Kopi Pinogu (Coffee canephora var. Robusta) menggunakan Metode Liquid Choromatogrphy-Mass Spectrometry (LC-MS)
Moh. Rivaldi Mappa1
1 Program Studi Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan, Institut Kesehatan dan Teknologi Graha Medika, Jalan Siswa, Kelurahan Mogolaing, Kotamobagu.
* Corresponding email : [email protected]
ABSTRAK
Kopi pinogu (coffea canephora var. robusta) termasuk dalam jenis kopi robusta, dimana kopi robusta merupakan jenis kopi yang lebih banyak mengandung asam klorogenat. Asam klorogenat adalah senyawa fenilpropanoid yang mempunyai aktivitas antioksidan dalam menurunkan kadar asam urat. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentiikasi asam klorogenat yang terkandung dalam ekstrak metanol biji kopi pinogu (coffea canephora var.
robusta) menggunakan metode liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
Isolasi dilakukan dengan teknik ekstraksi maserasi yang menghasilkan ekstrak kental sebanyak 3 gram. Ekstrak kental metanol yang dihasilkan dilakukan skrining fitokimia yang menunjukan hasil positif mengandung senyawa polifenol. Ekstrak kental metanol difraksinasi menggunakan metode partisi padat cair dengan pelarut n-heksan. Dimana ekstrak metanol hasil partisi dipekatkan dengan rotary evaporator. Ekstrak kental metanol hasil partisi fraksi polar dilanjutkan dengan uji KLT yang bertujuan untuk mendapatkan komposisi eluen terbaik. Kemudian komposisi eluen terbaik digunakan pada pemisahan dengan metode KLTP yang menggunakan silika gel sebagai fase diam dan campuran eluen etil asetat (40:20) n-heksan sebagai fase gerak, proses elusi dilakukan dalam chamber. Noda tunggal yang terbentuk pada lempeng KLTP kemudian dikerok. Isolat hasil kerokan selanjutnya diidentifikasi menggunakan instrument LC-MS.
Hasil analisis (LC-MS) memberikan waktu retensi 1 menit 34 detik dengan volume injeksi 0,6 ml/min.
Berdasarkan hasil analisis tersebut dapat diketahui bahwa senyawa asam klorogenat yang terdapat pada biji kopi pinogu (coffea canephora var. robusta) memiliki pola fragmentasi berdasarkan berat molekul 381 m/z.
Kata kunci: Rumput Laut, Lidah Buaya, Luka Bakar
ABSTRACT
Pinogu coffee (Coffea canephora var Robusta) is included in the type of Robusta coffee, where Robusta coffee is a type of coffee that contains chlorogenic acid more than the others. Chlorogenic acid is a phenylpropanoid compound that works as antioxidant in lowering uric acid levels. This study aimed to isolate and identify chlorogenic acid contained in methanol extract of Pinogu coffee beans (Coffea canephora var Robusta) using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) method.
Isolation was done by maceration extraction technique which produced 3 gramsof viscous extract.Then is was continued by doing phytochemical screening of the methanol extract which showed a positive result that it contained polyphenolic compounds. The methanol viscous extract was fractionated using a liquid solid partition method with n- hexane solvent where partitioned methanol extract was concentrated with a rotary evaporator. The methanol viscous extract which was produced by polar fraction partition was tested by a TLC test aimed at obtaining the best eluent composition. The best eluent composition was then used in separation by KLTP method using silica gel as a stationary phase and a mixture of ethyl acetate eluent (40:20) n-hexane as the mobile phase, the elution process being carried out in the chamber. The single stain formed on the KLTP slab was then scraped. The scrapped isolate were then identified using the LC-MS instrument.
The results of analysis (LC-MS) gave retention time of 1 minute 34 seconds with injection volume of 0.6 ml / min.
Based on the results of the analysis it can be seen that the chlorogenic acid compounds found in Pinogu coffee beans (Coffea canephora var Robusta) have fragmentation patterns based on molecular weight of 381 m/z.
Keywords: Pinogu Coffee, Chlorogenic Acid, LC-MS
JURNAL ILMIAH KESEHATAN KARYA PUTRA BANGSA
No.2/Vol.3 Jurnal Online STIKes Karya Putra Bangsa Tulungagung [Desember, 2021]1. PENDAHULUAN
Kopi merupakan salah satu alternatif minuman pilihan yang sangat popular dan digemari oleh masyarakat Indonesia maupun. Salah satu daerah di Indonesia, yaitu kabupaten bone bolango, provinsi gorontalo merupakan tempat pertumbuhan kopi robusta (Coffea canephora var. robusta) yang juga dikenal dengan kopi pinogu. Kopi tidak saja memberikan aroma dan rasa yang khas tetapi juga memberikan manfaat besar bagi kesehatan. Namun sebagian orang menolak minum kopi karena menganggap kopi yang mempunyai rasa pahit berwarna hitam tidak baik untuk kesehatan jika dikonsumsi secara berlebihan. Sejumlah besar bukti ilmiah menunjukkan bahwa minum kopi secara tidak berlebihan yakni 3-5 cangkir per hari dapat mengurangi resiko beberapa jenis penyakit.(Syamsulbahri, 1996). Dalam satu cangkir kopi terdapat sekitar 800 senyawa aromatik.Dalam biji kopi mengandung berbagai senyawa kimia seperti karbohidrat, protein, mineral, kafein, trigonetin, asam alifatik (asam karboksilat), asam klorogenat, lemak, glikosida dan komponen volatile.
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh Joe Vinson.Kopi mempunyai kapasitas antioksidan 5-8 kali lebih tinggi dibandingkan kapasitas antioksidan pada teh (Natella et al. 2002) dan komponen yang berperan adalah senyawa polifenol. Jumlah total polifenol untuk secangkir kopi rata-rata berkisar antara 200- 550 mg, yang memiliki aktivitas antioksidan sebesar 26% (Sukohar et al, 2011).Salah satu komponen polifenol yang terdapat dalam jumlah yang banyak didalam kopi adalah asam klorogenat. Asam klorogenat merupakan senyawa kimia yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan, dengan titik leleh 208°C dan terdapat dalam kopi sebesar 6,1 – 11,3% (Naely et al,2007)
Asam klorogenat adalah kelompok senyawa yang terdiri hydroxycinnamates yang dipercaya mampu menurunkan kadar asam urat yang disebabkan karna adanya kandungan utama senyawa polifenol dalam kopi yaitu asam klorogenat. Pusat informasi ilmu pengetahuan kopi mengatakan bahwa senyawa asam klogenat yang memiliki aktifitas antioksidan bisa melindungi terhadap tekanan oksidatif dengan membersihkan radikal- radikal bebas yang merugikan (Septianus, 2011).Hal ini berkaitan dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Ismulah (2016), dapat diketahui bahwa kopi pinogu mengandung senyawa polifenol yang dapat memberikan efek penurunan kadar asam urat.
Berdasarkan penjelasan diatas sehingga pada penelitian ini dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa polifenol asam klorogenat pada kopi pinogu yang memiliki aktivitas antioksidan alami yang dipercaya dapat menurunkan asam urat, dengan cara ekstraksi maserasimenggunakan pelarut metanol dan di analisis menggunakan instrumentLiquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS). Adapun kelebihan instrument ini yaitu memiliki sensitivitas, fleksibilitas dan akurasi deteksi yang sangat tinggi jika dibandingkan dengan instrument yang lain, sedangkan asam klorogenat ini merupakan senyawa yang sulit dideteksi dengan instrument lain sehingga digunakan LCMS. Menurut Jaiswal (2014) pada LCMS senyawa asam klorogenat beserta turunan-turunannya dapat dengan mudah terdeteksi.
2. METODE PENELITIAN
Pengolahan Dan Pembuatan Ekstrak Biji Kopi Pinogu (Coffee canephora var. Robusta)
Biji kopi pinogu yang di keringkan dalam proses pembuatan serbuk dengan cara diblender tanpa menyebabkan kerusakan atau kehilangan kandungan kimia yang dibutuhkan dan diayak menggunakan ayakan.
Skrining Fitokimia Senyawa Polifenol
Uji Senyawa Polifenol dilakukan dengan cara ekstrak metanol kopi pinogu diambil sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi ditambahkan larutan FeCl3 1%
Isolasi dan Pemurnian
Ekstrak kental biji kopi pinogu (Coffea chanephora var. Robusta) dipartisi dengan n-heksan menghasilkan lapisan larut n-heksan dan lapisan yang tidak larut n-heksan kemudian Fraksi lapisan yang tidak larut n-heksan dianalisis dengan KLT kromatografi lapis tipis fase diam silika gel Gf 254 dan fase gerak kemudian dilakukan deteksi bercak noda hasil KLT pada lampu UV 254 nm dan 366 nm dan penyemprotan pereaksi asam sulfat pada lempeng KLT. Difraksinasi dengan KLTP kromatografi lapis tipis preparatif fase diam silica gel dan fase gerak diperoleh fraksi isolat CGA 1, CGA 2, CGA 3. Fraksi isolat CGA 1 mengandung senyawa asam
klorogenat. Dimurnikan kembali dengan alat LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry menggunakan fase diam kolom C18
3. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Ekstraksi Kopi Pinogu
Tabel 1 menunjukkan bahwa ekstraksi kopi pinogu dengan berat sampel 20 gram menggunakan pelarut metanol sebanyak 300 mL, menghasilkan ekstrak sebanyak 3 gram dengan persen rendamen sebesar 15 %. Depkes RI (2000) yang menyatakan bahwa range % rendamen dari proses ekstrak yang berlangsung sempurna adalah 10%-15% sehingga dapat disimpulkan bahwa proses ekstraksi yang dilakukan dengan menggunakan metode maserasi berlangsung secara sempurna.
Tabel 1. Hasil Rendamen yang Diperoleh Berat Sampel
(gram)
Pelarut (mL)
Berat Ekstrak (gram)
Rendamen (%)
20 300 3 15
2. Skrining Fitokimia Kopi Pinogu
Tabel 2 menunjukkan hasil skrining fitokimia dari kopi pinogu, dimana ketika ekstrak kopi pinogu yang telah dilarutkan dalam metanol ditambahkan pereaksi FeCl3 terjadi perubahan warna menjadi warna biru hitam yang kuat.Perubahan inilah yang menandakan bahwa kopi pinogu positif mengandung polifenol.(Harborne, 1987).
Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia Kopi Pinogu
Senyawa Pereaksi Hasil Uji Keterangan
Polifenol FeCl3 Biru Hitam Positif
3. Partisi Padat Cair
Berdasarkan tabel 3 dapat diketahui bahwa setelah dilakukan partisi padat cair terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan larut n-heksan dan lapisan tidak larut n-heksan, dimana berat ekstrak dari masing-masing lapisan yaitu 1,46 gram dan 2,37 gram.
Tabel 3. Hasil Partisi Padat Cair
Pelarut Penyari Berat Ekstrak Warna Ekstrak
Larut N-heksan 1,46 gram Putih Keruh
Tidak Larut N-heksan 2,37 gram Kuning kecoklatan
4. Kromatografi Lapis Tipis
Gambar 1 Hasil Uji KLT Ekstrak Metanol Biji Kopi Pinogu (Coffea canephora var. Robusta) Pada Lampu UV 254 nm dan 366 nm
JURNAL ILMIAH KESEHATAN KARYA PUTRA BANGSA
No.2/Vol.3 Jurnal Online STIKes Karya Putra Bangsa Tulungagung [Desember, 2021]Gambar 1 menunjukkan penampang noda ekstrak metanol biji kopi pinogu pada lempeng KLT dibawah lampu UV 254 nm dan 366 nm, dimana pada UV 254 nm lempengnya berfluoresensi sedangkan pada UV 366 nm nodanya berfluoresensi. Proses elusi dilakukan menggunakan eluen etil asetat 4 : 2 n- heksan
5. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Gambar 2 Hasil Uji KLTP Ekstrak Metanol Biji Kopi Pinogu (Coffea canephora var. Robusta) Pada Lampu UV 366 nm
Gambar 2 menunjukkan penampakan lempeng KLT di bawah lampu UV 366 nm. Pada lampu UV 366 nm terlihat jelas noda dari senyawa asam klorogenat yang berfluoresensi membentuk warna biru keputih-putihan. Proses elusi dilakukan menggunakan eluen etil asetat 40 : 20 n-heksan.
Tabel 4. Hasil Uji Organoleptis
Formula Warna Kekeruhan Homogenitas
F1 Putih kecoklatan Keruh Homogen
F2 Putih kecoklatan Keruh Homogen
F3 Putih agak
kecoklatan
Sedikit
Keruh Homogen
6. Identifikasi Senyawa Asam Klorogenat menggunakan LC-MS
Chromatogram 1 Profil liquid chromatography senyawa asam klorogenat. Jenis kolom : C18, Fase gerak : asetonitril 40:60 metanol, volume injeksi 10 µL, laju alir 0,6 ml/menit, temperature kapiler 150ºC, tegangan
spray ion 4 KV dan tegangan kapiler 36 V.
Berdasarkan Chromatogram 1 dapat diketahui bahwa ekstrak metanol biji kopi pinogu (Coffea canephora var. robusta) menunjukan waktu retensi 1 menit 34 detik dengan perbandigan eluen asetonitril 40 % : metanol 60% dan volume injeksi 0,6 ml/min.
4. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak metanol biji kopi pinogu (Coffee canephora var. Robusta) mengandung senyawa asam klorogenat.
Hal ini dapat diketahui dari hasil analisis menggunakan metode Liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS) yang menunjukkan waktu retensi 1 menit 34 detik dan pola fragmentasi berdasarkan berat molekul dari senyawa asam klorogenat yaitu 381 m/z.
DAFTAR PUSTAKA
Clifford, M. N. dan Knight, S. 2004. The cinnamoyl-amino acid conjugates of green robusta coffee beans. Food Chemistry. Food dan Function. 457–463
Clifford, M. N., Wu, W., Kirkpatrick, J., Jaiswal, R., dan Kuhnert, N. 2010. Profiling and characterisation by liquid chromatography/multi-stage mass spectrometry of the chlorogenic acids. Gardeniae Fructus.Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3109–3120.
Clifford, M.N. 1999. Review: Chlorogenic Acids and Other Cinnamates Nature, Occurrence and Dietaru Burden. Journl of the Science of Food and Agriculture. 79: 362-372.
Daniele, D.R., Angelique, S., Luca, C., dan Alan, C. 2010. Bioavailability of Coffee Chlorogenic Acids and Green Tea Flavan-3-ols.MDPI Nutriens Journal.820-833.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Acuan Sediaan Herbal. Direktorat Jendral POM-Depkes RI. Jakarta.
Harborne, J.B. 1987. Fitokimia. Penerbit ITB. Bandung.
Hostettmenn, K. dkk. 2006. Cara Kromatografi Preparatif. ITB. Bandung.
Jaiswal, R., dan Kuhnert, N. 2010. Hierarchical scheme for liquid chromatography/multi-stage spectrometric identification of 3,4,5-triacyl chlorogenic acids in green Robusta coffee beans.
Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2283–2294.
Jaiswal, R., dan Kuhnert, N. 2011. How to identify and discriminate between the methyl quinates of chlorogenic acids by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 269–281.
Jaiswal, R., dan Kuhnert, N. 2011. Identification and characterization of five new classes of chlorogenic acids. In burdock k Arctium lappa L. Roots by liquid chromatography.
Jaiswal, R., Kiprotich, J., dan Kuhnert, N. 2011. Determination of the hydroxycinnamate Profile of 12 members of the Asteraceae family. Phytochemistry. 781–790.
Kang, J.S. 2012. Principles and Applications of LC-MS/MS for the Quantitative Bioanalysis of Analytes in Various Biological Samples. Department of Pharmacology & Clinical Pharmacology Laboratory, Biomedical Research Institute, Hanyang University. South Korea.
Manastas, A. 2014. Teknologi Penangan Pasca Panen Kopi Robusta. Kanisius. Yogyakarta.
Natella, F., M. Nardini, I. Ghiselli, C. Dattilo and C .Scaccini. 2002.Coffee Drinking Influence plasma antioxidant capacity in humans. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50:
6211-6216.
Septianus.2011. Perbandingan Aktivitas Berbagai Antioksi dan Terhadap Penampilan Broiler.
Jurnal Penelitian Pertanian Terapan. 68-74.
Sukohar, A., Setiawan, F. Wirakusumah, H.S. Sastramihardja. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Sitotoksik Kafein dan Asam Klorogenat dari Biji Kopi Robusta Lampung. Jurnal Medika Planta Vol. 1 No. 4. 12-25.
Syamsulbahri, 1996. Bercocok Tanam Tanaman Perkebunan Tahunan. Gadjah Mada Press, Yogyakarta.
