Review Paper (Rekayasa Genetik) Dosen : Dr. Alimuddin m.k. Genetika Ikan
APLIKASI TEKNOLOGI RNA INTERFERENCE (RNAi)
PADA AKUAKULTUR
DARMAWAN SETIA BUDI C151120151
MAYOR ILMU AKUAKULTUR SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Aplikasi Teknologi RNA Interference (RNAi) pada Akuakultur
1. Pendahuluan
RNA interference (RNAi) adalah suatu mekanisme membloking ekspresi gen (gen silencing) pada fase post-transkripsi dengan cara meginduksi double-stranded RNA (dsRNA) ke dalam sel target sehingga menempel pada sekuen mRNA dan memicu degradasinya (Estrada et al. 2007). RNAi ditemukan pertama kali oleh Andrew Z. Fire and Craig C. Mello (1998) pada nematode, Caenorhabditis elegans. Percobaannya menggunakan antisense RNA untuk menghambat (knockdown) ekspresi gen, mereka menemukan efek sinergis pada gen silencing ketika sekuen antisense and sense RNA dikirim bersamaan ke dalam sel. Fenomena ini dianggap sebuah kenaehan yang terjadi pada waktu itu, tetapi perkembangan selanjutnya RNAi menjadi penemuan besar dalam membloking ekspresi gen terutama pada sel eukariot (Paddison 2008).
Perkembangan aplikasi teknologi RNAi sangat pesat terutama dibidang medis, pertanian, dan akuakultur. Di bidang medis teknologi RNAi paling berkembang pesat, terutama untuk terapi gen misalnya silencing gen pada penderita hepatitis A dan B maupun penderita kanker atau tumor, validasi model penyakit secara invitro maupun invivo, validasi aktivitas obat, dan identifikasi kandidat obat baru (Sidahmed & Wilkie 2010). Di bidang pertanian teknologi RNAi digunakan untuk memproduksi tanaman yang rendah kadar toksinnya. Sedangkan di bidang akuakultur teknologi RNAi digunakan untuk meningkatkan masa otot pada ikan misalnya silencing gen myostatin yang menghambat pertumbuhan otot pada zebrafish dan meningkatkan kualitas indukan pada udang misalnya silencing gen Crustacean Hyperglycemic Hormone (CHH) yang berperan dalam memacu reproduksi dan molting pada Litopenaeus schmitti (Estrada et al. 2007).
2. RNA interference (RNAi) 2.1. Mekanisme kerja RNAi
Ketika double-stranded RNA (dsRNA) diinduksi ke dalam sel target maka tidak begitu saja memicu shutdown transkripsi dan translasi protein, tetapi melalui beberapa proses (Gambar 1), yaitu:
nukleotida dengan 2-4 nukleotida overhang pada ujung 3’. Hasil potongan ini disebut small interfering RNA (siRNA) yang selanjutnya akan memicu terjadinya RNAi pada sel target. Proses pemotongan dsRNA oleh RNAse-III tidak memerlukan ATP tetapi oleh aktivitas enzim nuklease (Schepers 2005).
[2] Beberapa fragmensi RNA akan berikatan dengan komplek protein RISC
(RNA-Induced Silencing Complex) yang akan memandu mengenal mRNA yang berisi sekuen homolog, selanjutnya kedua sekuen ini akan berkomplemen. Setelah berkomplemen maka enzim nuklease yang ada pada komplek RISC akan mendegradasi mRNA.
Gambar 1. Mekanisme kerja RNA interference (RNAi) (Mocellin & Provenzano 2004). 2.2. Merancang RNAi
RNAi akan efektif jika memicu terjadinya siRNA yang mengandung 19-23 nukleotida sense dan antisense dengan 2-4 nukleotida overhang pada ujung 3’. Strand sense homolog dengan mRNA, sebaliknya antisense akan berkomplemen dengan mRNA target. siRNA harus memiliki dua kriteria untuk bekerja dengan efektif, yaitu:
[1] siRNA harus efektif memicu RNAi dan
Merancang siRNA yang spesifik memerlukan informasi sekuen gen target (sekitar 19 nukleotida) yang dapat dicari didatabase (misalnya di Gene Bank). Selain sekuen utama, kadang-kadang struktur sekunder dan tersier berperan penting untuk potensi hibridisasi antara RNA target dan strand siRNA antisense. Sekuen yang berlokasi di dalam intron tidak bisa digunakan sebagai target siRNA untuk menjalankan gen silencing machinery di dalam sitoplasma. Sekuen juga harus mencakup sisi pemanjangan translasi dan potensi potein binding site yang berada pada ujung 5’ and 3’daerah UTR (Untranslated Region) harus dihindari. Oleh karena itu, seleksi sekuen target mRNA dapat dilakukan secara trial and error, sekuen lain dapat dipilih jika tidak ada informasi pada struktur RNA yang tersedia secara invivo.
Spesifisitas sekuen harus tinggi sehingga sekuen tidak men-silencing gen lain di luar target, yaitu dengan mengetahui tingkat homologinya. Hal ini harus didukung dengan profile ekspresi genom yang baik sebelum diinduksi dengan RNAi. Strategi seleksi siRNA untuk menghindari tingginya homologi dengan gen lain, yaitu dengan BLAST. Dengan metode ini efek terhadap gen non-taget dapat diminimalkan dan dihindari. Pada kontek ini, perlu dicatat bahwa satu atau dua mismatches antara strand antisense siRNA dan mRNA target kemungkinan hanya sebagian menghilangkan siRNA yang memediasi degradasi RNA, khususnya jika mismatches berada pada ujung 3’ atau 5’ pada untaian siRNA (Scherr et al. 2004).
2.3. Teknik Pengiriman RNAi
Pengiriman RNAi (RNAi delivery) ke dalam sel target sampai saat ini merupakan tantangan yang paling besar dan cukup sulit dilakukan karena kompleknya sistem dalam sel. Ada dua metode yang sudah cukup sukses digunakan untuk pengiriman siRNA ke dalam sel target pada sel hewan, yaitu viral delivery dan non-viral delivery (Li et al. 2006, Scherr et al. 2004).
Viral delivery adalah pengiriman siRNA menggunakan virus sebagai vektor. Keuntungan menggunakan virus adalah berbiaya lebih murah dan lebih efisien. Ada lima vektor virus yang umum digunakan, yaitu Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, Adeno-Associated-Virus (AAV), dan Baculovirus.
retrovirus adalah genom yang terintegrasi membawa resiko terjadinya insersi mutagenesis dan karsinogenesis.
[2] Lentivirus merupakan subklas retrovirus dengan cara kerja, sama dengan retrovirus tetapi tidak memberikan resiko terjadinya insersi mutagenesis, dapat mentranduksi genom lebih efisien, dan tidak membelah dalam sel. Selain itu lentivirus dapat mengakomodasi sejumlah besar data dalam genomnya dan rendah immunogenic
daripada adenovirus.
[3] Adenovirus merupakan vektor yang populer untuk terapi gen. Informasi genetik dari adenovirus menyebar diluar inti sel target sehingga memiliki resiko yang kecil terintegrasinya DNA virus ke dalam genom sel inang. Hal ini menyebabkan informasi genetik yang diberikan tidak stabil dan bersifat transien.
[4] Adeno-Associated-Virus (AAV) sangat menjanjikan sebagai vektor karena memiiki banyak keuntungan antara lain tidak bersifat patogenik, memiliki target sel yang luas, dan tidak membelah dalam sel inang.
[5] Baculovirus merupakan vektor relatif baru digunakan dengan beberapa keuntungan yaitu kapasitas membawa informasi genetik yang besar sehingga dapat dikombinasikan penggunaannya dengan vektor gen terapi dan gen silencing serta lebih aman.
Sedangkan non-viral delivery adalah pengiriman siRNA tanpa menggunakan vektor virus, tetapi menggunakan teknik atau agen tertentu misalnya hydrodynamic injection,
chemically modified siRNA, liposomes, nanoparticles, selective particles, dan bacteria.
[1] Hydrodynamic injection adalah metode injeksi dsRNA ke dalam pembuluh darah secara langsung dengan tekanan tinggi (high pressures) dalam waktu yang sangat singkat (dalam hitungan detik) dengan volume relatif tinggi sekitar 500-2000 µL.
[2] Chemically modified siRNA; yaitu memodifikasi molekul siRNA dengan penambahan struktur kimia tertentu (residu) pada posisi 2’ gugus ribosa; misalnya 2'-O-Me, 2'-O-allyl, dan 2’-deoxyfluorouridine.
[3] Liposomes yaitu metode pengiriman siRNA dengan membungkuskannya dengan
Liposomes seperti cationic liposomes, neutral liposomes (DOPC), dan cationic DOTAP liposomes. Kemudian siRNA ini diberi probe atau penanda fluorescent untuk kuantifikasi bahwa siRNA masuk ke dalam sel target.
[5] Selective particles adalah siRNA untuk pengobatan (therapeutics) yang mengkombinasikan pendekatan stabilisasi kimia siRNA dengan pengiriman melalui liposom atau nanopartikel pada target yang lebih spesifik yang disebut SNALP (Stable Nucleid Acid-Lipid Particle).
[6] Bacteria adalah pengiriman siRNA menggunakan bakteri nonpatogenik untuk menginduksi gen silencing pada sel target. Keuntungan menggunakan bakteria yaitu lebih aman, mudah mengontrolnya dengan antibiotik, dan lebih mudah untuk dimanipulasi genetiknya.
3. Aplikasi Teknologi RNAi pada Ikan
Pada tumbuhan dan hewan, termasuk ikan, temuan dari beberapa kelas yang berbeda dari regulasi kecil RNA (Aravin & Tuschl 2005) dapat diambil sebagai bukti bahwa regulasi RNA mungkin memiliki banyak fungsi yang berbeda. Hal ini merupakan alasan untuk mempelajari jalur regulasi RNA pada ikan serta hewan lainnya.
Respon non-spesifik terlihat ketika menyuntikkan dsRNAs panjang ke embrio ikan zebra, sehingga RNAi awalnya dianggap sebagai teknik praktis untuk knock-down
gen spesifik pada ikan (Editorial 2000, Clark et al. 2003) sebagaimana juga terjadi pada studi pertama dalam sel mamalia (Elbashir et al. 2001). Berbeda pada sel mamalia, hal ini masih berlaku ketika menyangkut ikan (Deiters & Yoder, 2006). Karena efek off-target, penggunaan morpholinos untuk pencabutan ekspresi gen tertentu telah menjadi metode pilihan dalam embrio ikan. Tapi dengan mempertimbangkan regulasi kecil RNA membentuk bagian alami dari sel yang memiliki sistem regulasi gen, para peneliti mempelajari mekanisme RNAi serta desain alami RNA kecil, dan akhirnya mampu menghasilkan siRNAs tersebut yang dapat menghindari efek off-target dengan spesifisitas tinggi terhadap target.
DAFTAR PUSTAKA
Aravin, A. & Tuschl, T. (2005). Identification and characterization of small RNAs involved in RNA silencing. FEBS Letters 579, 5830–5840.
Clark, M. S., Crawford, D. L. & Cossins, A. (2003). Meeting review: worldwide genomic resources for non-model fish species. Comparative and Functional Genomics 4, 502–508.
Deiters, A. & Yoder, J. A. (2006). Conditional transgene and gene targeting methodologies in zebrafish. Zebrafish 3, 415–429.
Editorial (2000). Targeting zebrafish. Nature Genetics 26, 129–130.
Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. & Tuschl, T. (2001a). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494–498.
Estrada MP et al. 2007. Effects RNA interferences on gene functions of aquatic organism. Biotecnologia Aplicada vol. 24 (2): 179-182.
Li CX et al. 2006. Delivery of RNA interference (review). Cell Cycle 5:18, 2103-2109.
Mocellin S., and Provenzano M. 2004. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology (Review). Journal of Translational Medicine 2:39.
Paddison PJ. 2008. RNA interference in mammalian cell systems. Springer-Verlag
Schepers U. 2005. RNA interference in practice. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,
Scherr M., Steinmann D., and Eder M. 2004. RNA interference (RNAi) in hematology. Ann Hematol 83:1–8
Schyth BD. 2008. Review paper: RNAi-mediated gen silencing in fishes?. Journal of Fish Biology (2008) 72, 1890–1906 doi:10.1111/j.1095-8649.2008.01819.x, available online at http://www.blackwell-synergy.com
