HEME SPIN RENDAH SITOKROM OKSIDASE C SEBAGAI HEME SPIN RENDAH SITOKROM OKSIDASE C SEBAGAI
PENDORONG PROSES POMPA PROTON PENDORONG PROSES POMPA PROTON
Oleh: Oleh: Anne Carolina (205040! Anne Carolina (205040! E"a #$lan%ari (2050402! E"a #$lan%ari (2050402!
PROGRAM MAGISTER KIMIA PROGRAM MAGISTER KIMIA BIDANG KH&S&S BIOKIMIA BIDANG KH&S&S BIOKIMIA INSTIT&T TEKNO'OGI BAND&NG INSTIT&T TEKNO'OGI BAND&NG
2005 2005
ABSTRAK ABSTRAK
Sitokrom c oksidase mitokondria berperan penting dalam respirasi seluler Sitokrom c oksidase mitokondria berperan penting dalam respirasi seluler aerob, mereduksi oksigen menghasilkan air, dalam proses kopling dengan pompa aerob, mereduksi oksigen menghasilkan air, dalam proses kopling dengan pompa hidro
hidrogen gen melemelewati wati memmembran bran mitomitokondkondria ria dalamdalam. . ResiResidu du aspaspartatartat, , AspAsp-51, -51, anangg !berlokasi dekat permukaan en"im, mengalami perubahan struktur dalam Sinar-#. !berlokasi dekat permukaan en"im, mengalami perubahan struktur dalam Sinar-#. $al ini mengindikasikan bahwa residu ini berperan dalam proses pemompaan $al ini mengindikasikan bahwa residu ini berperan dalam proses pemompaan proton.
proton. %eskipun %eskipun bukti bukti keterlibatan keterlibatan mekanistik mekanistik dan dan &ungsional &ungsional dari dari residu residu iniini dala
dalam m proseproses s pemopemompaampaan n protoproton n belubelum m 'ela'elas s diperdiperoleholeh, , mutamutasi Asp-5(si Asp-5( AsnAsn
da
dari ri en"en"im im hahati ti memempemperlihrlihatkatkan an &un&ungsi gsi pompompa pa proproton ton tantanpa pa memempempengangaruhruhii akti)
akti)itas itas redukreduksi si diokdioksigensigen. . StrukStruktur tur SinaSinar-# r-# *pada resolus*pada resolusi i 1.+1.+1. 1. dalamdalam bentuk
bentuk teroksidasi teroksidasi dan dan reduksi reduksi penuh/ penuh/ menun'ukkan menun'ukkan bahwa bahwa muatan muatan positi& positi& totaltotal a
ang ng dibdibententuk uk selselamama a okoksidsidasi asi memendondoronrong g tratranspnsport ort proproton ton aktakti& i& dardari i ruaruangng mitokondria ke Asp-51 melewati en"im lewat saluran air dan 'aringan ikatan mitokondria ke Asp-51 melewati en"im lewat saluran air dan 'aringan ikatan hid
hidrogrogen, en, aang ng beberlorlokaskasi i di di tantandemdem. . SelSelain ain itu itu redreduksuksi i en"en"im im menmengingindukduksisi pengeluaran proton dari aspartat ke mitokondria bagian luar.
pengeluaran proton dari aspartat ke mitokondria bagian luar. 0katan peptida dalam0katan peptida dalam 'aringan
'aringan ikatan ikatan hidrogen hidrogen menginhibisi menginhibisi trans&er trans&er balik balik proton proton melalui melalui 'aringan.'aringan. erubahan redoks dalam kapasitas saluran air, diinduksi oleh gugus hidroksi erubahan redoks dalam kapasitas saluran air, diinduksi oleh gugus hidroksi &arnesil etil dari
&arnesil etil dari heme spin-rendah. $al ini mengindikasikan bahwa &ungsi saluranheme spin-rendah. $al ini mengindikasikan bahwa &ungsi saluran ai
air r sasama ma e&e&ekektiti&n&na a dedengngan an dadaererah ah pepengngumumpupul l prprototonon. . $a$asisil l inin&r&rarareded mengindikasikan bahwa kon&ormasi Asp-51 dikontrol hana oleh bentuk oksidasi mengindikasikan bahwa kon&ormasi Asp-51 dikontrol hana oleh bentuk oksidasi heme spin rendah. $asil ini
heme spin rendah. $asil ini mengindikasikmengindikasikan bahwa heme spin an bahwa heme spin rendah mendorongrendah mendorong proses pomp
BAB I
PENDAH&'&AN
Sitokrom c oksidase ang berlokasi di bagian dalam membran mitokondria merupakan en"im kunci pada rantai respirasi organisme aerob. 2n"im ini ber&ungsi dalam katalisis trans&er elektron dari sitokrom c ke oksigen molekular, sehingga ter'adi reduksi men'adi air. Reaksi ini ter'adi melalui proses transport, aitu melalui pemompaan empat proton melewati membran. Sitokrom c oksidase memiliki empat ko&aktor reaksi redoks ang akti&, aitu dua atom 3u pembentuk, dinamakan 3uA
,
suatu heme a spin rendah, serta pusat binuklir heme a4 dan 3uB.3uA menerima elektron dari sitokrom c dan elektron ditrans&er melalui heme a ke
pusat binuklir tempat ter'adina reduksi oksigen.
Kesetimbangan elektron dicapai dari sitokrom c di luar membran dalam mitokondria *ruang inter membran/ melalui sisi 3u A dan heme spin rendah *heme a/ ke sisi reduksi (. roton ang digunakan untuk pembentukan air dari (,
ditrans&er dari membran dalam mitokondria *ruang matriks/ melalui dua 'aringan ikatan hidrogen ang disebut 'alur K dan 6. Selain dalam proses pompa proton, trans&er proton dan elektron ke sisi reduksi ( menghasilkan perpindahan muatan
positi& ke ruang intermembran, ang menghasilkan gaa proton motive ang
%utasi residu asam amino di dalam 'alur 6 dapat menebabkan penurunan dalam e&esiensi pompa proton dan penurunan akti)itas reduksi (. engamatan
menun'ukkan bahwa proses ang menertai pompa proton ter'adi melalui 'alur proton untuk membentuk air. Struktur Sinar-# memperlihatkan bahwa sitokrom c
oksidase dari hati sapi dalam bentuk teroksidasi dan tereduksi penuh pada resolusi (.4 dan (.45 , menun'ukkan adana pergerakan Asp-51 dari subunit 0 *subunit paling besar ang mengandung heme a dan sisi reduksi (/ dari interior protein
menu'u permukaan inter membran melalui reduksi en"im. 6alam bentuk teroksidasi, Asp-51 berkontak dengan ruang matriks melalui 'aringan ikatan hidrogen sehingga molekul air dapat melewati ruang dalam matriks *'alur $/. Struktur ini memberikan gambaran bahwa proses pompa proton ter'adi pada Asp-51. Akan tetapi usulan mengenai hal ini belum banak diterima, karena en"im bakteri dan tumbuhan tidak mempunai residu analog Asp-51 *penomoran dalam
sapi/ dan 'uga karena mutasi 'alur 6 menebabkan penurunan e&isiensi pompa proton dan akti)itas reduksi (. selain itu tidak ada mekanisme untuk penggerak
pompa proton pada Asp-51 ang men'elaskan. %utasi Asp-51 memberikan satu alternati& untuk men'elaskan &ungsi Asp-51. 6alam penelitian ini akan di'elaskan peranan 'alur $ melalui sisi mutagenesis terarah, struktur Sinar-# dan
BAB II
TINA&AN P&STAKA
Semua tahap-tahap en"imatis pada degradasi oksidati& karbohidrat, lemak dan asam amino didalam sel aerobik menatu men'adi tahap akhir respirasi sel. 6isini ter'adi pengaliran electron dari senawa organik menu'u oksigen, menghasilkan energi untuk membuat AT dari A6 dan &os&at. Rantai respirasi terdiri dari serangkaian protein dengan gugus prostetik ang terikat kuat dan mampu menerima dan memberikan elektron.
ada sel eukariot, hampir semua dehidrogenase spesi&ik ang diperlukan pada oksidasi piru)at dan bahan bakar lain melalui siklus asam sitrat terletak pada bagian sebelah dalam mitokondria aitu matriks. %olekul pemindah electron dari rantai respirasi dan molekul en"im ang melakukan sintesa AT dari A6 dan &os&at terbenam dalam membran sebelah dalam. Bahan bakar siklus asam sitrat seperti piru)at, harus dipindahkan dari sitosol *tempat dilakukanna sintesis molekul-molekul tersebut/ melalui membran mitokondria ke dalam bagian matriks disebelah dalam, sebagai tempat akti)itas dehidrogenase.
6emikian pula, A6 ang dibentuk dari AT selama akti)itas ang memerlukan energi dari sitosol harus dipindahkan ke dalam matriks mitokondria, untuk mengikat &os&at kembali, men'adi AT. AT baru ang dibentuk harus dikembalikan ke sitosol.
7adi membran mitokondria sebelah dalam, merupakan struktur komplek ang mengandung molekul pembawa electron, se'umlah en"im dan beberapa sstem transport membran.
8ambar roses 9os&orilasi ksidati& dalam %itokondria
Beberapa 'enis gugus pembawa elektron, semuana berikatan dengan protein. 8olonganna antara lain :ikotinamida adenin dinukleotida *:A6/ ang akti& dengan dehidrogenase; &la)in mononukleotida *9%:/ pada :A6$ dehidrogenase;ubi<uinon atau koen"im =, suatu senawa kuinon isoprenoid ang larut dalam lemak, ang ber&ungsi dalam bentuk ikatanna dengan satu atau lebih protein; dua 'enis protein ang mengandung pusat besi-sul&ur *9e-S/ sitokrom;
dan tembaga pada sitokrom aa4.
Senawa sitokrom adalah protein mengandung besi pemindah elektron dan berwarna merah atau coklat, ang beker'a secara berurutan untuk mengangkut elektron dari ubikuinon ke molekul oksigen. 8olongan ini merupakan protein heme, dengan besi ang berada pada kompleks por&irin-besi, atau heme, ang serupa dengan pada hemoglobin.Terdapat tiga kelas sitokrom, a, b, dan c ang
%atri> $?? :A6$ :A6?? ($? ($?? @ 5( $(5 ( e− – – 0 = 000 0 ) ) B$? B$? ($? 0ntermembrane Space ct c
berbeda dalam spektra absorbsi sinarna. Setiap 'enis sitokrom dalam keadaaan tereduksina atau &erro memiliki tiga pita absorbsi ang 'elas pada kisaran sinar tampak.
Sitokrom pada rantai respirasi disusun dalam urutan b c1 aa4. Sitokrom b
berada dalam dua bentuk, menerima elektron dari ubikuinon dan memindahkanna ke sitokrom c1 ang selan'utna memberikan elektron ang
diterima ke sitokrom c. Setiap sitokrom berada dalam bentuk &eri C9e*000/D menerima satu elektron men'adi bentuk &ero C9e*00/D. embawa elektron terakhir adalah sitokrom aa4 atau oksidase sitokrom ang dapat memberikan elektron
langsung ke oksigen untuk menempurnakan proses transport elektron.
Sitokrom aa4 berbeda dengan sitokrom lain. rotein ini mengandung dua molekul
heme A ang terikat kuat, ang berbeda dari protoheme oada hemoglobin, dalam cincin por&irinna, ang memiliki rantai sisi hidrokarbon ang pan'ang. Eebih 'auh lagi sitokrom aa4 'uga mengandung dua atom tembaga ang esensial. Setelah
komponen sitokrom a menerima elektron dari sitokrom c dab tereduksi men'adi bentuk 9e*00/, molekul ini memberikan elektronna ke sitokrom a4. Sitokrom a4
tereduksi lalu memberikan elektron kepada molekul oksigen. Fnsur ang berpartisipasi dengan kedua gugus heme didalam proses ini adalah kedua atom tembaga ang terikat, ang mengalami perubahan redoks kupro-kupri C3u*0/-3u*00/D dalam &ungsina. 0ni adalah suatu tahap ang kompleks dan penting di dalam transport elektron, karena ke empat elektron harus diberikan hampir bersamaan kepada ( untuk menghasilkan dua $(, dengan mengambil empat $?
dari medium cair. 6ari semua anggota rantai transport elektron, hana sitokrom aa4 ang dapat bereaksi langsung dengan oksigen.
BAB III
METODO'OGI PENE'ITIAN
*+ M$,a-ene.i. Terarah (Si,e/%ire,e% M$,a-ene.i.!
7umlah sitokrom c pada mitokodria ditentukan menggunakan western blot. Se'umlah sampel di'alankan pada on G1(H %es :uage gels *:o)e>/ selama ( menit pada (!! dan !3. Kemudian electrotrans&er basah ke membran
nitroselulosa menggunakan sistem :o)e> dengan 5H metanol pada bu&&er trans&er selama 1 'am pada 4!. 2&isiensi trans&er dipertegas dengan noda trans&er awal pada gel dan membran menggunakan 2asStain *:o)e>/ and onceau S.
%embran residu noda dicuci menggunakan Tris-bu&&er saline dengan !.(H Tween- (! *TBS-T/,ang diblok semalam menggunakan 1.5H susu bubuk pada TBS-T. Sitokrom c ditandai menggunakan imunoglobulin antibodi sitokrom c oksidasi dari tikus dengan pengenceran 1 I (!!! dengan TBS-T dengan 1,5H selama 1 hari. 0nkubasi selan'utna menggunakan secondar anti tikus 0g berikatan dengan horseradish pero>idase *Amersham/ pada pengenceran 1I(!!! selama ! menit, pitana di)isualisasikan menggunakan reagen luminol dan &ilm sinar->.
*+2 Pe1$rnian Si,o"ro1 O".i%a.e %ari Ha,i Sai %an Kri.,ali.a.i
eniapan pemurnian en"im dengan rekristalisasi berulang adalah pengkondisian kristalisasi en"im ang sangat penting. Kristal dalam bentuk
reduksi penuh dan bentuk reduksi ikatan-3 dimulai dengan merendam bentuk teroksidasi penuh dengan medium ang mengandung askorbat dan se'umlah katalitik sitokrom c sebagai sistem pereduksi dan polietilen glikol *28 !!!/ untuk menstabilkan kristal dibawah atmos&er :( dan 3.
6i&raksi sinar-# dilakukan dengan cara menempatkan kristal pada kapiler ang sesuai dengan medium perendaman.
Keadaan teroksidasi dan keadaan pengikatan ligan dari en"im dipertegas dengan spektra absorpsi darikristal ini pada kondisi medium ang sama.
Bentuk a"ida disiapkan dengan merendam kristal pada keadaan teroksidasi penuh ke dalam bu&&er ang mengandung a"ida dan 'umlah 28 !!! ang sesuai pada keadaan aerobik. 6ata intensitas diambil menggunakan radiasi snchroton pada 1.! hoton 9actor, Tsukuba, 7apan, dengan modi&ied Jeissenberg camera untuk makromolekul.
BAB I3
HASI' DAN PEMBAHASAN
4+ M$,a-ene.i. A./5 %ala1 S$$ni, I Ha,i Sai Si,o"ro1 O".i%a.e
Subunit 0 Asp-51 digantikan oleh Asn melalui metode pembentukan hibrid. ektor ekspresi dibuat untuk memproduksi, di dalam sitosol sel $eEa, ang mengkode subunit 0 dari en"im sapi dengan signal targeting mitokondria
pada terminal :- dan ekor heksahistidin pada terminal 3-, untuk penentuan kuantitati& subunit 0 ang terekspresi. Struktur Sinar-# menun'ukkan bahwa terminal 3 subunit 0 mempunai ruang ang cukup untuk menerima tag *ekor/
$is tanpa mempengaruhi kon&ormasi en"im.
2&isiensi produksi en"im hibrid sapimanusia die)aluasi dengan antibodi ang spesi&ik. Seperti ang ditun'ukkan oleh analisis western blot dari S6S
mitokondria hati sapi dan Sel $eEa. Antibodi Subunit 0 sapi menun'ukkan pita ang 'elas tapi tidak pada Subunit 0 manusia *9ig. 1A, garis 1 dan (/. Antibodi untuk protein manusia hana bereaksi dengan Subunit 0 manusia tapi tidak dengan Subunit 0 sapi *9ig 1A, garis 4 dan /.
8ambar 1A. engaruh mutasi sub unit 0 Asp-51 4 Asn *Asp51Asn/ pada &ungsi sitokrom c oksidase. %itokondria dari hati sapi *'alur 1 dan 4/ dan sel $eEa *'alur ( dan / diperlakukan H S6S 4,5% urea dan di&raksinasi menggunakan S6S A82. ! gram sampel protein dimasukkan kecuali untuk 'alur 1 *(!gram protein/. Antibodi untuk subunit 0 sapi digunakan untuk 'alur 1 dan (, antobodi sub unit 1 untuk manusia digunakan 'alur 4 dan .
6odesil maltosida melarutkan sitokrom c okidase dari membran mitokondria tanpa mendenaturasi protein dan menghasilkan pita (1! k6a dari Sitokrom c oksidase dalam blue native A82. Antibodi sapi bereaksi dengan
&raksi (1! k6a dari mitokondria ang larut dalam dodesil maltosida. 9raksi ini diisolasi dari sel $eEa trans&ektan gen sapi wild-type *9ig 1B, garis (/.
8ambar 1B. $asil gel elektro&oresis di &raksinasi dengan 1,H dodesil maltosidesolubili"ed metokondria dari tiruan-trans&ektan sel $eEa *'alur 1, dan L/ dan dari sel $eEa menempatkan wild tpe *'alur ( dan 5/ dan sub unit 0 gen mutan Asp51Asn *'alur 4 dan / dari sitokrom c oksidase. ada 'alur 1,(, dan 4,1+!,! dan ! gram protein diberikan secara berturut-turut. ada 'alur - ditambahkan ! gram protein. Anibodi spesi&ik sub unit 0 untuk sapi digunakan 'alur 1-4 atau manusia pada 'alur -.
9raksi ang berhubungan diambil dari suatu sel trans&ektan oleh )ektor ang tidak membawa gen subunit 0 *mock-transfected cell line/ tidak
menghasilkan pita ang analog *9ig.1B, garis 1/. 6isamping itu antibodi manusia bereaksi dengan &raksi dari mock-transfected cell line *9ig 1B, garis dan L/.
Kemudian hasil menun'ukkan bahwa subunit 0 sapi tersusun oleh subunit manusia. Keberadaan pita ang lemah dari &raksi (1! k6a mitondria ang larut dari garis cell transfected gen sapi wild-tpe *9ig. 1B, garis 5/ menun'ukkan
bahwa subunit 0 manusia tidak sempurna digantikan oleh subunit 0 manusia dalam
cell transfected . 7umlah residu dari nonhibrid en"im ditentukan secara kuantitati&
dengan membandingkan intensitas pita dari pita (1! k6a dari mock-transfected
dan gen wild-type transfected cell seperti di'elaskan dalam metode aitu men'adi
sekitar (!H *9ig. 1B, garis dan 5/. ita ang ditun'ukkan dalam 9ig. 1B aitu pita blue native A82, tidak se'elas pita hasil S6S A82. Spektrum sinar
tampak dari mitokondria ang larut dalam dodesil maltosida dan mitokondria tereduksi penuh dari gen wild-type sel trans&ektan menun'ukkan suatu α- pita pada
L! nm, ang karakteristik bagi sitokrom c oksidase nati&. Tidak ada komponen mitokondria ang mempunai absorbansi signi&ikan pada L! nm selain sitokrom c oksidase.
Selan'utna, preparasi en"im hibrid ang larut memperlihatkan akti)itas en"im spesi&ik *la'u oksidasi &erositokrom c per molekul en"im/ ang sama tinggi dengan en"im preparasi ang larut dari sel trans&ektan tiruan. Spektrum dan akti)itas en"im dari en"im hibrid memberikan bukti kuat bahwa en"im hibrid
membawa kon&ormasi nati&. Sel trans&ektan dengan gen subunit 0 ang termutasi Asp51Asn memperlihatkan e&isiensi produksi en"im hibrid ang sama, seperti halna sel trans&ektan gen wild-type pada garis diatas *9ig. 1B, garis ( dan 4/.
Spektrum absorpsi dan akti)itas trans&er elektron dari preparasi ang bersi&at larut 'uga sama identik dengan en"im hibrid wild-type. $asil ini menun'ukkan bahwa
mutasi Asp51Asn tidak mengganggu struktur 46 en"im.
Akti)itas trans&er elektron dan pompa proton dari en"im hibrid dalam mitokondria ditentukan dengan mengukur la'u oksidasi sitokrom c dan pengeluaran elektron oleh preparasi mitoplast dengan keberadaan beberapa reagen pemblok akti)itas komponen mitokondria lain, termasuk )alimisin dan K3l untuk
eliminasi potensial membran. Reaksi dimulai dengan penambahan &errositokrom c. ksidasi &erositokrom c ini kemudian diinhibisi oleh 1m% sianida. Sampel mitoplast ang mengandung subunit 0 sapi wild-type mengalami asidi&ikasi awal
diikuti dengan alkalinisasi ang menebabkan reduksi oksigen dan proses pemompaan proton *9ig. 13, JT/.
8ambar 13 engeluaran proton oleh sampel mitoplast *.µg protein/ dari sel
$eEa trans&ektan dengan gen wild-tpe *JT/ dan gen subunit 0 mutan Asp51Asn *651:/ setelah penambahan +.1 nmol &erositokrom c. perubahan konsentrasi proton dengan keberadaan 1!nmol karbonil sianida p-tri&luorometoksi&enil hidra"on *933/ per mg protein mitoplast ang ditun'ukkan dengan ?933
Kur)a ang sama diperoleh dari sampel sel trans&ektan tiruan *tidak ditun'ukkan/. Karbonil sianida p-tri&luorometoksi &enilhidra"on *933/ memindahkan asidi&ikasi awal *8ambar 13, JT ? 933/. Adaptasi awal alkalinisasi dengan keberadaan 933 menun'ukkan bahwa alkalinisasi karena reduksi ( diabaikan dalam detik pertama. Kemudian kecepatan pengeluaran
proton dapat ditentukan dari &ase linear dalam detik pertama setelah inisiasi reaksi. erkiraan kuantitati& proton dan elektron ang ditrans&er dalam 5 detik pertama adalah !.L nmol proton *8ambar 13, JT/ dan 1.1 nmol ekui)alen
electron. $al ini berarti perbandingan $? e- adalah sekitar !.+(. Tiga pengukuran
sel ang sama, memberikan perbandingan !.+4, !.5+, dan !.. $arga ini sama dengan hasil dari sampel mitoplast ang dibuat dari garis sel trasn&ektan tiruan *!.+5 dan !.+(/. Selain itu harga ang sama 'uga ditun'ukkan oleh en"im mamalia lain. $asil ini 'uga menun'ukkan bahwa kon&ormasi nati& en"im ada pada en"im hibrid. reparasi mitoplast termasuk 'uga mutan Asp51Asn dari subunit 0 sapi tidak menun'ukkan adana asidi&ikasi awal *8ambar. 13, 651:/. Asidi&ikasi 'uga tidak terlihat dengan keberadaan 933 *9ig.13, 651: ? 933/. %utan mitoplast memperlihatkan oksidasi &errositokrom ang sensiti& terhadap sianida pada la'u ang lebih cepat sekitar !H dari wild-tpe. Kandungan residu en"im manusia *sekitar (!H/ terlalu rendah untuk mendeteksi proses pompa proton pada kondisi percobaan ini. $asil ini dipertegas oleh data ang diperoleh dari garis sel trans&ektan gen wild-tpe dan tiga garis sel trans&ektan gen mutan Asp51Asn ang berbeda.
$ipotesis endosimbiosis ang diterima secara luas aitu bahwa asal muasal organel menebutkan gen asal ditrans&er ke inti selama e)olusi. Subunit 0 dan sitokrom b ang memiliki 1( dan + transmembran α-heliks, dikode oleh 6:A
mitokondria oleh semua organisme eukariot. emindahan ang terlihat berhasil dari subunit 0 ke mitokondria adalah bahwa daerah hidro&obik merupakan alat ang mencegah subunit 0 dab sitokrom b mengalami trans&er dari genom mitokondria selama e)olusi. embentukan sistem ekspresi subunit 0 tidak menggunakan metode pembentukan hibrid seperti digunakan disini karena
percobaan untuk pengangkutan apositokrom b *ang lebih kecil dari subunit 0/ ke mitokondria tidaklah berhasil.
4+2 S,r$",$r Sinar/ %ari al$r H
Struktur sinar-# dari sitokrom c oksidase bentuk teroksidasi dan tereduksi penuh pada resolusi 1.+ dan 1. memperlihatkan bahwa perubahan kon&ormasional ang besar dari Subunit 0 Asp-51 ter'adi di dekat permukaan sisi intermembran *8ambar (A/.
8ambar (A erubahan kon&ormasional redoks berpasangan dalam Asp-51. penggambaran Spektroskopi 'aringan ikatan hidrogen dalam bentuk
teroksidsi dan tereduksi penuh *struktur biru/pada resolui 1.+ dan 1. , dilihat dari sisi intermembran. 6ua histidin terikat ke 9ea *besi
erubahan kon&ormosional ini meliputi penusunan ulang interaksi ikatan hidrogen *8ambar (B/. $arga pKa dari gugus karbonil dipengaruhi oleh lingkunganna. Sebagai contoh, pKa asam asetat adalah .+ dalam air dan .5 dalam methanol. leh karenana lingkungan polar ang non aqueous dari Asp-51
dalam bentuk teroksidasi dihasilkan oleh gugus $ dari dua Ser- dan dua gugus :$- peptida. $al ini menun'ukkan bahwa Asp-51 hampir seluruhna terprotonasi
dalam bentuk tereduksi. 8ugus karboksil dari residu Asp-51 pada permukaan molekular inter membran berada dalam aqueous, menun'ukkan bahwa gugus
8ambar (B.Struktur 0katan $idrogen Asp-51 pada keadaan Teroksidasi *kiri/ dan keadaan Tereduksi *kanan/. 8aris tebal menun'ukkan permukaan molecular dimana molekul air berada pada ruang intermembran dapat diakses.erubahan kon&ormasi diinduksi oleh reduksi dari en"im ang diperlihatkan dengan struktur berwarna biru disebelah kanan. Bola berwarna biru *A/ dan hitam *B/ menggambarkan molekul air. 8aris putus-putus menun'ukkan ikatan hidrogen. anah dua menun'ukkan kemungkinan pergerakan molekul air dari Arg-4+ ke Tr-1.
8ugus karbonil dari ikatan peptida antara Tr-! dan Ser-1 dihubungkan dengan Arg-4+ oleh 'aringan ikatan hdrogen ang terdiri dari Tr-41 dan molekul penarik air kedua *9ig. (/. %olewkul air ang terikat dengan ikaan hidrohen ke Arg- 4+ berlokasi sekitar dari Tr-41. 7arak ini terlalu 'auh untuk membentuk ikatan hdrogen. %olekul air ini kemudian dapat mendekati Tr-41 untuk membentuk ikatan hdrogen setelah berpindah dari Arg-4+, ang diindikasikan oleh tanda panah bertitik. Air ang terikat antara tr-41 dan gugus
karbonil peptida 'uga terhubung dengan hdrogen ke gugus propionat dari heme
a.
Trans&er proton dimungkinkan ter'adi melalui ikatan peptida. Ketika proton ditambahkan ke gugus kmarbonil peptida, akan terbentuk asam imidat
C-3*$/M:?$-D. 7ika gugus penerima proton berlokasi dekat bagian M:?$-, proron
akan diambil untuk membentuk enol dari peptida C-3*$/M:-D. Stabilitas ang lebih besar ada pada bentuk keto *-3-:$-/ dibandingkan bentuk enol C-3*$/M:-D. erubahan kon&ormasi dari bentuk ketoenol mengindikasikan pembalikan ke bentuk keto. eptida tidak memberikan arah ang karakteristik
trans&er protonmelalui peptida ang menghalangi trans&er proton dari sisi intermembran.
Asp-51 dalam bentuk teroksidasi dihubungkan dengan ikatan hdrogen ke Ser-1 pada permukaanmolekul. ada tempat itu bentuk reduksi dari 'aringan ikatan hdrogen termasuk air ang terikat antara Asp-51 dan Ser-(!5 menghubungkan Asp-51 dengan 'aringan ikatan hdrogen terbentang ke Arg-4+ *9ig (B/. Kemudian Asp-51 dapat dilalui melalui ikatan hdrogen ke kedua sisi molekul bentuk oksidasi. Trans&er proton kebalikan dihalangi oleh ikatan peptida. 6isamping itu struktur sebelumna pada resolusi (.4(.45 menun'ukkan bahwa Asp-51 dalam bentuk teroksidasi dihubungkan ke ruang matriks oleh 'aringan ikatan hdrogen dan terkubur di dalam permukaan inter membran. Sementara itu bentuk tereduksi en"im, terdesosiasi dari 'aringan ikatan hdrogen dan terpapar ke ruang intermembran. %odel terbaru ini menun'ukan bahwa proses pompa proton
didorong oleh perubahan pKadari Asp-51 dan trans&er proton tak berarah melalui ikatan peptida berbeda halna dengan usulan ang di'elaskan sebelumna.
Besi heme a ang terikat ke enam nitrogen, *dua dari histidin dan empat
dari &or&irin/ keduana dalam bentuk teroksidasi. 6alam bentuk tereduksi , dua muatan positi& 9e(? dinetralkan oleh dua muatan negati& &or&irin. 6alam bentuk
teroksidasi, 9e4? mempunai satu muatan positi& ang belum ternetralkan.
Relokasi muatan positi& ini melalui sstem electron π-&or&irin dapat menebabkan
deprotonasi gugus bersi&at asamang berlokasi dekat heme a. struktur terbaru
Sinar-# menun'ukkan bahwa struktur heme a gugus &ormil adalah coplanar
dengan cincin &or&irin dan dapat berkon'ugasi dengan sstem electron π-&or&irin
dalam kedua bentuk oksidasi. $al ini konsisten denganbuktin resonansi Raman aitu pengaruh bentuk oksidasi besi pada karbonil &ormil ditun'ukkan oleh pergeseran )ibrasional tarikan 3- dari 1L1!-1L5! cm-1dari oksidasi heme a.
Karenana perubahan dalam bentuk oksidasi heme a dapat diharapkan
mempunai pengaruh elektrostatik ang signi&ikan terhadap Arg-4+ ang terikat dengan ikatan hdrogen ke gugus &ormil, walaupun tidak teradi perubahan kopn&ormasional ang disebabkan oleh sstem Arg-4+-&ormil *9ig (A/. resolusi terbaru dari struktur Sinar-# tidak cukup untuk meneliti perubahan kon&ormasional ang diinduksi oleh pengaruh elektrostatik 9ea. gugus propionat
heme a ang terhubung dengan ikatan hdrogen ke air ang terperangkap *9ig (/,
dapat memicu trans&er proton melewati 'aringan ikatan hdrogen, 'uga oleh pengaruh elektrostatik dari oksidasi 9ea.
Arg-4+ ang terhubung dengan ikatan hdrogen ke gugus &ormil heme a,
dimana molekul air dalam ruang matriks dapat masukmelalui saluran air. Saluran di dekat u'ung &ormil, secara skematik diperlihatkan dengan garis putus dalam gambar 4A. ruang ang dapat dilalui air pada saluran, ditentukan oleh perhitungan permukaan molekul, menun'ukkan bahwa saluran memilki lubang, ang masing-masing cukup besar untuk mengandungsatu sampai tiga molekul air *&g 4B dan ruang bertitik merah dalam 9ig 4A. gugus $ dari gugus hidro&arnesiletil dari heme a terhubung dengan ikatan hdrogen ke Ser-4+( dekat saluran airdalam
bentuk oksidasi * 9ig. 4A, struktur merah/. Selama reduksi en"im, ikatan hdrogen $NSer-4+( diputus , memungkinakn gugus $ dari gugus hidroksi&arnesiletil berotasi 1(!° dengan pergerakan dari rantai hidrokarbon dekat
gugus $ C-3$*$/-3$(-3$(-3$M3*3$4/-D dan memungkinkan rotasi 11!° dari
gugus $ Ser-4+( *9ig.4A, struktur biru/, dipasangkan dengan perubahan kon&ormasional dalam pergantian heliks-# ang termasuk Ser-4+(, Eeu-4+1 dan al-4+! *9ig.4A, struktur asam amino merah dan biru dlam $eliks-#/. perubahan kond&ormasiional ini menebabkan terbentukna lubang baru antara gugus hidroksi &arnesiletil dan $eliks-# *9ig 4A, ruang bertitik biru dengan ruang ang tidak ertitik merah dan 9ig. 4B, o)al biru/. erubahan kon&ormasional diatur olehbentuk oksidasi heme a karena ikatan hdrogen $NSer-4+( ang berlokasi
dekat sstem electron-π &or&irin heme a. posisi dan ukuran empat lubang ang
teramati dalam bentuk teroksidasi tidak dipengaruhi secara signi&ikan selama reduksi *9ig.4 ruang bertitik biru dan merah/. erubahan kon&ormasional redoks
ang dipasngkan menun'ukkan perubahan kapasitas air dalam saluran, ang sepertina memberikan kontribusi terhadap kumpulan proton e&ekti& dari ruang matriks ke Arg-4+.
8ambar 4A Struktur Sinar-# dari saluran air 'alur $. perubahan kon&ormasional redoks berpasangan dari saluran air. Bagian atas saluran ditun'ukkan. %erah dan biru menun'ukkan struktur dalam bentuk teroksidasi dan tereduksi. ermukaan bertitik merah dan biru menun'ukkan lubang ang dideteksi dalam bentuk teroksidasi dan tereduksi. 8aris putus- putus menun'ukkan 'alur pengubung air ke lubang. 8aris bertitik
menun'ukkan ikatan hidrogen. Bola kecil menun'ukkan posisi molekul air ang terikat. $is-L1 terikat ke 9ea dari sisi ang
8ambar 4B Representasi skematik dari perubahan kon&ormasional redoks berpasangan dalam saluran air. 6aerah ang diberi kotak disebut daerah A. Bola hitam dan biru menun'ukkan molekul air ang terikat. Struktur ang teramati hana pada bentuk tereduksi aitu oleh warna biru.
4+* Anali.i. 6TIR Dari Per$ahan Kon7or1a.i Rea".i Re%o". 8an-Bera.an-an
9T0R digunakan untuk mengidenti&ikasi sisi logam redoks-akti& ang mengatur kon&ormasi Asp-51. Berbeda dengan spektrum 9T0R dari keadaan teroksidasi, en"im keadaan tereduksi pada $(, Asp-51 memberikan puncak pada
dari 3$ dan 3. erbedaan spektra pada redoks dengan adana sianida dan 3 ang 'uga memberikan pita ang identik pada 1,4+ cm-1 dan 1,5+5 cm-1 .
sianida menstabilkan heme a4 pada keadaan teroksidasi. 7adi en"im tereduksi
dengan adana sianida ang dimiliki oleh heme a4, 3uA dan 3uB pada keadaan
tereduksi dan heme a4 pada keadaan sianida terikat ang berikatan. Sehingga
spektrum ang berbeda antara en"im teroksidasi pada sianida berikatan dan en"im tereduksi ang mengikat sianida menghasilkan pen'umlahan perbedaan spektra redoks ang diinduksi oleh heme a, 3uA dan 3uB. 6engan kata lain, 3o
menstabilkan 3uBdan heme a4 pada keadaan tereduksi memberikan spektra redoks
ang berbeda ang diinduksi oleh heme a, 3uA. Karena itu hasil ini
mengindikasikan bahwa keadaan terprotonasi dari Asp-51 dikendalikan oleh heme a dan 3uA.
ada titrasi reduksi en"im sapi ini terdapat sianida, dengan penurunan intensitas dua pita adalah proporsional pada ekui)alen elektron ang ditambahkan. Tiga elektron ekui)alen dibutuhkan untuk memenuhi eliminasi dari dua pita pada spektrum ang berbeda. $asil ini mengindikasikan bahwa spektra in&ra merahberubah karena single elektron ekui)alen.
Titrasi redukri& en"im sianida terikat, dimonitor menggunakan keadaan oksidasi dari tempat logam redoks akti&, heme a, 3uA dan 3uB. Sehingga 'ika dua
atau tiga elekron dibutuhkan untuk perubahan spektra in&ra merah, ma'a perubahn spektra tidak akan terlihat dibawah satu atau dua elektron secara ekui)alen.
Karena itu 3$ dari Asp-51 dipisahkan selama reduksi hana satu tempat logam, selain heme a atau 3uA.
2lektron e<ui)alen dari sitokrom c ditrans&er dari 3uA ke heme a kemudian
dari heme a ke tempat reduksi (.'adi heme a dapat memberikan tanda sebagai
tempat kontrol logam pada kon&ormasi Asp-51.
4+4 Me"ani.1e
Pro,on/P$1in-%ekanisme keseluruhan berdasarkan hasil kesimpulan adalah I ketika heme a berada pada keadaan teroksidasi, Arg-4+ terprotonasi pertama walaupun dibawah muatan positi& dari heme a, karena molekul air pada ruang matriks accessible ke Arg-4+ melalui terowongan air.Asp-51 terkubur didalam protein dan terprotonasi. Selama heme a mengalami reduksi, dimana kehilangan muatan positi& di heme a, Asp-51 keluar ke ruang intermembran dan kapasitas terowongan air meningkat. Karena itu molekul air akan bergerak ke ruang matriks, ketika proton pada Asp-51 dilepaskan ke ruang intermembran. Selama heme a mengalami oksidasi, Asp-51 bergerak ke belakang ke interior protein dan memperlihatkan muatan positi& pada heme a menurunkan a&initas dari &ormil oksigen untuk membagi proton dengan Arg-4+. penurunan akti)itas promosi proton trans&er dari Arg-4+ ke Asp-51. gugus propionat ikatan hidrogen pada air 'uga mempercepat proton trans&er sepan'ang 'aringan ikatan hidrogen.
8ambar . %ekanisme roton pumping ang diusulkan. Besi, por&irin dan gugus samping &ormil dari heme a diperlihatkandengan 9ea, r dan 3$.
3$ pada r menun'ukkan satu gugus propionat dari heme a.
Tanda kurung *C D1Oand C D!/ menun'ukkan 'umlah muatan dari enam koordinat heme Jarna kotak ang lebih hitam menun'ukkan keadaan struktur ang stabil dan keadaan intermediet.
anah tebal menun'ukan pengaruh elektrostatik dari 'umlah muatan positi& heme a dan proton trans&er selama heme a mengalami
oksidasi.
8aris putus-putus menun'ukkan ikatan hidrogen ang menghubungkan Arg-4+ dengan Asp-51,termasuk ikatan peptida ang menghalangi re)erse trans&er dari sisi intermembran.
$asil Arg-4+ ang terprotonasi mengekstrak proton dari molekul air pada terowongan air sebelum kapasitas terowongan air menurun men'adi pemaksaan keluar $-. Keikutsertaan gugus &ormil heme a dan molekul air disekitar proton
K2S0%FEA:
1. %utasi Asp-51 Asn dari en"im hati memperlihatkan &ungsi pompa proton tanpa mempengaruhi akti)itas reduksi dioksigen
(. Struktur Sinar-# *pada resolusi 1.+1. dalam bentuk teroksidasi dan reduksi penuh/ menun'ukkan bahwa muatan positi& total ang dibentuk selama
oksidasi mendorong transport proton akti& dari ruang mitokondria ke Asp-51 melewati en"im lewat saluran air dan 'aringan ikatan hidrogen, ang berlokasi di tandem.
4. $asil in&rared mengindikasikan bahwa kon&ormasi Asp-51 dikontrol hana oleh bentuk oksidasi heme spin rendah. $asil ini mengindikasikan bahwa heme
6A9TAR FSTAKA
Eehninger, E. 11. Dasar-dasar Biokimia.Alih bahasa I 6r %agg Thenawid'a'a.
2disi kedua.enerbit 2rlangga. 7akarta.
%ichel $. 1+. The %echanism o& proton pumping b ctochrome c o>idase.:AS95, 1(+1-1(+(.
Tsukihara, T., Shimokata, K., Kataama, P., Shimada $, %uromoto K, Aoama $, %ochi"uki %, Shin"awa K, Pamashita 2, Pao %, 0shimura P, Poshikawa S. (!!4.The Low Spin eme of !ytochrome c o"idase as the driving element of the proton pumping process.:AS 00.154!-154!.
Poshikawa, S., Shin"awa-0toh, K., :akashima, R., Paono, R., Pamashita, 2.,
0noue, :., Pao, %., 9ei, %. 7., Eibeu, 3. ., %i"ushima, T., et al. *1+/ Science 20; 1(4G1(.
