RISALAH MIKROBIOLOGI

1

Risalah Mikrobiologi

Risalah Mikrobiologi

RISALAH

MIKROBIOLOGI

EDISI PERTAMA

Ibnu Kharisman

Rizky Saraswati Indraputri

Annisa Pertiwi

Silvia Imnatika Fitchi Ichsani

Dewantari Saputri

Assaduddien Faras

Asisten Mikrobiologi

FK UNS 2010

3

Risalah Mikrobiologi

DAFTAR ISI

Halaman Judul………..………….…………. 1

Daftar isi………... 3

BAB I – Blok Infeksi Tropis………...……... 5

Pengenalan alat………..……... 5

Sterilisasi desinfeksi………. 11

Prosedur sampling……… 15

Media penyubur………... 23

Media transport……… 25

Media kaya………...………… 26

Media uji sensitivitas……… 29

Uji sensitivitas………...………... 30

Antibiotik………. 31

Media isolasi………...……….. 33

BAB II – Blok Respirasi….………...……... 42

Pewarnaan Sederhana……… 42

Pewarnaan Diferensial………... 42

Pewarnaan Khusus………. 42

Pengecatan Gram……….. 42

Pewarnaan Tahan Asam (BTA)……….. 44

BAB III – Blok Gastrointestinal...……….…. 47

Organisme infeksi pada saluran pencernaan………… 47

Eschericia coli……….. 47

Shigella sp……… 51

Salmonella sp……….... 56

Kleibsella sp……….. 58

Media identifikasi……….. 59

Media MacConkey…... 59

Media Eosin Methylene Blue (EMB)………... 60

Media Urea Agar…... 62

Triple Sugar Iron Agar (TSIA)………. 63

Media Simon Citrat………... 66

Sulfide Indol Motility………... 66

BAB IV – Blok Urogenital……...………... 70

Risalah Mikrobiologi

Infeksi saluran kemih………. 73

Bakteri penyebab ISK... 75

Neisseria gonorrhoeae………... 75

Chlamydia trachomatis……….. 76

Gardnerella vaginalis………. 80

Treponema pallidum……….. 82

Proteus sp. ………. 83

BAB V – Blok Kulit

………... 85

Staphylococcus sp……….………. 85

5

Risalah Mikrobiologi

BLOK INFEKSI TROPIS

Pengenalan Alat

1. Tabung A. Durham

- Fungsi : sebagai penangkap gas hasil fermentasi gula-gula

- Digunakan pada media : LDS (Lactose Single Strain) LDS (Lactose Double Strain)

BGLB (Brilliant Green Lactose Broth) Media Karbohidrat (Glukosa, Sukrosa, Laktosa, Maltosa)

B. Pembenihan

- Bahan Gelas

- Bentuk Silinder ujung bulat - Untuk media perbenihan cair/ semisolid C. C. Screw Cap

Fungsi : membiakkan virus dan bisa digunakan sebagai wadah media transport kuman enterik maupun nonenterik

BAB I

YANG KECIL DIDALAM, BUKAN YANG BESAR

Yang ada TUTUP

HITAM

Risalah Mikrobiologi

D. Centrifuge

- Bahan gelas

- Bentuk silinder ujung runcing - Untuk pereaksi/ sampel yang akan mengalami sentrifugasi sehingga didapatkan sedimentasi

E. Wasserman

- Untuk pemerikasaan serologis diagnosis Sifilis

2. Labu

A. Erlenmeyer

- Bahan gelas

- Mulut berleher sempit

7

Risalah Mikrobiologi

B. Becker Glass

Bahan gelas

Bentuk silinder garis lurus Untuk membuat larutan

3. Pipet

A. Pasteur B. Ukur

4. Piring Petri

Fungsi untuk mengambil

reagen/sampel bisa sampai dengan

endapanya

Fungsi untuk mengambil dengan

ukuran tertentu(1ml, 5ml, dll)

- Untuk pembenihan kuman - Ada 3 ukuran :

a. Kecil : diameter 5cm, untuk pembenihan jamur b. Sedang : diameter 10 cm, untuk pembenihan kuman c. Besar ; diameter 15 cm, untuk uji sensitivitas

Risalah Mikrobiologi

5. Oshe 6. Autoclave Oshe kolong Oshe Kait Oshe Jarum

- Untuk pengambilan sampel, penggoresan sampel pada media pembenihan

- Ada 3 jenis :

a. Kolong: untuk media plate/ piring petri b. Kait : untuk mengambil koloni kuman c. Jarum : untuk media padat tegak

- Fungsi untuk sterilisasi panas basah bertekanan

- Suhu 121˚celcius selama 15 menit - Bakteri akan mengalami koagulasi protein, efeknya strelisasi menjadi lebih cepat

9

Risalah Mikrobiologi

7. Hot Air Oven

8. Anaerobic Jar

9. Inkubator

- Untuk Sterilisasi panas kering secara tidak langsung

- Suhu 175˚ C selama 90 menit

- Bakteri akan mengalami oksidasi protein - Bahan yang dapat disterilkan :

Pipet, piring petri, bahan dari gelas, dll

- Untuk menumbuhkan kuman anaerob - Contoh kuman:

Clostridium tetani, Bacilus fragilis

- Bagian terdiri dari :

Gas Generating kit, Indikator (misalnya

phenol red yang apabila dalam keadaan anaerob, akan berubah dari merah

menjadi biru), Katalisator palladium

- Bahan baja, terdapat pengaturan suhu - Untuk inkubasi kuman

Risalah Mikrobiologi

10. Quebec Colony Counter

11. Penyudip

- Menghitung jumlah koloni kuman secara semi otomatis

- Terdapat LUP, zona pembagian, display jumlah kuman, dan lampu

Spatel lidah

Spreader

Kapas lidi

Spatel lidah : bahan plastik, bentuk panjang pipih, untuk fiksasi lidah pada pengambilan swab (apusan) tenggorok

Spreader : bahan kaca, untuk menyebarkan spesimen urin di media agar plate.

Kapas lidi : lidi dengan ujung kapas steril, untuk swab spesimen.

11

Risalah Mikrobiologi

12. Saringan udara (air filter)

STERILISASI DESINFEKSI

STERILISASI = proses destruksi/membunuh semua bentuk kehidupan

mikroorganisme termasuk spora dan virus dengan cara mekanik, tekanan, maupun radiasi.

DESINFEKSI = proses membunuh mikroorganisme pathogen dalam bentuk

vegetatif (kecuali spora dan virus) yg dilakukan terhadap benda dengan bahan kimia. JENIS-JENIS STERILISASI 1. Fisik A. Panas 1) basah a. Tanpa Tekanan i. Pasteurisasi

Cara sterilisasi bakteri patogen dan non patogen pada susu. Suhu yang digunakan pada pasteurisasi sekitar 670 C selama satu jam. Pasteurisasi pada susu dilakukan selama 3 hari berturut-turut pada waktu yang sama, suhu yang sama, dan lama pasteurisasi yang sama.

ii. Boilling water

Sterilisasi dalam air dengan suhu 100˚ C selama 10-15 menit. - Alat khusus untuk menganalisa

kontaminan udara (mikroorganisme di udara)

- Menilai udara dengan kecepatan 100 L/menit. Alat ini akan

menyaring udara dan menanamnya dalam cawan petri berukuran 100 mm

Risalah Mikrobiologi

b. Tekanan

Autoclave : sterilisasi dengan uap air dengan tekanan 1,5 atm, suhu 121˚C, selama 15 menit. Untuk membunuh bakteri dan spora.

2) Kering

- Waktu lebih lama, suhu lebih tinggi - Dengan cara :

a. Flamming (flambir)

memanaskan alat dengan cara melewatkannya diatas api tanpa pemijaran (tidak sampai berpijar)

fungsi : mensterilkan skalpel, pinset dan mulut tabung. b. Pembakaran (red heat/incineration)

cara ini 100% efektif tetapi mempunyai keterbatasan

fungsi : mensterilkan oshe, membakar bangkai binatang percobaan dan sampah medis. Alat : incinerator.

c. Udara panas (hot air sterilization/Oven)

Pemanasan oven dg suhu tinggi 160˚-180˚ C, 1 jam.

Caranya: dengan memanaskan udara dalam oven dengan listrik atau gas.

Fugsi : mensterilkan alat-alat dari kaca seperti cawan petri, pipet, tabung reaksi,erlemeyer, alat suntik, perban, dsb.

B. Radiasi

1) Gamma ( Elektromagnetik )

Panjang gelombang < 1 nm  daya penetrasinya tinggi  bakteri vegetatif dan spora

Fungsi : sterilisasi alat-alat farmasi, alat-alat disposable (sarung tangan, spuit, benang jahit, kateter, dll), vaksin dan makanan tahan lama

2) Ultraviolet

Panjang gel 220-290 nm, paling efektif 260 nm  daya penetrasi rendah  tidak dapat digunakan pada material tertutup dan endospora.

13

Risalah Mikrobiologi

C. Mekanik/Filter

Digunakan dengan metode filtrasi/penyaringan terutama untuk larutan yang rusak dengan pemanasan, contoh : serum dan enzim. Macam-macamnya :

1) Menyaring cairan

Hai ini dapat dilakukan dengan berbagai filter seperti :

a. Saringan Sietz : mempergunakan bahan asbestos sebagai alat penyaringnya.

b. Berkefeld : mempergunakan filter terbuat dari tanah diatome. c. Chamberland : mempergunakan filter terbaru dari porselen. d. Fritted glass filter : mempergunakan filter terbuat dari serbuk

gelas.

e. Cellulose Asetat : pada industri minuman. Kelemahan : banyak filtrat tersisa pada saringan, virus lolos, hanya sekali pakai 2) Menyaring Udara

Untuk menjaga udara tempat penyimpanan alat, agar alat (labu, tabung) yang sudah steril tidak tercemar oleh kuman, atau untuk menjaga agar suatu biakan kuman tidak tercemar oleh kuman lain, maka alat-alat tersebut harus ditutup dengan kapas yang mudah ditembus udara tetapi dapat menahan mikroorganisme. Untuk mencegah pencemaran oleh mikroorganisme udara pada waktu perbenihan, dapat menggunakan suatu alat yang disebut laminar

flow bench dimana udara yang masuk ke dalamnya disaring terlebih

dahulu dengan suatu saringan khusus. Menggunakan penyaring HIPA (High-Efficiency Particulate Air). Filter terdiri dari lipatan selulose asetat.

D. Kimiawi

1. Alkohol

- Paling efektif untuk sterilisasi dan desinfeksi

- Mendenaturasi protein dengan jalan dehidrasi => membran sel rusak & enzim tdk aktif

2. Halogen

- Mengoksidasi protein kuman 3. Yodium

- Konsentrasi yg tepat tdk mengganggu kulit - Efektif terhadap berbagai protozoa

4. Klorin

Risalah Mikrobiologi

- Desinfeksi ruangan, permukaan serta alat non bedah 5. Fenol (as. Karbol)

- Mempresipitasi protein secara aktif, merusak membran sel, menurunkan tegangan permukaan

- Standar pembanding untuk menentukan aktivitas suatu desinfektan

6. Peroksida (H2O2)

- Efektif dan nontoksik - Molekulnya tidak stabil

- Me-nonaktifkan enzim mikroba 7. Gas Etilen Oksida

- Mensterilkan bahan yang terbuat dari plastik

Efektivitas sterilisasi kimia dipengaruhi oleh:

- konsentrasi - suhu

- jumlah kuman - lama paparan - pH bahan kimia

- Mudahnya kontak dengan mikroorganisme

JENIS-JENIS DESINFEKSI

- Disinfektan yang tidak berbahaya bagi permukaan tubuh dapat digunakan dan bahan ini dinamakan antiseptik.

- Antiseptik adalah zat yang dapat menghambat atau menghancurkan mikroorganisme pada jaringan hidup, sedang desinfektan digunakan pada benda mati. Desinfektan dapat pula digunakan sebagai antiseptik atau sebaliknya tergantung dari toksisitasnya terhadap jaringan. Macam-macam desinfektan yang digunakan:

1. Alkohol (etil/propil alkohol) - Desinfeksi kulit

- Alkohol yang dicampur dengan aldehid digunakan dalam bidang kedokteran gigi untuk desinfeksi permukaan gigi

2. Aldehid (Glutaraldehid) - Desinfektan yang kuat

- Glutaraldehid 2% dapat dipakai untuk mendesinfeksi alat-alat yang tidak dapat disterilkan

15

Risalah Mikrobiologi

- Efektif terhadap bakteri vegetatif seperti M. tuberculosis, fungi, dan virus akan mati dalam waktu 10-20 menit, sedang spora baru mati setelah 10 jam.

3. Biguanid (Klorheksidin)

- bidang kedokteran gigi sebagai antiseptik dan kontrol plak - zat ini sangat aktif terhadap bakteri gram (+) maupun gram (-) - efektivitasnya pada rongga mulut terutama disebabkan oleh

absorpsinya pada hidroksiapatit dan salivary mucus. 4. Senyawa halogen

- hipoklorit dan povidon-iodin adalah zat oksidasi dan melepaskan ion halida

- murah dan efektif

- menyebabkan karat pada logam dan cepat diinaktifkan oleh bahan organik (misalnya chloros, domestos, dan betadine).

5. Fenol

- larutan jernih, tidak mengiritasi kulit dan dapat digunakan untuk membersihkan alat yang terkontaminasi oleh karena tidak dapat dirusak oleh zat organik

- bersifat virusidal dan sporosidal yang lemah

- sebagian besar bakteri dapat dibunuh oleh zat ini, banyak digunakan di rumah sakit dan laboratorium.

6. Klorsilenol

- tidak mengiritasi

- aktifitasnya rendah terhadap banyak bakteri dan penggunaannya terbatas sebagai desinfektan (misalnya Dettol).

PROSEDUR SAMPLING

1. Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel merupakan hal terpenting dalam mengidentifikasi bakteri penyebab penyakit. Dalam pelayanan pemeriksaan mikrobiologi, terdapat 3 fase, yaitu: pre analitik, analitik, dan post analitik.

- Fase pre analatik merupakan fase dimana dimulainya pengambilan spesimen, pelabelan spesimen, pengisian lembar pemeriksaan, hingga pengiriman spesimen.

- Fase analitik sendiri merupakan proses pengujian spesimen klinik, dimulai dari pewarnaan, kultur, identifikasi, atau uji sensivitas

Risalah Mikrobiologi

antibiotika. Bidang pemeriksaannya yaitu, bekteriologi, virologi, fungi, biologi molekuler, serologi.

- Fase post analitik yaitu fase dimana hasil pemeriksaan mikrobiologi di analisis, penyimpanan spesimen, serta pelaporan dan kerja sama dengan tim pengendalian infeksi di rumah sakit serta dinas kesehatan setempat.

Ada beberapa hal yang harus kita perhatikan dalam pengambilan sampel. Pertama harus meminimalkan kontaminasi. Hal kedua yang diperhatikan yaitu tepat dalam pemilihan waktu pengambilan. Ketiga, Jumlah specimen harus mencukupi untuk dilakukan kultur. Hal keempat yang harus diperhatikan yaitu gunakanlah kontainer yang sesuai. Kelima, diperhatikan yaitu sampel diambil sebelum pemberian antibiotik(ab). Keenam, sebelum dikirim diberi label dan dipastikan tidak bocor. Ketujuh, meminimalkan waktu pengiriman atau memaksimalkan penggunaan media transport. Kedelapan, dilakukan sesuai dengan aturan pengambilan spesimen. Terakhir, jenis spesimen yang diambil sesuai dengan jenis permintaan pemeriksaan.

Pengambilan sampel harus memerhatikan poin-poin yang telah disebutkan diatas. Apabila ada sampel yang tidak sesuai dengan poin-poin diatas, maka pengambilan sampel pasien dapat ditolak. Kriteria penolakan spesimen, yaitu:

A. Tidak dilabel dengan benar.

B. Waktu penyimpanan atau pengiriman yang terlalu lama.

C. Kontainer rusak atau tidak sesuai dengan jenis spesimen/pemeriksaan. D. Bukan sputum tetapi air liur.

E. Pengambilan spesimen yang tidak sesuai dengan jenis pemeriksaan yang diminta.

F. Swab kering. G. Dll.

Prosedur sampling merupakan pemindahkan sampel atau kultur bakteri dari satu tempat ke tempat yang lain secara aseptis (terhindar dari kontaminasi). Prosedur sampling ada bermacam-macam yaitu:

17

Risalah Mikrobiologi

- Kultur darah yaitu pengambilan sampel yang spesimennya berupa darah. Indikasi dari kultur darah yaitu bakteriemia, septikemia, syok pasca operasi yang tidak jelas sebabnya, demam beberapa hari yang tidak jelas sebabnya, demam mengigil pada pasien dengan: infeksi luka bakar, ISK, infeksi jaringan yang progresif. Sepsis pasca operasi, cathether IV/intraarteri.

Prioritas : urgen

Teknik pengambilan: Pungsi vena (v.mediana cubiti) Jumlah : Dewasa 10-30 ml, anak 1-5 ml Wadah : vacutainer dengan anticoagulan Desinfeksi lokasi pungsi: Alkohol 70% & Betadine Pengiriman : 2 jam, suhu ruangan

Catatan:

A. Kultur darah sebaiknya dilakukan sebelum terapi Ab B. Kultur darah diulang dengan mempertimbangkan diagnosis

C. Jangan melakukan kultur darah lebih dari 3x24 jam, karena tidak meningkatkan hasil inokulasi

D. Sampel bisa diambil dari beberapa lokasi untuk menghindari kontaminasi flora kulit

E. Pikirkan kemungkinan infeksi anaerob dengan mengambil sampel dan mengirimkan didalam anaerobic bag.

- Kultur Urin

Kultur yang mengambil urin sebagai spesimennya. Indikasi dari kultur urin, yaitu infeksi saluran kemih (ISK) dan sepsis.

Prioritas : Rutin Wadah : Pot steril

Desinfeksi : Sabun antiseptik Pengiriman : segera, Ice boxed

Risalah Mikrobiologi

Macam-macam teknik pengambilan sampel urin:

Gambar pengambilan sampel urin. Teknik yang digunakan yaitu

Midstream flow, dengan jumlah 30-50 ml.

Gambar pengambilan sampel urin dengan teknik suprapubic punture. Jumlah yang diambil adalah 20 ml.

19

Risalah Mikrobiologi

Gambar pengambilan sampel urin dengan uretral catheter. Jumlah yang diambil yaitu 15 ml.

Catatan dalam kultur urin:

• Urine pagi hari sangat ideal untuk kultur, karena jumlah bakteri terbanyak didapatkan

• Minimal jumlah urine 3-5 ml - Kultur tulang/jaringan

Indikasi : osteomielitis, TB tulang Prioritas : efektif

Teknik Pengambilan : Biopsi, operasi Jumlah : beberapa serpih

Wadah : tabung berisi medium cair steril/NaCl steril Desinfeksi : menurut protap OK

Pengiriman : segera, suhu ruang

Gambar pengambilan sampel tulang/jaringan dengan teknik biopsy. Catatan kultur tulang/jaringan

• Sertakan apusan dari lokasi pengambilan sampel pada gelas obyek untuk pemeriksaan mikroskopis

Risalah Mikrobiologi

• Sertakan sampel darah untuk dilakukan kultur darah sebagai bahan konfirmasi hasil

- Kultur cairan sendi

Indikasi : septik arthritis Prioritas : urgen

Teknik pengambilan : pungsi intaarticular Jumlah : min 1 mL

Wadah : tabung berisi medium cair steril Desinfeksi : alkohol 70% dan betadin Pengiriman : segera, suhu ruang - Kultur LCS

21

Risalah Mikrobiologi

Indikasi : encephalitis, meningitis Prioritas : urgen

Teknik pengambilan : lumbar puncture

Jumlah : 1 mL Wadah : tabung steril

Desinfeksi : alkohol 70% dan betadine Pengiriman : segera, suhu ruang - Kultur luka

Indikasi : komplikasi trauma, komplikasi pembedahan, infeksi-infeksi melalui kulit

Prioritas : rutin

Teknik : swab (surface wound) dan aspirasi (deep wound) jumlah : -

Wadah : tabung berisi medium transport steril dan syringe steril dan anaerobic bag

Desinfeksi : alkohol 70%

Risalah Mikrobiologi

Catatan kultur luka :

• Kultur anaerob hanya dilakukan pada abses tertutup, untuk luka terbuka tidak dilakukan kultur anaerob

• Selalu sertakan smear eksudat, untuk pemeriksaan mikroskopis pada kultur wound

• Pastikan prosedur tindakan seluruhnya dilakukan dengan aseptik/steril untuk menghindari kontaminan

• Jangan mengambil sampel pus di permukaan luka, harus dari dasar luka

Setelah sampel pasien diambil, saatnya untuk dilakukan penanganan spesimen. Hal-hal yang dilakukan, yaitu:

23

Risalah Mikrobiologi

• Kultur rutin dilakukan pada media : Agar darah, agar coklat dan MacConkey (kultur pada media lain disesuaikan dengan permintaan). • Pewarnaan Gram dari koloni yang tumbuh.

• Identifikasi.

• Uji sensitivitas antibiotika.

• Uji lanjutan jika ada dugaan multi resisten (ESBLs, MRSA, MDR TB dll).

MEDIA PENYUBUR

1. Alkaline peptone water

Alkaline peptone water adalah media penyubur untuk spesies Vibrio sp. (mis. Vibrio cholerae dan Vibrio parahaemolyticus). Media cair pada

suhu ruangan dan berwarna kuning.

Komposisi media ini adalah protein dari jaringan hewan dan NaCl (sebagai pemelihara keseimbangan osmotik). Media ini digunakan untuk menyuburkan Vibrio sp. yang jumlahnya sedikit pada sampel sebelum di tanam di media selektif seperti TCBS agar. Diinkubasi selama 18-2 jam pada suhu 37˚C. media penyubur digunakan saat pasien dalam keadaan

convalescent, pasien yang dicurigai asimptomatis, dan

spesimen dari lingkungan. Vibrio sp. akan tumbuh dengan cepat 6-8 jam setelah inkubasi.

Gambar : Alkaline peptone water steril.

2. Selenite cystine broth

Selenite cystine broth adalah media selektif penyubur untuk Salmonella sp. dan beberapa strain shigella sp. pada sample feses, urin,

dan alat kesehatan penting lainnya. Kandungan media ini adalah natrium fosfat, pepton, laktosa, natrium selenit, dan L-Cystein.

Selenite cystine broth digunakan terutama untuk membatasi kurangnya

sensitivitas yang disebabkan oleh media penyubur lainnya khususnya dalam produk makanan dengan komposisi materi organik seperti telur atau bubuk telur.

Risalah Mikrobiologi

Media ini direkomendasikan untuk mendeteksi salmonella pada keadaan non-akut ketika organisme hanya terdapat dalam jumlah kecil pada feses, dan untuk studi epidemiologi untuk mendeteksi salmonella dari pasien yang asimtomatis atau konvalesen.

Media ini menghambat pembelahan bakteri seperti Coliform, tetapi mendukung Salmonella untuk tumbuh dengan mudah. Pepton yang tedapat pada media ini merupakan sumber nitrogen, vitamin, dan asam amino essensial untuk bakteri. Laktosa digunakan sebagai sumber karbohidrat, natrium selenit menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan hampir seluruh bakteri Gram negatif, kecuali Salmonella. L-Cystin berfungsi untuk menurunkan toksisitas natrium selenit dan sebagai tambahan adalah sulfur organik.

Sejumlah 1-2 gr sampel ditanam di media ini berasal dari feses, sampel makanan atau materi padat lainnya. Inokulasi dan inkubasi pada suhu 35 ± 2˚C selama 18-24 jam.

MacConkey

MacConkey adalah media isolasi bakteri Gram negatif dan juga sebagai media diferensiasi (pembeda) fermentasi laktosa terutama untuk keluarga

enterobacteriae dan genus pseudomonas. Adanya kristal violet dan garam

empedu menyebabkan Gram positif tidak bisa tumbuh dikarenakan keduanya dapat merusak membran bakteri Gram postif. mengandung pepton, laktosa, dan NaCl.

25

Risalah Mikrobiologi

Bakteri yang memfermentasi laktosa akan menyebabkan suasana dalam media menjadi asam dengan menurunnya pH sehingga menyebabkan koloni kuman berwarna merah. Untuk bakteri yang memfermentasi kuat laktosa koloninya akan dikelilingi lingkaran warna merah muda dan yang lemah tidak dikelilingi lingkaran merah muda.

Bakteri yang tidak memfermentasi laktosa tidak akan menghasilkan reaksi apapun (netral) sehingga koloni akan berwarna putih. Dari ini dapat disimpulkan bahwa bakteri yang memfermentasi laktosa bersifat non-patogen dan yang tidak memfermentasi laktosa bersifat patogen.

Gambar : agar Mac Conkey dengan bakteri yang mampu memfermentasikan laktosa (kanan) dan tidak memfermentasikan laktosa (kiri).

MEDIA TRANSPORT

Media transport adalah media untuk menaruh bakteri dan melindungi bakteri agar tetap hidup ketika pemeriksaan harus ditunda. Biasanya penundaan dilakukan untuk mengirim spesimen dari suatu tempat ke laboratorium mikrobiologi.

1. Carry and Blair

Medium ini adalah modifikasi dari medium Stuart. Perbedaannya ada pada improvisasi system buffer dengan mengganti sodium glycerophosphate dengan inorganic phosphates. Formulasi ini digunakan untuk meningkatkan pertumbuhan Enterobacteriaceae dan untuk mempertahankan Salmonella dan Shigella dalam waktu yang lama. Media ini memiliki potensi oksidasi/reduksi rendah, yang menjamin kelangsungan hidup bakteri untuk jangka waktu yang lama. Medium ini memiliki kandungan nutrisi yang rendah dan buffer fosfat,

Risalah Mikrobiologi

bersama dengan Sodium thioglycollate, yang menghambat pertumbuhan besar strain seperti Escherichia coli dan Klebsiella aerogenes. Agar NO2 adalah agen memperkuat. Karena pH tinggi, Carry-Blair dikatkan sangat baik untuk studi epidemiologi dari Vibrio parahemolyticus. Panjang waktu pemulihan telah dilaporkan untuk Salmonella dan

Shigellae (49 hari). Dan medium ini untuk bakteri Gram negatif. Pada

praktek klinis, sering digunakan untuk rectal swab. 2. Amies

Medium ini digunakan untuk memastikan pemeliharaan mikroorganisme tidak berlebihan. Medium ini inorganic buffer dan biasa digunakan untuk bakteri Gram negatif. Pada praktek klinis, sering digunakan untuk nasopharyngeal swab.

3. Stuart

Medium ini mengandung kalsium klorida bersama dengan sodium Glycerophosphate yang bertindak sebagai agen penyangga/ buffer yang baik dan juga menjaga keseimbangan osmotik dalam medium. Medium ini semi solid, non-nutrient yang mencegah proliferasi mikroba. Oleh karena itu, medium ini memberikan tanda yang adekuat pada keberadaan bakteri anaerob dengan indikator methylene blue. Jika botol menunjukkan warna biru, seluruh medium harus dibuang. Komposisi medium ini memastikan bahwa mikroorganisme mampu bertahan untuk jangka waktu yang lama. medium ini dapat digunakan untuk bakteri Gram positif dan negatif. Pada praktek klinis, sering digunakan untuk

nasopharyngeal swab.

Media Kaya

Berdasarkan tingkatannya, media kaya merupakan media yang mengandung zat-zat kimia dan mengandung zat organik tingkat tinggi, seperti serum, darah, dan telur, dll. Hal ini dikarenakan, media kaya digunakan untuk pertumbuhan bakteri tertentu yang tidak dapat tumbuh dalam media sederhana, misalnya: Gonococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium, dll. Bakteri tersebut membutuhkan

penambahan zat-zat organik dari makhluk hidup misalnya darah, telur, dll. Contoh media kaya, yaitu

1. Agar Darah

Agar darah merupakan media kaya untuk pertumbuhan beberapa bakteri. Media ini digunakan untuk membedakan bakteri berdasarkan

27

Risalah Mikrobiologi

kemampuan menghemolisis. Media ini dibuat dari tripic soy agar dengan 5% darah domba.

Gambar : tripic soy agar dengan darah domba dan tanpa darah domba.

Intepretasi hemolisis pada agar darah dapat dikategorikan sesuai dengan tipe kemampuan hemolisis bakteri.

- Beta hemolitikus (β) didefinisikan sebagai lisis darah penuh. Bagian disekitar koloni berwarna transparan. Banyak spesies dari bakteri yang memproduksi toksik yang dapat menghancurkan sel darah merah. Contoh dari tipe ini adalah Streptococcus

beta-hemolyticus species, Streptococcus pyogenes,dll.

Gambar koloni bakteri dengan tipe beta-hemolyticus.

- Alpha hemolitikus (α) bekerja dengan cara mereduksi hemoglobin pada sel darah merah menjadi methemeglobin di sekitar koloni bakteri. Hal ini menyebabkan

Risalah Mikrobiologi

warna disekitar koloni pada media, yaitu hijau atau coklat. Beberapa sumber menyebut alpha-hemolyticus dengan “partial

hemolysis” atau hemolisis sebagian.

Gambar alpha-hemolyticus streptococcus species grup viridans (Streptococcus mutans, mitis, dan salivarius grup)

- Gamma hemolitikus (γ) yaitu tipe yang berlawanan dengan tipe hemolisis lainnya. Gamma mengindikasi kurangnya kemampuan bakteri dalam menghemolisis. Tidak ada reaksi yang terjadi pada media disekitar koloni atau bakteri tidak dapat menghemolisa agar darah.

Gambar enterococcus yang merupakan salah satu tipe gamma

hemolysis.

2. Agar Coklat

Media ini merupakan media yang digunakan untuk mengisolasi dan menamam bakteri tertentu. Media agar coklat merupakan media kaya yang dapat memfasilitasi pertumbuhan Haemophilus influenzae, Neisseria

gonorrhoeae dan Neisseria meningitidis. Salah satu sumber pembuatan

media coklat adalah darah domba yang dipanaskan, sehingga memberi warna coklat pada media.

29

Risalah Mikrobiologi

MEDIA UJI SENSITIVITAS

Mueller-Hinton agar

Mueller-Hinton (MH) agar adalah media yang direkomendasikan untuk uji sensitivitas antimikroba dengan metode Kirby-Bauer untuk bakteri

nonfastidious yang di standardisasi oleh the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). MH mengandung penghambat mikroba seperti

sulfonamid, trimetoprim, dan tetrasiklin yang rendah.

Pada awalnya MH digunakan sebagai media tanam untuk Neisseria. Tetapi, saat ini lebih banyak menggunakan media selektif. Agar ini direkomendasikan untuk uji sensitivitas antimikroba metode Kirby-Bauer pada bakteri patogen aerob dan fakultatif anaerob, seperti Staphylococcus,

enterobacteriaceae, batang Gram negatif (Pseudomonas sp., Acitenobacter sp., enterococci dan vibrio cholerae. Metode ini dimodifikasi untuk menguji fastidious species (spesies bakteri yang membutuhkan lingkungan dengan

nutrisi yang lebih kompleks) mis. Haemophilus influenzae, Neisseria

gonorrhoeae, S. pneumoniae dan Streptococcus.

Komposisi MH : ekstrak daging, karbohidrat, agar, asam hidrosilat dari Casein.

Pada suhu ruangan pH agar MH antara 7,2 dan 7,4. Jika pH <7,2 beberapa antibiotik akan kehilangan potensinya (mis.aminoglikosid, quinolon, dan makrolid), dan agen lainnya menunjukkan aktivitas yang berlebihan (tetrasiklin). Jika pH >7,4, kelebihan timidin atau timin dapat membalikkan efek hambatan terhadap sulfonamides dan trimetoprim sehingga menghasilkan zona hambat yang lebih kecil atau tidak ada zona hambatan sama sekali.

Gambar : media padat datar mueller hinton steril (kiri) dan yang telah diinokulasi dan diberi antibiotik-metode Kirby Bauer (kanan)

Konsentrasi kation seperti kalsium dan magnesium dapat mempengaruhi efek aminoglikosid dan tetrasiklin terhadap Pseudomonas aeruginosa. Konsentrasi kation yang berlebihan dapat menghasilkan memperkecil zona

Risalah Mikrobiologi

hambatan dan jika sebaliknya, akan memperbesar ukuran zona hambatan. Kelebihan kalsium memperbesar zona hambatan P. aeruginosa terhadap daptomisin. Dan jika ion zink yang berlebihan akan memperkecil zona hambatan carbapenems terhadap P. aeruginosa.

UJI SENSITIVITAS

Uji sensitivitas adalah uji untuk melihat kepekaan suatu kuman terhadap antimikroba dengan melihat besar zona hambat pada media pembenihan. Dari uji sensitivitas ini didapatkan MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration). MIC bertujuan untuk mengetahui kadar minimal suatu antibiotika yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Dan MBC adalah konsentrasi terendah dari antimikroba yang akan mencegah pertumbuhan organisme setelah subkultur ke media bebas antibiotik.

Uji sensitivitas ini ada beberapa macam metode, dilusi (pengenceran) dan difusi (cakram). Untuk metode dilusi tidak kita pelajari lebih lanjut, yang dipelajari adalah metode difusi. Metode Difusi juga memiliki beberapa macam metode. Ada metode Flemming dan metode Kirby Bouer.

Metode Kirby Bouer :

Metode ini merupakan metode yang paling sering digunakan namun hanya dapat mengetahui nilai MIC saja. Dan hasil dari uji ini dapat mengetahui apakah antimikroba tersebut resisten atau sensitif terhadap mikroba yang ditanam dalam media pembenihan.

Dalam melakukan metode ini harus memperhatikan beberapa hal :

 Menggunakan disk antimikroba yang telah distandarkan konsentrasinya yakni 0,5 Mc Farlant

 Menggunakan medium standar yang telah ditentukan (medium Muller hinton Agar)

 Menggunakan kuman yang telah distandarkan jumlahnya (108)  telah diidentifikasi, hanya satu jenis kuman

 Masa inkubasi ditentukan kurang lebih 18 jam

 Sensitivitas ditentukan dengan mengukur diameter zona hambatan yang terbentuk

31

Risalah Mikrobiologi

Setelah diinkubasi, kemudian ukurlah zona hambat antimikroba. Dan cocokan kedalam table untuk dinilai apakah termasuk Sensitif, intermediet atau resisten.

Antibiotik

Antibiotik merupakan zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba (terutama fungi yang dapat menghambat atau membasmi mikroba jenis lain.

Zona Hambat inilah yang diukur

diameternya. Kemudian dicocokan

kedalam tabel apakah termasuk

kedalam antimikroba yang sensitif,

intermediet (sedang) atau resisten.

Disk Antimikroba

Untuk jenis obat,

memiliki inisial

masing-masing.

Exp :

Amoxicilin ;

AMX

Risalah Mikrobiologi

Cara Kerja Antibiotik :

1. Inhibitor Sintesis Dinding Sel

Pada antibiotik penisilin berkerja mengikat protein PB yang akan merusak dinding sel yang akan membuat sel bengkak dan berlanjut pecah dan mati. Contoh lainya : golongan Beta laktam, vancomisin. 2. Inhibitor fungsi dinding sel

Normalnya sel plasma pada bakteri mempunyai fungsi permeabilitas selektif. Fungsi antimikroba disini adalah menganggu transport mikronutrien bakteri tersebut, sehingga tidak dapat mengendalikan komposisi intrasel yang akan menyebabkan kerusakan sel tersebut. Contoh : imidazol, triazoles.

3. Inhibitor Sintesis Protein

Antibiotik disini akan menggagu sintesis protein yang berada pada ribosom sel bakteri, contoh antibiotiknya adalah aminoglikosida (subunit ribosom 30s) dan Chloramphenicol (subunit ribosom 50s). 4. Inhibitor Sintesis DNA

Pada antibiotik rifampisin akan berikatan dengan enzim DNA polimerase yang akan mengganggu sintesis DNA.

5. Inhibitor dari Proses Metabolisme Sel

Sulfonamid mengganggu fungsi metabolisme pada sel bakteri di jalur asam folat untuk sintesis DNA.

33

Risalah Mikrobiologi

MEDIA ISOLASI

Media isolasi adalah media yang mengandung bahan-bahan tertentu baik bahan alami ataupun sintetis yang menyebabkan hanya bakteri atau organisme tertentu saja yang dapat tumbuh dengan optimal. Bakteri atau organisme lainnya kemungkinan dapat tumbuh juga namun tidak optimal atau bahkan tidak dapat tumbuh sama sekali. Pada pembahasan kali ini, media isolasi yang akan kita bahas adalah media Lowenstein Jensen, Kudoh, Brucella agar, Thioglycolate, Fletcher, Saborroud, TCBS, Thayer martin, dan Bordet Gengou. Selain media-media tadi, masih banyak lagi media isolasi yang lainnya.

1. Lowenstein jensen

Formula / Liter aquadest L-Asparagine 3.6 g Kalium Fosfat 2.5 g Magnesium Sulfat 0.24 g Natrium Citrate 0.6 g Malachite Green 0.4 g Tepung Kentang 30 g Suplemen Gliserol, 12 mL Suspensi telur, 1000 mL

Risalah Mikrobiologi

Media ini menggunakan suspensi telur dan gliserol untuk isolasi dan diferensiasi dari Mycobacterium sp. Telur digunakan karena dapat menumbuhkan banyak varietas dari mycobacterium sp. Gliserol dan suspensi telur menyediakan sumber asam lemak dan protein yang dibutuhkan untuk metabolisme Mycobacterium sp. Kalium fosfat dan magnesium sulfat mendukung pertumbuhan dan bertindak sebagai buffer. Natrium citrate dan malachite green adalah agen yang selektif untuk mencegah pertumbuhan kotaminan dan menginisiasi pertumbuhan mycobacteria.

Gambar. Media Lowenstein Jensen dengan koloni M. tuberculosis

2. Kudoh

Media ini sebagian besar bahannya sama dengan media Lowenstein Jensen. Kegunaannya pun sama yaitu untuk isolasi Mycobacterium sp. Yang menjadi pembeda adalah adanya tidak adanya sentrifugasi dalam proses pembuatan medianya. Proses pembuatan yang lebih praktis dan simpel inilah yang membuat media Kudoh lebih banyak digunakan di daerah rural dan memiliki prevalensi TBC tinggi seperti di Asia Tenggara.

Gambar. Media Kudoh dengan koloni M.

35

Risalah Mikrobiologi

3. Brucella agar Formula (dalam g/L) Pepton 10.00 NaCl 5.00 Glukosa 10.00 Agar 15.00 Ekstrak daging sapi 5.00

Suplemen

(1 vial 500 ml dalam medium) Nystatin 50000 UI Natamycin 25.0 mg Bacitracin 12500 UI Vancomycin 10.0 mg Polymyxin B 2500 UI Nalidixic Acid 2.5 mg

Gambar. Brucella agar dengan koloni Brucella sp.

Brucella agar digunakan untuk kultur dan isolasi dari Brucella sp. bakteri anaerob yang menyebabkan penyakit brucellosis, suatu penyakit yang ditularkan oleh hewan ataupun produk hewani seperti susu dan daging yang terinfeksi. Ekstrak daging sapi dan pepton pada media ini berguna sebagai sumber karbon dan energi. NaCl berguna untuk sumber elektrolit untuk keseimbangan osmotik. Penambahan suplemen berupa beberapa berbagai macam antibiotik (lihat tabel) menyebabkan media ini selektif untuk pertumbuhan Brucella sp.

4. Fletcher

Formula (gram/liter) Jaringan hewan yang telah dicerna oleh enzim pepsin 0.300

Ekstrak daging sapi 0.200

NaCl 0.500

Agar 1.500

Risalah Mikrobiologi

Leptospira sp. yang menyebabkan penyakit leptospirosis merupakan

organisme yang sangat kecil sehingga susah diamati dengan media biasa. Cara yang paling reliabel untuk diagnosis laboratorium adalah dengan melakukan kultur dari darah atau cairan cerebrospinal pada minggu pertama sakit atau dari urine saat infeksi atau beberapa minggu setelahnya.

Inkubasi dilakukan pada suhu ruangan dan dalam kondisi gelap selama lebih dari 6 minggu. Leptospira sp. akan berada pada beberapa cm di bawah permukaan. Material yang diambil setelah inkubasi ini kemudian diwarnai dengan pengecatan Giemsa dan diperiksa di bawah iluminasi mikroskop medan gelap. Leptospira sp. akan bergerak dengan ciri khas

corkscrew motility.

Selain mengandung bahan-bahan dasar, media ini juga mengandung serum kelinci dan thiamine yang berfungsi menopang pertumbuhan

Leptospira sp.

5. Sabouraud agar Formula (per liter)

Nama Media dan Bahan BD Sabouraud Glucose Agar BD Sabouraud Agar dengan Penicillin dan Streptomycin BD Sabouraud Agar dengan Gentamicin dan Chloramph-enicol BD Sabouraud Agar dengan Chloramp-henicol pencernaan Kaseinoleh enzim pankreas 5.0 g 5.0 g 5.0 g 5.0 g Pencernaan jaringan tubuh hewan oleh pepsin 5.0 5.0 5.0 5.0 Glucose 40.0 40.0 40.0 40.0 Agar 15.0 15.0 15.0 15.0

37

Risalah Mikrobiologi

Penicillin G - 60000 IU - - Streptomycin - 0.06 g - - Gentamicin - - 0.04 - Chlorampheni col - - 0.4 0.4 pH pH 5.6 +/- 0.2 5.6 +/- 0.2 5.6 +/- 0.2 5.6 +/- 0.2 Sabouraud Agar digunakan untuk kultur dan isolasi dari fungi, terutama yang diambil dari sampel klinis yang kemungkinan terkontaminasi bakteri. Pepton pada Sabouraud Agar adalah sumber nitrogen dan growth factor. Glukosa merupakan sumber energi. Konsentrasi glukosa yang tinggi memberikan keseimbangan osmotik untuk pertumbuhan fungi, sebagian besar bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi glukosa yang tinggi. Selain glukosa dapat digunakan dekstrosa sebagai sumber gula dan energi. pH yang rendah juga menunjang pertumbuhan fungi, sementara banyak bakteri yang tidak dapat tumbuh pada pH yang rendah.

Selain bahan-bahan dasar, media Sabouraud Agar juga ditambah dengan antibiotik untuk menginhibisi pertumbuhan bakteri. Chloramphenicol merupakan antibiotik broad spectrum yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif dan Gram positif. Antimikroba lainnya seperti penicillin, gentamicin, dan streptomycin atau kombinasinya juga telah diketahui efektif untuk menghambat pertumbuhan bakteri tanpa menghambat pertumbuhan fungi.

Gambar. Sabouraud Agar dengan beberapa koloni fungi

Risalah Mikrobiologi

6. Thiosulfate citrate bile sucrose agar (tcbs agar) Formula ( g/l) Pepton dari kasein 5.0 sukrosa 20.0 Pepton dari daging 5.0 Natrium Klorida 10.0 Ekstrak ragi 5.0 Besi (III) citrat 1.0 Natrium citrat 10.0 thymol blue 0.04 Natrium thiosulfat 10.0 bromothymol blue 0.04

ox bile 5.0

Agar-agar 14.0 Natrium cholate 3.0

Media ini ditujukan untuk menumbuhkan Vibrio cholerae dan golongan Vibrio sp. yang pathogen lainnya seperti V. parahaemolyticus. Adanya koloni V. cholerae ditunjukkan dengan adanya perubahan warna indikator bromthymol blue dari biru menjadi kuning karena ada perubahan pHdari basa menjadi asam. Thiosulfat dan citrat berkonsentrasi tinggi serta bersifat alkali kuat pada media ini dapat menghambat pertumbuhan enterobacteriaceae. Cairan empedu (bile) dan cholate dapat mensupresi pertumbuhan Enterococcus.

Bakteri coliform mungkin dapat tumbuh pada media ini, namun tidak dapat memetabolisme sukrosa sehingga tidak ada perubahan warna indikator. Tetapi beberapa strain Proteus dapat memetabolisme sukrosa dan membentuk koloni vibrid-like yang berwarna kuning.

Gambar. TCBS Agar dengan koloni

Vibrio cholerae

39

Risalah Mikrobiologi

7. Thayer martin

Media Thayer Martin sebenarnya adalah modifikasi dari media Mueller Hinton Agar (lihat pada subbab Uji Sensitivitas Antibiotik) dengan penambahan 5% darah domba dan beberapa antibiotik. Oleh karena itu, media ini juga dikenal dengan sebutan Modified Thayer Martin (MTM). Modifikasi ini bertujuan untuk mengisolasi pertumbuhan Neisseria

gonorrhoeae, bakteri Gram negatif penyebab penyakit gonorrhea atau

kencing nanah.

Antibiotik yang biasanya digunakan pada media Thayer Martin adalah:

- Vancomycin, berguna untuk membunuh organisme Gram positif, walaupun kadang beberapa organisme Gram positif seperti

Lactobacillus sp. dan Pediococcus sp. resisten pada vancomycin.

- Colistin, berguna untuk membunuh sebagian besar organisme Gram negatif kecuali Neisseria. Namun ada organisme Gram negatif lainnya yang resisten terhadap colistin, yaitu Legionella sp.

- Nystatin, dapat membunuh sebagian besar fungi.

- Cotrimoxazole (SXT), menginhibisi pertumbuhan bakteri Gram negatif, terutama Proteus.

8. Bordet gengou

Formula per liter dalam aquades BD Bordet Gengou Agar with 15% Sheep Blood

BD Bordetella Agar with Charcoal and 7% Horse Blood

Kentang, Infusi padat 4.5 g Ekstrak daging sapi 10.0 g Kaseinyang telah dicerna

oleh pancreas

5.0 Gelatin yang telah dicerna enzim pankreas

10.0

Gambar.

Media

Modified

Thayer Martin dengan koloni N.

gonorrhoeae yang diambil dari

usapan cervix pasien gonorrhea

Risalah Mikrobiologi

Jaringan hewan yang telah dicerna oleh enzim pepsin

5.0 Serat terlarut 10.0 NaCl 5.5 Charcoal yang telah

diaktifkan)

4.0

Agar 20.0 NaCl 5.0

Cefalexin 0.04 Niacin (asam nikotinik) 0.01

Glycerol 10.0 ml Cefalexin 0.04

Darah domba yang telah didefibrinasi

15% Darah kuda yang telah didefibrinasi

7%

pH 7.2 +/- 0.2 Agar 12.0 g

pH 7.4 +/- 0.2

Bordet Gengou adalah media yang digunakan untuk isolasi dan kultur

Bordetella pertussis. Semua spesies Bordetella adalah pathogen pada sel

epitel siliaris saluran pernapasan. Bordetella pertussis diketahui sebagai penyebab penyakit pertusis atau batuk rejan (batuk 100 hari). B.

parapertussis juga diketahui sebagai panyebab penyakit serupa yang lebih

sedang pengaruhnya. B. bronchiseptica adalah pathogen pada hewan, namun juga dapat menyebabkan bronchitis dan pneumonia pada manusia.

Bordetella pertussis merupakan organisme yang sulit untuk dikultur.

Banyak substansi yang dapat menghambat pertumbuhan B. pertussis, termasuk asam lemak pada saluran pernapasan atau kapas pada aplikator yang digunakan untuk mengambil sampel. Oleh karena itu, pengambilan sampel untuk diagnosis pertussis tidak boleh menggunakan swab dengan aplikator. Pengmabilan sampel yang sesuai adalah dengan menggunakan alat penyedot (suction). Serat yang ada pada infusi kentang dan charcoal (arang) berperan sebagai adsorbent yang dapat menyerap asam lemak. Gliserol digunakan sebagai sumber karbon. NaCl berfungsi untuk menjaga

Gambar. Bordet Gengou agar dengan

koloni Bordetella pertussis

41

Risalah Mikrobiologi

keseimbangan osmotik pada media. Penambahan darah domba dan darah kuda menyediakan growth factor dan mengurangi toksisitas dari peroksida.

DAFTAR PUSTAKA

Buxton, Rebecca (2013). Blood Agar plates and hemolysis protocols. Diakses di http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/2885-blood-agar-plates-and-hemolysis-protocols

Challis JA (2008). Sterilization, Disinfection, and Antisepsison Practical Handbook of Microbiology Second Edition. CRC : London

Jaspe RC et.al. (2009). Evaluation of the kudoh swab method for culturing of mycobacterium tuberculosis in rural area. Tropical Medicine

International Health. 14(4), pp:468-471

Jawetz, Melnick & Adelberg’s (2007). Medical Microbiology: 22th Edition. McGrowHill.

Kudoh S, Kudoh T (1974). A simple technique for culturing tubercle bacilli.

World Health Organization. 51, pp: 71-82

Murray, PR et.al. (2007). Manual of clinical microbiology, 9th edition.

American Society of Microbiology, Washington, D.C.

Murray, R. P., et al (1999). Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology Publishing, Washington, D.C. 20005.

Ryan KJ (2004). Leptospirosis: clinical aspect. Dalam Ryan KJ, Ray CG.

Sherris medical microbiology: an introduction to infectious disease 4th edition. McGraw-Hill: New York.

Staf Pengajar Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (1994). Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta. Bina Rupa Aksara.

Summerbell, R.C (2003). Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, and

agents of superficial mycoses. Dalam: Murray, P. R., E. J. Baron,

J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, dan R. H. Yolken (ed.). Manual of

clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology,

Washington, D.C.

Tim laboratorium mikrobiologi FK UNS. Buku petunjuk praktikum untuk mahasiswa pendidikan dokter.

U.S. Pharmacopeial Convention, Inc. (2009). The U.S. Pharmacopeia 32/The

national formulary 27--2009. U.S. Pharmacopeial Convention, Inc.,

Risalah Mikrobiologi

BLOK RESPIRASI

PEWARNAAN SEDERHANA

Mengapa kita harus melakukan pewarnaan bakteri.

Bakteri memiliki refraksi yang sama seperti air sehingga jika dilihat di bawah mikroskop akan terlihat opak (putih) dan hampir tidak terlihat. Oleh karena itu dilakukan prosedur pewarnaan untuk membuat sel dan struktur didalamnya dapat lebih terlihat dibawah mikroskop cahaya.

Cat (stain)adalah zat yang menempel pada sel yang dapat memberikan warna. Warna inilah yang dapat membuat bakteri lebih terlihat dan juga berfungsi untuk membedakan tipe mikroorganisme atau untuk bagian spesifik dari mikroorganisme.

Terdapat 3 jenis perwarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple staining), pewarnaan diferensial, dan pewarnaan spesial.

Pewarnaan sederhana dapat digunakan untuk melihat bentuk, ukuran, dan susunan bakteri. Untuk melihat bakteri harus dilakukan pengecatan karena bakteri transparan. Pewarnaan ini hanya menggunakan satu jenis cat,misalnya methylen blue, safranin, fuchsin basis, dan kristal violet.

Pewarnaan diferensial

Menggunakan 2 atau lebih cat dan membuat mikroorganisme dapat dikategorikan menjadi beberapa grup atau tipe. Pengecatan Gram dan ZN merupakan contoh dari pewarnaan diferensiasi.

Pewarnaan khusus

Untuk mewarnai struktur khusus dalam bakteri. Misalnya Endospora menggunakan metode schaeffer-fulton, Kapsul dengan metode negatif, dan Flagella menggunakan pewarnaan gray.

PENGECATAN GRAM

Pengecatan Gram adalah metode pengecatan bakteri yang digunakan secara luas untuk identifikasi bakteri. Metode ini diperkenalkan oleh seorang dokter dari Denmark bernama Hans Christian Joachim Gram pada tahun 1884.

Sebelum mengenal lebih jauh tentang pewarnaan Gram, mari kita lihat dulu struktur sel bakteri:

43

Risalah Mikrobiologi

Skema sederhana dari pengecatan Gram adalah sebagai berikut:

Pewarna pertama adalah crystal violet yang berwarna ungu. Selanjutnya diberikan kalium iodide (KI) sebagai mordant, KI menyebabkan denaturasi protein dinding sel bakteri Gram positif sehingga warna pertama terjebak pada dinding sel dan menyebabkan warna crystal violet pada dinding sel terlihat lebih jelas. Selanjutnya bakteri diberikan alcohol 90% sebagai decolorizer atau peluntur. Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna pertama karena memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tebal. Selanjutnya diberikan

Risalah Mikrobiologi

Note:

Bakteri yang tahan terhadap peluntur akan mempertahankan pewarna

pertama  Berwarna ungu-> Gram positif

Bakteri yang tidak tahan terhadap peluntur akan menyerap pewarna

kedua  Berwarna merah-> Gram negatif

Tidak semua bakteri dapat diwarnai dengan pewarnaan Gram, contohnya pada genus Mycobacterium yang mempunyai dinding sel yang dilapisi lilin (wax) yang terbentuk dari asam mikolat.

PEWARNAAN TAHAN ASAM (BTA)

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, ada beberapa golongan bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan Gram, salah satunya adalah golongan Mycobacterium sp yang dikenal juga sebagai golongan bakteri tahan asam (BTA). Dinding sel bakteri tahan asam terdiri dari peptidoglikan, arabinogalaktan, dan lipid. Kandungan 50% dari lipid dinding sel BTA adalah asam mikolat, yang kemudian membentuk lapisan seperti lilin yang menyebabkan cat susah masuk ke dalam dinding sel bakteri. Contoh bakteri tahan asam:

- Mycobacterium tuberculosis - Nocardia sp

- Mycobacterium lepra - Actinomyces sp

Terdapat berbagai macam metode pewarnaan tahan asam, yaitu: metode Ziehl Nielsen, Metode Kinjoun Gabbet, dll. Bakteri tahan asam setelah diberi pewarna pertama akan tahan terhadap pencucian dengan asam dan alkohol sehingga tidak mengikat pewarna kedua. Hal ini dikarenakan adanya asam mikolat yang menyebabkan bakteri sukar diwarnai. Agar dapat mewarnai bakteri tahan asam maka perlu menghilangkan lapisan asam mikolat pada dinding sel dengan cara pemanasan atau dengan deterjen.

Metode Ziehl Nielsen:

- Zat warna pertama (merah) + Pemanasan - Pemanasan

- Peluntur (HCl dan Alkohol) - Zat warna kedua (biru)

45

Risalah Mikrobiologi

Prosedur pewarnaan tahan asam Ziehl Nielsen:

Kandungan pewarna yang digunakan: - Cat ZN A : Fuchsin basis

Alkohol 96% Fenol 5% in Aqua - Cat ZN B : HCl

Alkohol 95% - Cat ZN C : Methylene blue Cara kerja Praktikum:

Pewarna pertama: Fuchsin basis Menghilangkan lipid: pemanasan Peluntur: Alkohol dan HCl Pewarna kedua: Methylen Blue

Risalah Mikrobiologi

Setelah terwarnai, bakteri tahan asam akan mempertahankan pewarna pertama (merah) dengan sangat kuar dan tahan terhadap asam dan alkohol. Bakteri tidak tahn asam akan melepaskan pewarna pertama dan mengikat pewarna kedua (biru).

Hasil:

- BTA (+): Bakteri berwarna merah dengan latar belakang biru - BTA (-) : Bakteri berwarna biru dengan latar belakang biru Daftar Pustaka

Tim Laboratorium Mikrobiologi FK UNS. 2012. Buku petunjuk praktikum

47

Risalah Mikrobiologi

BLOK GASTROINTESTINAL

Pada bab ini kita akan membahas dua hal, yaitu organisme penyebab infeksi pada saluran pencernaan dan media yang digunakan untuk mengidentifikasi organisme tersebut.

A. ORGANISME PENYEBAB INFEKSI PADA SALURAN PENCERNAAN

Ada banyak sekali organisme yang menyebabkan infeksi pada saluran pencernaan. Buku ini hanya akan membahas sedikit organisme yang menyebabkan infeksi pada saluran pencernaan.

ESCHERICHIA COLI

E. coli merupakan bakteri yang habitat normalnya berada di intestinal

manusia dan hewan. Keberadaannya menandakan adanya fecal contamination pada air dan makanan.

Morfologi

 gram negative (-)

 Family enterobacteriaceae  Batang soliter

 Flagel petrichous

 Memiliki beberapa strain.  Tidak berspora

 Aerob atau fakultatif anaerob  Beberapa memiliki kapsul  Suhu optimal 37o

C

Fisiologi

E. coli dapat beradaptasi dalam usus (secara anaerob) atau di luar usus

(secara aerob atau anaerob). Bakteri ini dapat hidup di media glukosa maupun

Risalah Mikrobiologi

bahan organik. Selain meragi glukosa, bakteri ini juga meragi laktosa. Hal ini yang menandakan bahwa bakteri ini sebenarnya non patogen. Sampai pada beberapa strain memiliki patovar yang bervariasi seperti EPEC, ETEC, EIEC, dan EHEC. Beberapa strain juga dapat menunjukkan hemolisis tipe β.

Uji Biokimia

 Indol (+)  Asetat (+)

 peragian laktosa (+)  gas & glukosa (+)

 Lisin dekarboksilase (+/-)  Motilitas (+/-)

Faktor-Faktor Patogenitas

Bakteri E. Coli memiliki beberapa faktor Patogenitas

1) Antigen permukaan

 Antigen O (somatik)

Bagian terluar dinding sel polisakarida dan terdiri dari unit berulang lipopolisakarida. Tahan terhadap panas dan alkohol. Sedangkan antibodi terhadap antigen O adalah IgM.

 Antigen H (flagella)

Terletak pada flagella dan dapat didenaturasi atau dihilangkan oleh panas atau alcohol. Aglutinasi dengan antibodi anti-H, terutama IgG.

 Antigen K ( permukaan atau amplop)

Pada bakteri E. Coli ini, antigen K berupa polisakarida. Aktivitas aglutinasinya dapat diganggu dengan antiserum O.

2) Enterotoksin

 Toksin LT (termolabil)

Toksin LT ini merangsang enzim adenil siklase yang terdapat didalam sel epitel mukosa usu halus. Kemudian toksin LT ini menyebabkan peningkatan aktivitas enzim tersebut dan terjadinya peningkatan permeabilitas sel epitel usus. Sehigga terjadi akumulasi cairan dalam usus yang mengakibatkan diare. inaktivasi pada suhu 60˚C selama 30 menit.

 Toksin ST (termostabil)

Toksin ST merupakan asam amino dengan berat molekul 1970 Dalton, yang mempunyai satu atau lebih ikatan disulfide yang berperan penting dalam mengatur stabilitas pH 7 dan suhu

49

Atlas Mikrobiologi

37oC. Toksin ini juga merupakan ―colonization factor” dan

memiliki toleransi suhu sampai 100˚C. 3) Eksotoksin

Mengakibatkan keracunan makanan yang serius pada manusia yaitu diare berdarah.

4) Hemolisin

Mengakibatkan terjadinya hemolisis pada eritrosit.

5) Kolisin

Merupakan toksin yang menyebabkan E.coli dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain dan menyebar ke bagian-bagian tubuh manusia yang terinfeksi.

Patogenesis 1) Diare

Penyakit yang sering ditimbulkan oleh E. Coli adalah DIARE. Berikut adalah penyakit diare yang berkaitan. E. Coli yang menyebabkan diare sangat sering ditemukan di seluruh dunia. E, Coli ini diklasifikasikan oleh cirri khas sifat – sifat virulensinya dan setiap grup menimbulkan penyakit melalui mekanisme yang berbeda, antara lain:

 Enteropathogenic E. coli (EPEC).

Penyebab penting diare pada bayi, khususnya di Negara berkembang. EPEC melekat pada sel mukosa yang kecil. Faktor yang diperantarai secara kromosom menimbulkan pelekatan yang kuat. Akibat dari infeksi EPEC adalah diare cair yang biasanya sembuh sendiri taetapi dapat juga kronik. Lamanya diare EPEC dapat diperpendek dengan pemberian anibiotik. Diare terjadi pada manusia, kelinci, anjing, kucing dan kuda. Seperti ETEC, EPEC juga menyebabkan diare tetapi mekanisme molekular dari kolonisasi dan etiologi adalah berbeda. EPEC sedikit fimbria, ST dan LT toksin, tetapi EPEC menggunakan adhesin yang dikenal sebagai intimin untuk mengikat inang sel usus. Sel EPEC invasive (jika memasuki sel inang) dan menyebabkan radang.  Enterotoxic E. coli (ETEC).

Penyebab yang sering dari “diare wisatawan” dan sangat penting menyebabkan diare pada bayi di Negara berkembang. Faktor kolonisasi ETEC yang spesifik untuk menimbulkan pelekatan ETEC pada sel epitel usus kecil. Lumen usus terengang oleh cairan dan mengakibatkan hipermortilitas serta diare, dan berlangsung selama beberapa hari. Beberapa strain ETEC

Atlas Mikrobiologi

menghasilkan eksotosin tidak tahan panas. Prokfilaksis antimikroba dapat efektif tetapi bisa menimbulkan peningkatan resistensi antibiotic pada bakteri, mungkin sebaiknya tidak dianjurkan secara umum. Ketika timbul diare, pemberian antibiotic dapat secara efektif mempersingkat lamanya penyakit. Diare tanpa disertai demam ini terjadi pada manusia, babi, domba, kambing, kuda, anjing, dan sapi. ETEC menggunakan fimbrial adhesi (penonjolan dari dinding sel bakteri) untuk mengikat sel – sel enterocit di usus halus. ETEC dapat memproduksi 2 proteinous enterotoksin: dua protein yang lebih besar, LT enterotoksin sama pada struktur dan fungsi toksin kolera hanya lebih kecil, ST enterotoksin menyebabkan akumulasi cGMP pada sel target dan elektrolit dan cairan sekresi berikutnya ke lumen usus. ETEC strains tidak invasive dan tidak tinggal pada lumen usus.

 Enterohemorrhagic E. coli (EHEC).

Penyebab penyakit “diare berdarah”. Menghasilkan verotoksin, dinamai sesuai efek sitotoksinya pada sel Vero, suatu sel hijau dari monyet hijau Afrika. Terdapat sedikitnya dua bentuk antigenic dari toksin. EHEC berhubungan dengan holitis hemoragik, bentuk diare yang berat dan dengan sindroma uremia hemolitik, suatu penyakit akibat gagal ginja akut, anemia hemolitik mikroangiopatik, dan trombositopenia. Banyak kasus EHEC dapat dicegah dengan memasak daging sampai matang. Diare ini ditemukan pada manusia, sapi, dan kambing.

 Enteroinvasive E. coli (EIEC).

Menyebabkan penyakit yang sangat mirip dengan shigellosis. Penyakit terjadi sangat mirip dengan shigellosis. Penyakit sering

terjadi pada anak – anak di Negara berkrmbang dan para

wisatawan yang menuju ke Negara tersebut. EIEC melakukan fermentasi laktosa dengan lambat dan tidak bergerak. EIEC menimbulkan penyakit melaluii invasinya ke sel epitel mukosa usus. Diare ini ditemukan hanya pada manusia.

 Enteroaggregative E. coli (EAggEC).

Menyebabkan diare akut dan kronik pada masyarakat di Negara berkembang. Bakeri ini ditandai dengan pola khas pelekatannya pada sel manusia. EAggEC menproduksi hemolisin dan ST enterotoksin yang sama dengan ETEC.

51

Atlas Mikrobiologi

2) Infeksi Saluran Kemih (ISK)

Penyebab yang paling lazim dari infeksi saluran kemih dan merupakan penyebab infeksi saluran kemih pertama pada kira – kira 90% wanita muda. Dengan gejala sering miksi, disuria, hematuria, dan piura. Kebanyakan infeksi ini disebabkan oleh E. Coli dengan sejumlah tipe antigen O.

3) Sepsis

Bila pertahanan inang normal tidak mencukupi, E. Coli dapat memasuki aliran darah dan menmyebabkan sepsis. Bayi yang baru lahir dapat sangat rentan terhadap sepsis E. Coli karena tidak memiliki antibodi IgM. Sepsis dapat terjadi akibat infeksi saluran kemih.

4) Meningitis

E. Coli merupakan salah satu penyebab utama meningitis pada

bayi.

SHIGELLA

Genus Shigella terbagi menjadi 4 spesies, yaitu S. dysenteriae, S. flexneri,

S. boydii, dan S. sonnei. Setiap spesies ini, kecuali S. sonnei, memiliki

beberapa serotype. Pada umumnya, S. sonnei lebih sering ditemukan di negara maju sedangkan S. flexneri dan S. dysenteriae lebih sering di negara berkembang.

Shigella adalah bakteri gram negatif yang berbentuk batang ramping.

Coccobacillar dapat ditemukan pada biakan muda. Shigella adalah bakteri fakultatif anaerob tapi dapat hidup dengan baik secara aerob. Koloni yang dapat diamati setelah 24 jam berbentuk cembung, circular, transparan dengan diameter kira-kira 2 mm.

Semua shigellae memfermentasikan glukosa. Tetapi, tidak memfermentasikan laktosa kecuali Shigella sonnei. Spesies shigella dapat dibedakan dengan yang memfermentasi manitol dan yang tidak. Bakteri ini nonmotil, tidak memproduksi gas dan H2S. Habitat normal bakteri ini terbatas

pada traktus intestinal pada manusia dan primata lainnya.

Struktur antigen

Antigen O somatik Shigella adalah polisakarida. Terdapat 40 serotype yang diklasifikasikan berdasarkan reaksi biokimia dan antigen.

Patogenesis

Infeksi shigella hampir selalu terbatas pada traktus gastrointestinal, kasus penyebaran lewat hematogen sangat jarang. Shigella sangat menular, dosis

Atlas Mikrobiologi

infektif untuk menyebabkan penyakit hanya membutuhkan 103 organisme (biasanya butuh 105–108 bakteri untuk salmonellae dan vibrio). Proses patologis yang penting adalah invasi ke sel epitel mukosa dengan menginduksi fagositosis, keluar dari vakuola fagositik, multiplikasi dan menyebar melalui sitoplasma sel epitel, dan berlanjut ke sel sebelahnya.

Mikroabses di dinding usus besar dan ileum terminal akan berlanjut menjadi nekrosis membran mukosa, ulkus superfisial, perdarahan, dan pembentukan pseudomembran pada area ulkus tersebut. Jika di ambil jaringan di area ini, akan ditemukan fibrin, leukosit, debris sel, membran mukosa yang nekrotik, dan bakteri. Jika proses tersebut mereda, akan digantikan dengan jaringan granulasi yang mengisi ulkus dan terbentuk jaringan parut.

Toksin

Semua shigella melepas toksin berupa lipopolisakarida. Endotoksin ini mungkin merupakan penyebab iritasi dinding usus besar.

Shigella dysenteriae eksotoksin

Shigella dysenteriae memproduksi shigatoksin, prototipe untuk famili shigalike toksins (verocutotoksins), yang juga terdapat di beberapa

Enterobacteriaceae lainnya. Shigatoksin menambah kerusakan sel epitel kolon, diare dengan feses cair (watery) pada onset shigellosis dan berkurang frekuensinya pada hemolytic-uremic syndrome (HUS)

S. dysenteriae type 1 (Shiga bacillus) memproduksi heat-labile ekxotoksin yang mempengaruhi usus dan sistem saraf pusat. Eksotoksin adalah

antigen dan letal untuk eksperimen terhadap hewan. Bekerja sebagaimana enterotoksin, eksotoksin menyebabkan diare seperti verotoksin E. coli, mungkin dengan proses yang sama. Pada manusia, eksotosin juga menghambat penyerapan gula dan asam amino di usus halus. Aktivitas neurotoksin mungkin dapat memperparah infeksi S.dysenteriae dan reaksi sistem saraf pusat (mis. Meningismus, coma). Pasien dengan infeksi Shigella

flexneri atau Shigella sonnei mengembangkan antitoksin yang menetralisis

eksotoksin secara in vitro. Terjadi dua proses perkembangan infeksi, toksin yang diproduksi pada awal infeksi menyebabkan diare sangat banyak tanpa darah dan selanjutnya jika terjadi invasi pada usus besar akan menyebabkan diare dengan darah dan pus.

Gejala klinis

Setelah periode inkubasi (1-2 hari), terdapat onset tiba-tiba nyeri abdomen, demam, dan diare (watery diarrhea). Sehari setelah adanya onset, infeksi berlanjut pada usus halus dan kolon menyebabkan feses lebih banyak, kurang cair tapi sering disertai mucus dan darah. Setiap gerakan peristaltik

53

Atlas Mikrobiologi

usus, disertai dengan tegangan dan tenesmus (spasme rectal), menyebabkan nyeri abdomen bagian bawah. Lebih dari setengah kasus pada dewasa, demam dan diare reda dengan sendirinya pada hari ke 2-5. Namun, pada anak-anak dan lansia, hilangnya cairan dan elektrolit dapat menyebabkan dehidrasi, asidosis, dan bahkan kematian. Penyakit yang diakibatkan S. dysenteriae seringkali berat.

Pada penyembuhan, hampir seluruh orang yang terjangkit basil disentri dapat terjadi infeksi kronik dan mungkin terjadi penyakit yang rekuren. Setelah sembuh dari infeksi, orang yang terinfeksi menghasilkan antibodi terhadap shigella, tetapi antibodi ini tidak melindungi diri terhadap reinfeksi.

Komplikasi

Infeksi S. dysenteriae serotipe 1 dapat menyebabkan komplikasi seperti kejang, sepsis, prolaps rectum, atau toksik megacolon. Komplikasi yang lebih sering adalah hemolytic-uremic syndrome (HUS) yang ditandai dengan triad anemia hemolitik, trombositopenia, dan gagal ginjal. Kondisi HUS dapat bervariasi mulai yang ringan dengan penyembuhan cepat, atau dapat berat dengan disertai gagal ginjal dan kematian. Komplikasi lainnya yang dapat disebabkan oleh S. dysenteriae adalah perdarahan usus masif dan peritonitis perforatif, sedangkan infeksi S. sonnei biasanya hanya menyebabkan diare.

Uji laboratorium

Diagnosis ditegakkan dengan identifikasi kultur kuman patogen. Spesimen yang digunakan untuk kultur dapat berupa feses segar, mucus, dan swab rectum. Kombinasi media selektif/indikator dilakukan untuk kultur primer. Kultur dapat dilakukan dengan penanaman bakteri pada media diferensial (cont: MacConkey atau EMB) dan media selektif (Hektoen enteric agar atau salmonella-shigella agar). Pada pemeriksaan mikroskopis mungkin dapat terlihat leukosit dan beberapa eritrosit.

Serovar ditentukan dengan antisera spesifik dengan uji aglutinasi. Orang normal sering memiliki aglutinin untuk melawan beberapa spesies shigella. Namun, penentuan titer antibodi mungkin menunjukkan peningkatan antibodi spesifik. Pemeriksaan serologi tidak digunakan untuk menegakkan diagnosis infeksi shigella.

Imunitas

Infeksi shigella akan diikuti dengan respon antibodi spesifik. Injeksi shigella yang telah dimatikan menstimulasi produksi antibodi dalam serum tetapi tidak dapat melindungi manusia untuk melawan infeksi. IgA yang ada di usus menjadi penting untuk membatasi reinfeksi pada penelitian vaksin