gelas ukur, erlenmeyer, gelas piala, botol kultur, cawan petri, karet gelang, aluminium foil, skalpel selama 30 menit. LAF digunakan untuk menanam eksplan pada media kultur, ruang inkubasi dengan kondisi suhu 25-28 °C.
Alat penunjang lain.
Alat untuk mengukur pH media adalah pH stick, bahan kimia ditimbang dengan timbangan analitik, lemari pendingin, pembakar spiritus.
Alat untuk analisa kualitatif.
Tabung reaksi, pipa kapiler, bejana elusi, lampu UV 254nm dan 366nm, corong, kertas saring, gelas ukur, dan kertas KLT.
Cara Kerja:
Determinasi tanaman
Tahap awal pada penelitian ini adalah dengan menetapkan kebenaran sampel daun lavender (Lavandula officinalis Chaix) berkaitan dengan ciri morfologi yang ada pada tanaman tersebut dan dibuktikan B2P2TO2T.
Pengambilan bahan
Tanaman lavender (Lavandula officinalis Chaix) yang digunakan sebagai eksplan diambil pada bulan Januari 2009 dari daerah Kaliurang, Yogyakarta dengan kriteria daun sehat, segar dan masih muda.
Pembuatan media
Bahan yang digunakan sebagai medium Murashige Skoog (MS) disiapkan terlebih dahulu meliputi makronutrien, mikronutrien, sukrosa, sumber besi, vitamin, dan mio-inositol. Semua bahan tersebut di atas dimasukkan satu per satu ke dalam beaker glass volume 1 liter kecuali agar, kemudian aquades ditambahkan sampai 400 ml. Setelah itu larutan 400 ml dibagi menjadi empat sehingga tiap bagian terdapat 100 ml, kemudian dimasukkan dalam beaker glass 250 ml. Setelah itu ditambahkan zat pengatur tumbuh NAA dengan konsentrasi 0,0 mg/l; 1,0 mg/l; 2,0 mg/l; dan 3,0 mg/l, ke dalam masing-masing bagian tersebut dan selanjutnya ditambahkan aquadest mendekati 150 ml. Campuran tersebut kemudian diaduk sampai homogen. Langkah selanjutnya pH diukur dengan menggunakan alat pH meter dan dibuat pH larutan berkisar antara 5,6-5,8 dengan panambahan KOH 10% jika terlalu asam dan HCl 1% jika terlalu basa. Jika harga pH telah sesuai, tambahkan aquadest sampai 150 ml, kemudian agar-agar yang telah ditimbang sebanyak 1,2 gram dimasukkan ke dalam masing- masing konsentrasi hormon NAA, kemudian dipanaskan di hot plate dan diaduk dengan pengaduk magnetik sampai larutan mendidih dan jernih. Skema pembuatan dan bahan yang ditambahkan dapat dilihat pada lampiran 5 dan 6. Larutan media ini dibagi-bagi dalam botol kultur, ditutup rapat dengan tutup karet yang tengahnya diberi kapas dan ditutup dengan alumunium foil, kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 ºC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit.
Sterilisasi alat dan media.
Semua alat dari logam dan gelas yang digunakan untuk pelaksanaan kultur dicuci dengan sabun sampai bersih lalu dikeringkan dan dibungkus, selanjutnya semua alat disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 1 atm selama 30 menit dan 15 menit untuk sterilisasi medium.
Sterilisasi Laminar Air Flow (LAF)
Sebelum LAF digunakan di dalamnya dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 90% kemudian peralatan yang akan digunakan di masukkan yaitu cawan petri, skapel, pinset, media, alkohol 70%, aquadest steril. LAF ditutup dan di beri kain hitam. LAF lalu dinyalakan lampu UV ± 45 menit.
Sterilisasi daun dan eksplan.
Daun lavender (Lavandula officinalis Chaix) yang diambil dalam keadaan segar dicuci dengan air mengalir sampai bersih, dipotong bagian pinggir-pinggirnya dan direndam dalam deterjen selama 5 menit, setelah itu dicuci dengan aquadest kemudian direndam dalam larutan fungisida (Dithane-M45® 3% + 3 tetes tween 80) sambil digojog-gojog selama 30 menit, dibilas dengan aquadest sampai bersih lalu eksplan direndam dalam larutan Agript 1% + 3 tetes tween 80 sambil digojog-gojog selama 10 menit, dibilas dengan aquadest sampai bersih. Eksplan direndam larutan Bayclin® 15% + 3 tetes tween 80 selama 2 menit kemudian direndam dengan larutan Bayclin® 30% + 3 tetes tween 80 selama 2 menit, lalu dibilas aquadest steril 1 kali. Sterilisasi dilanjutkan dengan alkohol 70% selama 1 menit, lalu dibilas aquadest steril sebanyak 3 kali. Eksplan siap digunakan untuk ditanam pada media kultur.
Penanaman eksplan.
Alat yang digunakan untuk penanaman disiapkan terlebih dahulu yaitu: skapel, pinset, dan cawan petri. Semua alat, aquadest, dan medium dimasukkan dalam LAF (Laminair Air Flow) yang telah disterilkan kemudian lampu spiritus dinyalakan. Eksplan daun lavender dipotong dengan ukuran 1x1 cm dengan menggunakan skapel steril, kemudian eksplan ditanam dalam media dengan bantuan pinset dengan posisi eksplan bersentuhan dengan permukaan dan sebelum botol ditutup mulut botol difiksasi terlebih dahulu serta penggunaan semua alat sebelum digunakan harus difiksasi terlebih dahulu untuk menghindari terjadinya kontaminasi. Kultur dipelihara dalam ruang inkubasi pada suhu kamar dan dilengkapi dengan lampu neon 20 watt yang berjarak 20-60 cm di atas permukaan botol eksplan. Prosentase keberhasilan.
Prosentase keberhasilan dilakukan dengan menghitung jumlah eksplan yang berhasil membentuk kalus dibagi dengan jumlah seluruh eksplan yang ditanam dikalikan 100%.
Waktu eksplan membentuk kalus.
Untuk mengetahui eksplan membentuk kalus dilakukan dengan cara mencatat pada hari keberapa setiap eksplan yang dikulturkan dapat membentuk kalus.
Berat kalus.
Untuk mengetahui berat rata-rata kalus dilakukan dengan cara menimbang total kalus dibagi dengan jumlah botol yang tumbuh kalus.
Pembuatan ekstrak kalus dan daun lavender.
Daun lavender dan kalus lavender yang telah dipanen dikeringkan dengan dioven pada suhu 40ºC. Kalus dan daun yang kering, dibuat serbuk kemudian ditimbang masing-masing 0,3 gram dan dimaserasi 5 hari dengan petroleum eter 3 ml. Hasil maserasi dibiarkan menguap.
Uji pendahuluan.
Reaksi identifikasi minyak atsiri daun lavender adalah beberapa tetes minyak atsiri ditambah beberapa tetes pereaksi Sudan III akan berwarna merah sendunduk. Kromatografi Lapis Tipis.
Analisa Kromatografi Lapis Tipis dengan menggunakan silika gel GF254 sebagai fase diam dan fase geraknya Heksana-Etil asetat(96:4) dengan metode pengembangan. Bercak diamati dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366nm. Pereaksi yang digunakan untuk penyemprotan adalah anisaldehid–H2SO4 kemudian dipanaskan dalam oven dengan suhu 100°C selama ± 5 menit dan dihitung nilai hRf masing-masing bercak yang diperoleh, dengan menggunakan rumus:
100 pengembang ditempuh yang Jarak awal titik dari bercak pusat titik Jarak hRf= ×
HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Determinasi tanaman lavender
Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan kebenaran bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah Lavandula officinalis Chaix. Determinasi tanaman dilakukan di B2P2TO2T Tawangmangu menggunakan buku acuan C.A. Backer dan diperoleh:
1b – 2b – 3b – 4b – 12b – 13b – 14b – 17b – 18b – 19b – 20b – 21b – 22b – 23b – 24b – 25b – 26b – 27a – 28b – 29b – 30b – 31b – 403b – 404b – 405a – 406b - 409a – 410b – 411b ______ 190. Lamiatae
1a – 2b – 3a – 4c – 5b – 7b – 8c – 11a – 12a – 13a – 14a _______ 7. Lavandula 1 ______________________ Lavandula officinalis Chaix
2. Deskripsi tanaman lavender
Habitus; Semak, semusim, tinggi mencapai ± 1m. Batang; tegak dan mendatar, bulat, berbuku-buku, permukaan berbulu, putih. Daun; tunggal berhadapan, tangkai pipih, berbulu, panjang 0,5-1 cm, hijau, helaian bulat telur memanjang, ujung runcing, pangkal membulat, tepi bergerigi, pertulangan menyirip, permukaan berbulu, panjang 3-5, berbulu, di ujung cabang atau batang, panjang ibu tangkai 10-20 mm, permukaan berbulu, putih keunguan, tangkai bunga pendek ± 0,3 cm, ungu, kelopak berlekatan, bentuk corong, berlekuk menjadi dua, ujung runcing, panjang 0,5-0,7 cm, putih keunguan, berbulu ungu, mahkota bentuk bibir,panjang 1,2-1,5 cm, ungu muda, benang sari dua tangkai, berlekatan, melekat pada mahkota, panjang 9-10 mm, putih keunguan, kepala sari putih keunguan, putik 1,
panjang ± 1,5 cm, tangkai putih, kepala putik bercabang dua, berbulu, ungu. Buah; jarang ditemukan. Biji; jarang ditemukan. Akar; tunggang, putih kotor.
3. Pengambilan bahan tanaman lavender
Daun yang diambil yang masih muda, tidak terlalu tua, segar, dan pertumbuhan yang sehat. Hal ini dimaksudkan agar diperoleh hasil tanaman kultur dengan baik dan optimal. Daun yang digunakan jika terlalu muda maka pada proses sterilisasi dengan zat kimia akan mudah rusak sedangkan jika terlalu tua maka pada daun telah terjadi penumpukan polifenol yang dapat mengakibatkan kalus berwarna coklat. Pada penelitian ini bagian tanaman yang digunakan adalah daun.
4. Pembuatan medium Murashige Skoog (MS)
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah Murashige Skoog. Murashige Skoog adalah media yang umum dan sering digunakan untuk kultur jaringan karena daapat digunakan untuk berbagai jenis tanaman dan konsentrasi garam-garam mineral di dalam medium ini yang tinggi sehingga dapat memenuhi kebutuhan pertumbuhan sel (Hendaryono dan Wijayani 1994). Keberhasilan menumbuhkan kalus juga dipengaruhi oleh zat pengatur tumbuh dengan konsentrasi yang cocok sehingga dapat memenuhi kebutuhan untuk pertumbuhan sel tanaman yang dikultur. Bahan-bahan yang digunakan pada media MS meliputi makronutrien, mikronutrien, sumber besi, vitamin, mio inositol, sukrosa dan agar (Hendaryono dan Wijayani 1994). Komposisi media dapat dilihat pada lampiran 3. Pembuatan media pH larutan berkisar antara 5,7-5.8 dikarenakan pH menentukan kelarutan ketersediaan ion-ion, mineral, dan juga sifat gel (George dan Sherrington 1984). Media tidak dapat memadat jika pH terlalu asam, sebaliknya jika pH terlalu basa maka beberapa garam dalam media akan mengendap sehingga nutrisi yang dibutuhkan eksplan tidak terpenuhi dan dikhawatirkan pertumbuhan tidak optimal. Hasil pembuatan media pada penelitian ini, media yang diperoleh berbentuk setengah padat dan tidak terdapat kontaminan setelah diinkubasi, sehingga dapat digunakan untuk penanaman eksplan daun lavender.
Tabel 2. Pembuatan media MS dengan penambahan hormon NAA
Konsentrasi NAA dalam media MS (mg/L) Volume total media MS (ml) Volume media MS tiap botol (ml) Jumlah botol 0,0 1,0 2,0 3,0 150 150 150 150 ±15 ±15 ±15 ±15 15 15 15 15
5. Sterilisasi alat, ruang, dan media
Alat-alat yang akan digunakan untuk kultur jaringan, setelah dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121º C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media yang digunakan dalam kultur dsterilkan dengan autoklaf pada suhu 121º C, tekanan 1 atm selama 30 menit. Sterilisasi perlu dilakukan untuk mencegah adanya kontaminasi dalam medium yang dapat mengganggu pelaksanaan kultur jaringan. Ruangan kerja untuk pekerjaan steril menggunakan LAF (Laminar Air Flow) sebab LAF dapat membuat udara yang melintasi kawasan kerja menjadi steril karena udara steril ditiupkan
secara kontinyu melewati tempat kerja yang sebelumnya udara tersebut telah disaring melalui prefilter dan ultrafilter sehingga bebas dari bakteri dan spora.
6. Sterilisasi daun lavender.
Eksplan yang diperoleh dari bahan merupakan sumber kontaminan paling potensial. Larutan yang dapat digunakan untuk sterilisasi permukaan eksplan ada macam-macam, tetapi konsentrasi dan waktu sterilisasi harus diperhatikan agar diperoleh hasil sterilisasi optimal. Kondisi yang steril dapat mendukung keberhasilan dalam kultur jaringan.
Tabel 3. Sterilisasi eksplan daun lavender
Larutan sterilisasi Kadar Waktu
Deterjen anti bakteri
Dithane M-45® + 3 tetes Tween Agript + 3 tetes Tween
Bayclin® + 3 tetes Tween 80 Bayclin® + 3 tetes Tween 80 Alkohol - 3% 1% 15% 30% 70% 5 menit 30 menit 5 menit 2 menit 2 menit 1 menit
Tabel 3 menunjukkan kombinasi zat kimia secara bertingkat tersebut sudah memberikan hasil cukup baik yaitu mengurangi kontaminasi pada eksplan. Waktu dan besarnya konsentrasi zat kimia tersebut berpengaruh pada pertumbuhan kalus. Langkah awal dari sterilisasi suatu eksplan yaitu terlebih dahulu dicuci dengan air mengalir kemudian di cuci detergen selama 5 menit. Perendaman menggunakan Dithane M-45® bertujuan untuk mematikan jamur yang menempel pada permukaan daun karena dithane merupakan antifungi sedangkan Agript merupakan antibakteri. Bayclin® digunakan sebagai desinfektan. Penggunaan Tween 80 dimaksudkan sebagai wetting agent yaitu sebagai pembasah yang dapat menembus jaringan daun. Alkohol 70% sebagai antibakteri. Pengocokan yang terlalu lama dan konsentrasi desinfektan yang tinggi dapat menyebabkan kerusakan jaringan, sedangkan sterilisasi eksplan dalam waktu yang singkat dan konsentrasi yang rendah juga dapat menyebabkan mikroba yang terdapat dalam eksplan belum mati. Sisa-sisa sterilan yang menempel pada eksplan perlu dibilas sebanyak 3 kali dengan aquadest steril.
7. Penanaman eksplan.
Eksplan yang telah disterilkan selanjutnya dipotong sesuai dengan ukuran yang diperlukan yaitu jangan terlalu besar dan kecil sekitar 1 cm, karena jika lebih besar maka bahaya kontaminan pada jaringan lebih besar sebab akan bersentuhan dengan mulut botol kultur, tetapi jika lebih kecil maka pertumbuhannya tidak secepat eksplan yang lebih besar. Penanaman eksplan harus dilakukan dengan hati-hati secara aseptik untuk mencegah kontaminasi. Botol-botol yang telah ditanami kemudian diinkubasi dalam ruang inkubasi dengan penyinaran lampu neon 20. Eksplan yang tidak terkontaminasi akan memperlihatkan gejala-gejala timbulnya tonjolan-tonjolan di daerah irisan. Jika media pecah maka dilakukan subkultur, subkultur ini penting dilakukan karena nutrisi yang ada dalam media tumbuh lama-kelamaan akan habis sehingga media akhirnya pecah dan menyebabkan kalus menjadi coklat dan mati.
8. Keberhasilan pertumbuhan kalus
Penentuan prosentase keberhasilan pertumbuhan kalus dilakukan dengan menghitung jumlah eksplan yang berhasil membentuk kalus dibagi jumlah keseluruhan eksplan yang ditanam dikalikan 100%. Prosentase keberhasilan kalus terlihat pada tabel 4.
Tabel 4. Keberhasilan eksplan membentuk kalus
Konsentrasi hormon NAA dalam media MS (mg/L) Jumlah botol Jumlah eksplan membentuk kalus Keberhasilan (%) 0,0 15 0 0 1,0 15 9 60 2,0 15 13 86,67 3,0 15 12 80
Tabel 4 memperlihatkan keberhasilan eksplan membentuk kalus untuk masing-masing konsentrasi zat pengatur tumbuh. Hasil penelitian didapatkan bahwa pertumbuhan eksplan dengan penambahan zat pengatur tumbuh NAA 2,0 mg/L dapat mencapai prosentase keberhasilan 86,67% serta grafiknya dapat dilihat pada gambar 2. Kebutuhan zat pengatur tumbuh yang optimal pada kalus daun lavender pada konsentrasi 2 ppm. Pembentukan kalus pada konsentrasi hormon 1 ppm menunjukkan prosentase 60%, hal ini pada konsentrasi 1 ppm kurang mampu merangsang pembelahan sel daun. Keadaan dari daun yang diambil juga dapat mempengaruhi pertumbuhan kalus, daun yang diambil terlalu tua maka proses pembelahan lambat (Hendaryono dan Wijayani 1994). Penambahan zat pengatur tumbuh NAA 0,0 ppm tidak dapat menumbuhkan kalus karena pertumbuhan kalus diperlukan zat pengatur tumbuh untuk melengkapi nutrisi pada media dasar. Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) di dalam tubuh tanaman terdapat hormon tumbuh yang jumlahnya sedikit dan dapat merangsang ataupun menghambat proses fisiologi tanaman.
0 20 40 60 80 100 1 2 3
Konsentrasi hormon NAA (mg/l)
K e b e rhas ila n per tu m b u han ka lu s ( % )
NAA 1 ppm NAA 2 ppm NAA 3 ppm
Gambar 3. Pertumbuhan kalus Lavender dengan perlakuan hormon NAA
9. Waktu induksi eksplan membentuk kalus
Waktu induksi kalus pada media dengan penambahan zat pengatur tumbuh maupun tanpa penambahan zat pengatur tumbuh berbeda-beda. Pertumbuhan kalus dapat dilihat mulai timbulnya tonjolan-tonjolan berwarna putih kehijauan pada bekas irisan. Zat pengatur tumbuh NAA akan berinteraksi dengan hormon internal dari eksplan sehingga hasil interaksinya dapat memberikan respon pertumbuhan kalus. Pengaruh penambahan hormon NAA terhadap waktu induksi kalus daun lavender seperti yang terlihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Pengaruh pemberian zat pengatur NAA terhadap waktu induksi kalus daun lavender Konsentrasi hormon NAA
dalam media MS (mg/ L)
Rata-rata waktu induksi kalus (hari) 0,0 - 1,0 9,56 2,0 5,69 3,0 6
0 2 4 6 8 10 12 1 2 3
Kons entras i hormon NAA (mg/l)
R a ta -r at a w a k tu in d u k s i k a lu s (h ari )
Gambar 3. Rata-rata waktu induksi kalus daun lavender
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa induksi kalus setiap konsentrasi berbeda-beda. Konsentrasi NAA 2 ppm menghasilkan waktu induksi yang tercepat. Pembentukan kalus paling lambat 9,56 hari, dengan perlakuan zat pengatur tumbuh 1 ppm. Keterlambatan pertumbuhan kalus dipengaruhi oleh konsentrasi zat pengatur tumbuh yang tidak cocok sehingga dapat menghambat pertumbuhan eksplan. Jika konsentrasi zat pengatur tumbuh yang ditambahkan sesuai dengan kebutuhan eksplan maka zat pengatur tumbuh dapat bersifat sebagai penginduksi pertumbuhan, dan sebaliknya jika zat pengatur tumbuh yang ditambahkan tidak sesuai maka zat pengatur tumbuh dapat bersifat sebagai inhibitor. Pengambilan eksplan secara acak menyebabkan adanya perbedaan fisiologi tumbuhan yang mempunyai kemampuan pembelahan berbeda sehingga dapat menimbulkan perbedaan waktu induksi kalus.
10. Hasil rata-rata berat kalus
Kalus yang sudah tumbuh dengan baik dan optimal dikumpulkan kemudian ditimbang.
Tabel 6. Rata-rata berat kalus daun lavender
NAA (mg/l) Jumlah botol Berat kalus basah (gram) Rata-rata berat kalus basah (gram) Berat kalus kering (gram) Rata-rata berat kalus kering (gram) 0,0 - - - - - 1,0 9 4,464 0,496 0,409 0,045 2,0 13 9,972 0,767 0,906 0,070 3,0 12 8,102 0,675 0,797 0,066 Keterangan :
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
1
2
3
Konsentrasi hormon NAA (mg/l)
R a ta -r at a ber at kal u s Rata-rata berat kalus basah Rata-rata berat kalus kering
Gambar 4.Diagram hubungan kadar hormon NAA dengan berat kalus
Tabel 6 memperlihatkan berat kalus yang paling besar dengan pemberian zat pengatur tumbuh NAA dengan konsentrasi 2 ppm, jadi hormon NAA konsentrasi 2 ppm lebih cocok dibandingkan dengan hormon NAA konsentrasi 1 ppm dan 3 ppm.
11. Hasil pembuatan ekstrak kalus lavender
Hasil setelah dimaserasi selama 5 hari dan kemudian disaring berupa ekstrak cair, yang selanjutnya diuapkan di atas penangas air sehingga didapatkan ekstrak kental yang digunakan untuk analisa kualitatif. Eksplan tanpa penambahan hormon NAA tidak dilakukan analisa kualitatif karena tidak membentuk kalus. Ekstrak dari tanaman asal digunakan untuk pembanding.
12. Hasil uji reaksi warna
Hasil identifikasi minyak atsiri pada kalus lavender dengan reaksi warna seperti pada Tabel 7.
Tabel 7. Hasil identifikasi senyawa minyak atsiri pada tanaman asal dan kalus lavender
Test Sampel Pustaka
Robinson 1995 Hasil Interpretasi
Uji reaksi warna 3 tetes ekstrak + beberapa tetes sudan III LP, didiamkan beberapa saat. TA A B C Merah Merah Merah Merah Merah sendunduk Merah sendunduk Merah sendunduk Merah sendunduk Minyak atsiri Minyak atsiri Minyak atsiri Minyak atsiri Keterangan: TA = Tanaman Asal
A = Ekstrak kalus daun lavender konsentrasi hormon NAA 1,0 mg/l B = Ekstrak kalus daun lavender konsentrasi hormon NAA 2,0 mg/l C = Ekstrakkalus daun lavender konsentrasi hormon NAA 3,0 mg/l
13. Hasil uji kromatografi lapis tipis
Uji penegasan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan fase diam silika gel GF254 dengan fase gerak heksana : etil asetat dengan perbandingan (96 : 4). Hasil uji penegasan dengan menggunakan KLT pada semua kalus yang ditumbuhkan pada berbagai konsentrasi NAA, sedangkan kalus tanpa penambahan hormon tidak diuji karena tidak terbentuk kalus dan tanaman asal juga diuji sebagai pembanding.
TA A B C
Gambar 5. Kromatografi lapis tipis senyawa minyak atsiri pada fase diam silika gel GF254 dan fase gerak heksana : etil asetat (96 : 4) dengan perekasi semprot anisaldehid – H2SO4
Keterangan:
TA = Tanaman Asal
A = Ekstrak kalus daun lavender konsentrasi hormon NAA 1,0 mg/l B = Ekstrak kalus daun lavender konsentrasi hormon NAA 2,0 mg/l C = Ekstrak kalus daun lavender konsentrasi hormon NAA 3,0 mg/l
Tabel 8. Nilai Rf dan warna bercak di bawah UV 254 nm ,UV366 nm, dan perekasi semprot anisaldehid – H2SO4 Sampel hRf Warna bercak Interpretasi UV 254 nm UV 366nm anisaldehid-H2SO4 TA 1. 11,25 2. 21,25 - - - - Ungu Komponen minyak atsiri
A 1. 11,25 2. 22,50 - - - - Ungu Komponen minyak atsiri
B 1. 11,75 2. 21,25 - - - - Ungu Komponen minyak atsiri
Keterangan:
TA = Tanaman Asal
A = Ekstrak kalus daun lavender konsentrasi hormon NAA 1,0 mg/l B = Ekstrak kalus daun lavender konsentrasi hormon NAA 2,0 mg/l C = Ekstrak kalus daun lavender konsentrasi hormon NAA 3,0 mg/l
Hasil uji penegasan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fase gerak heksana:etil asetat dengan perbandingan (96 : 4) dengan fase diam silika gel GF254 yang kemudian diamati pada UV 254 nm tidak meredam fluoresensi, sedangkan pada UV 366 nm tidak berfluoresensi, dan setelah disemprot dengan pereaksi anisaldehid-H2SO4 terlihat bercak berwarna ungu. Hal ini menunjukkan bahwa kalus daun lavender mengandung komponen-komponen minyak atsiri.
Komponen minyak atsiri pada kalus daun lavender sama seperti pada tanaman asal. Hal ini dapat terlihat dari warna dan nilai hRf bercak yang muncul sama. Jadi, dalam penelitian ini dapat disimpulkan bahwa kalus daun lavender mengandung minyak atsiri seperti pada tanaman asal.
KESIMPULAN
Berdasarkan dari hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:
Pertama, pemberian zat pengatur tumbuh NAA dengan konsentrasi yang berbeda berpengaruh dalam keberhasilan pembentukan kalus, mempercepat waktu induksi kalus dan berat kalus daun lavender (Lavandula officinalis Chaix). Penambahan zat pengatur tumbuh NAA 2,0 mg/l mempunyai keberhasilan pembentukan kalus 86,67%, waktu induksi kalus tercepat 5,69 hari dan rata-rata berat kalus kering terbesar 0,070 gram.
Kedua, kalus hasil kultur jaringan dengan penambahan zat pengatur tumbuh NAA mengandung senyawa komponen minyak atsiri yang sama dengan tanaman asal.
DAFTAR PUSTAKA
Abidin Z. 1989. Dasar-dasar Pengetahuan tentang Zat Pengatur Tumbuh. Bandung: Angkasa. Hal 1-3
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Ed ke-2. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods.Hal 127-135
Hendaryono D, Wijayani A. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius. Hal 118
Indrayanto G. 1987. Produksi Metabolit Sekunder dengan Teknik Kultur Jaringan Tanaman, Seminar Nasional, Pusat Antar Universitas, Yogyakarta: Universitas Gajah Mada. Hlm 9-11.
Indrayanto G, Rahman A. 1990. Prospek bioteknologi sel tanaman untuk produksi bahan obat nabati secara In Vitro. Medika JurnalKedokteran dan Farmasi. Hal 45
Kardinan A. 2007. Tanaman Pengusir dan Pembasmi Nyamuk. Cetakan ke-8. Jakarta Selatan: Penerbit PT Agromedia. Hal 18-19, 25-26
Supriyadi. 2001. Tumbuhan Obat Indonesia, Penggunaan dan Khasiat. Edisi I. Jakarta: Populer Obor. Hal ix
Suryowinoto M. 1985. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Yogyakarta: Fakultas Biologi UGM. Hal 75
Tabata M. 1977. Recent Advance In The Production of Medical Sunstances by Plant Cell Culture, Plant Tissue Culture and Its Biothechnological Applicatian. Spinger-Verlag Berlin Heidelrg. Hal 71-72
Wetter LR, F. Constabel. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman. Edisi ke-2. Bandung: ITB. Hal 169
Wichtl, Bisset. 1994. Organic Essential Oil. http://www.herbalgram.org/iherb/ expandedcommissione/he056.asp [1 Jan 2009].
