makurofaji yurai no nitric oxide ni yoru kan saibo sankateki DNA shogai no kento

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). マクロファージ由来の nitric oxide による肝細胞酸化的DNA傷害の検討 渡部, 直行(Watanabe, Naoyuki) 石井, 裕正(Ishii, Hiromasa) 慶應医学会 2003 慶應医学 (Journal of the Keio Medical Society). Vol.80, No.2 (2003. 6) ,p.T111- T122 学位論文 Journal Article http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=AN00069296-20030601 -0111.

慶應 医 学 ・82(2):T111∼T122,2003. 学位論文. マ ク ロ フ ァ ー ジ 由 来 のnitric. oxideに. よ る 肝 細 胞 酸 化 的DNA傷. 害 の検 討. 慶應義塾大学医学部内科学教室 (指導:石 井裕正教授) 渡. 部. 直. 行. (平成14年12月13日. Key words:splenic. 受 付). macrophage, nitricoxide, peroxynitrite,DNA. damage,8-hydroxy-deoxyguanosine. (8-OH-dG) ウ イル ス,細 菌 お よ び 寄生 虫 感 染 や ア ス ベ ス ト暴 露 な. で 有 意 に 高 値 で あ り,ま. た 腹 水 を 伴 う非 代 償 性 肝 硬 変 患. ど に よ る慢 性 的 な 炎 症 状 態 が,宿 主 の 発 癌 リス クを 高 め. 者 で 特 に そ の 上 昇 が 著 し い と報 告 さ れ て い る.ま. る こ と は多 くの 研 究 か ら明 らか で あ り,肝 臓 病 学 の 領 域. 硬 変 患 者 の 血 清NO値. た,肝. は 血 清 エ ン ド トキ シ ン と 正 の 相. にお いて も慢 性 肝 疾患 は肝 細 胞 癌 の 発 生 母 地 で あ る こ と. 関 を 示 し,抗. が 知 られ て い る.慢 性 肝 疾 患 に お い て肝 細 胞 の壊 死 再. と と も にNO値. 生 の サ イ クル の 病 的 な 充 進 と不 規 則 再 生 が 肝 発 癌 の 原 因. トキ シ ン血 症 と 密 接 に 関 与 す る こ と も示 さ れ て い る8).. と な る と考 え られ て い る1,2).. こ の 場 合 に 肝 臓 内 に お け るNO産. Nitric oxide(以. 下NO)が. 血 管内皮 由来の平滑筋 弛. 生 物 質 投 与 に よ る エ ン ド トキ シ ン血 症 改 善. 細 胞9,10),Kupffer細. 緩 因 子 と して 発 見 され,そ の 後 極 め て 多 くの 研 究 が な さ. フ ァ ー ジ14),伊. れ た結 果,NOが. NO産. 消化 器 病 の 領 域 に お い て平 滑 筋 弛 緩,. は 低 下 す る こ と か ら, NO産. 胞11),好. 生 細 胞 と し て,内. 中 球12),肝. 細 胞13),マ. 東 細 胞15)が 考 え ら れ,cNOSを. 生 は 内 皮 細 胞 で,. iNosを. 介 し たNO産. 生 は主 に. 患 にお いて も血 行 動 態,肝 障 害,抗 腫 瘍 活 性 な どの 様 々. れ る と 考 え ら れ る.こ. な病 態 生 理 に関 す る こ とが 明 らか にな って き た3∼6).. 態 に よ っ て 異 な り,Rockey16・")ら. に よ る と,肝. お い て は 内 皮 細 胞 由 来 のcNOSの. 低 下が報 告 されて い. type NO合. type NO合. 成 酵 素(以. 成 酵 素(以 下cNOS). 産 生 さ れ た 場 合 と, inducible. る.Kupffer細. 下iNOS)を. ンlipopolysaccharide(以. 介 して 多 量 のNO. interleukin-1(以. る と され て い る。 微 量 のNOは. 以 下TNF-a),. 主 にcGMP濃. 度 を上 昇. 下LPS)単. 下IL-1),. tumor. Interferon-y以. に関 係 す る 可 能 性 が あ る.反. れiNosを. 放出は. 発 現 し,多. 種 々 な機 序 を 介 して 細 胞,組 織 傷 害 や 炎 症 を 助 長 す る と. 肝 細 胞 はLPS単. い う,い わ ゆ るNOの. TNF-aと. 二 面 性 が指 摘 さ れ て い る.. 肝 臓 に炎 症 が 生 じて い る状 態,す. なわ ち肝 炎 や 肝 硬 変. necrosis. 量 のNOを. factor-a. どの炎症性 サ. 産 生 す る18,19).一 方,. 独 刺 激 で はNOを. 産 生 し な い がIL-1,. い っ た サ イ トカ イ ン の 同 時 添 加 に てiNosを. 発 現 し,多. 量 のNOを. 産 生 す る と さ れ,事. 細 胞 と の 共 培 養 に て も 肝 細 胞 がNOを. か ら放 出 され る活性 酸 素 の過 剰 産 生 が 認 め られ て い る7).. 報 告 さ れ て い るzo,zi).ま た,伊. 特 に,肝. IL-1,. 性 酸 素 の一 つ で あ るNO. らに は. り い っ そ う活 性 化 さ. に罹 患 して い る場 合 に は ヒ トや 動 物 の 体 内 で,炎 症 細 胞. 硬 変 症 に お い て,活. 硬 変 に. 独,さ. 下IFN-yな. イ トカ イ ン を 加 え る こ と に よ り,よ. 量 のNOの. 生 能 は,病. ラ ム 陰 性 の 細 菌 性 エ ン ド トキ シ. させ る ことで 細 胞 傷 害 を 抑 制 し,さ らに組 織 修 復 や 再 生 面,多. ク ロ フ ァー ジで行 わ. れ ら の 個 々 のNO産. 胞 は,グ. が 産 生 され た 場 合 で はそ の 代 謝 及 び生 物 学 的 活 性 が 異 な. 中 球,マ. クロ. 介 した. Kupffer細. 一 般 にconstitutive. 細 胞,好. 皮. 粘 膜 血 流 調 節,分 泌 調 節 機 構 に関 与 して い る こ と,肝 疾. を 介 し て 微 量 のNOが. 胞,肝. 生 はエ ン ド. TNF一 α, IFN-y刺. 実,. Kupffer. 産 生 す る こ とが. 東 細 胞 に 関 して もLPS,. 激 に よ りiNOSを. 発 現 しNO. の過 剰 産 生 が,血 清 中 に認 め られ て お り,Guarnerら8). を 産 生 す る こ と が 報 告 さ れ て い る15).多 量 に 放 出 さ れ た. に よ る と健 常 人 のNOの. NOは,細. 本 論 文 は,Watanabe derived. nitric. oxide.. レベ ル に比 して,肝 N,. Free. Miura Radical. S,. Zeki. Biology. S,. 硬変患 者 Ishii. H:Hepatocellular. Medicine.30(9):1019-1028,2001の. 一TII1一. 胞 傷 害 因 子 と して 働 き, DNA合 oxidative. DNA. injury. 一 部 を 含 む.. induced. by. 成,蛋 macrophage-. 白合.

慶 鷹 医学. 成,ミ. 80巻2号(平. ト コ ン ド リア エ ネ ル ギ ー 代 謝 を 抑 制 す る こ と で,. 成15年6月). 系 雄 性 ラ ッ トか ら 肝 細 胞 と脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ を 分 離 し. 腫 瘍 細 胞 や 正 常 細 胞 に 対 し て 傷 害 作 用 を 有 す る こ とが 知. た33,34)これ ら の 細 胞 の う ち,ト. ら れ て い る22∼26).. %以. 一 方,肝. 臓 へ 遊 走 す る マ ク ロ フ ァ ー ジ も有 力 なNO. 産 生 源 と し て 注 目 さ れ る.エ が 生 じ る 際 に は,脾 に 遊 走 し,肝. 上 のviabilityの. リパ ン ブ ル ー テ ス トで95. あ る 細 胞 の み を 実 験 に 使 用 し た.. 肝 細 胞 は 分 離 後 コ ラ ー ゲ ン コ ー トの プ レー ト上 に ま き,. ン ド トキ シ ン に よ り 肝 傷 害. 臓 に存 在 す る マ ク ロ フ ァー ジは肝 臓. 傷 害 に重 要 な役 割 を 担 って い る と い う こ と. す べ て の 細 胞 を37℃,5%CO,の た.10%fetal. 湿 条 件 下 で 培 養 を行 っ. calf serum(FCS,. USA)と1001U/mlペ. Gibco. Laboratories,. ニ シ リ ン と100ｵg/mlス. が 今 ま で の 研 究 よ り想 定 さ れ て お り27),実 験 的 に 摘 脾 し. プ トマ イ シ ン を 添 加 し た 培 養 液Dulbecco's. た 際 に は,脾. Eagle. マ ク ロ フ ァ ー ジ の 出 現 を お さ え,LPSに. medium(以. 下DMEM,. Gibco. トレ modified. Laboratories). よ っ て 惹 起 さ れ た 肝 傷 害 が 軽 減 さ れ た と い う報 告 が 見 ら. を 使 用 し た35,36).ま た 研 究 に 使 用 さ れ た 添 加 物,培. れ る28).教 室 のMizukami29)ら. プ ラ ス チ ッ ク 製 剤 は エ ン ド ト キ シ ン 濃 度 が0.1ng/ml. た ラ ッ ト に お い て,LPSに 性 酸 素 を お さ え て,肝. に お い て も脾 臓 を摘 出 し よ って 生 じた 肝 類 洞 内 の活. 類 洞 内皮 細 胞 の傷 害 を お さ え た と. い う報 告 を 行 っ て い る .さ. らに この よ うな活 性 化 さ れ た. マ ク ロ フ ァ ー ジ は,NOだ. け で な くoZも. 結 果 放 出 さ れ た0、 一はNOと. 産 生 し,そ. 反 応 し短 時 間 でONOO一. 以 下 で あ る こ と をLimulus Kitで. Amebocyte. ま ず 単 培 養 に お い て,分. の. LPS(Sigma. と. γ(Serotic. Chemical Oxford,. Co, USA)1ｵg/mlお. UK)1000. る30).Wink31)ら. IFN一 γの い ず れ か で8時. はNO関. 連 物 質 が 核 酸 に 傷 害 を 与 え,. Walker32)は,サ. イ トカ イ ンでNOSを. ジ のDNA中. に お い て,脱. を 認 め て い る.こ. たdeRojas-. 肝 細 胞 を1対1の. 誘 導 した マ ク ロ フ ァー. ア ミノ 化 と酸 化 的 傷 害 の 両 方. れ ら の 研 究 よ り,エ. ン ド トキ シ ン血 症. 培 養 後 に8時. 間,16時. 間,24時. を 検 討 す る た め に,NOの. そ れ ゆ え に,炎. で あ るaminoguanidine(Sigma ｵMの. 下L-NMMA,. 濃 度 で,ま. 胞 に 添 加 し た.活. に も重 要 と考 え られ る.. superoxide. 程 度NOを. 臓 由 来 の マ ク ロ フ ァ ー ジが 刺 激 下 で,ど 産 生 し,そ. の 産 生 さ れ たNOが. の. 実 際 に肝 細. 間 と蛍 光 顕 微 鏡 下 の観. Sigma. Co)300. units/mlを. 下SOD,. じ る か,さ さ れ たNOが. 細 胞 に 添 加 し た,ま. ｵM-1mM,. Chemical. た も う 一 つ の 実 験 系 で は,NOと. Switzerland)お Alexis. Sigma. Co)を. Alexis. Co,. よ びperoxynitrite(10 単 培 養 液 に 添 加 し た.. 出 能 に ど の よ う な変 化 が 生. ら に 活 性 化 さ れ た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ よ り産 生 肝 細 胞 に 酸 化 的DNA傷. ど う か に つ い て 検 討 し,こ. Co)を10. 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と共 培 養 し た 肝. L舫felfingen,. 産 生,放. Co)を. 性 酸 素 の役 割 を評 価 す るた め に. dismutase(以. 02一 と を 産 生 す るSIN-1(100ｵM-10mM,. と に よ っ てNOの. 関与. 選 択 的 な 阻 害薬. Chemical. の 詳 細 に つ い て は 不 明 で あ る .し. 活 性 化 さ れ た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジを 肝 細 胞 と 共 培 養 す る こ. Chemical. た 比 較 的iNosに. 胞 傷 害 を 引 き 起 こ す 重 要 な 因 子 と して 働 い て い る か 否 か た が っ て 本 研 究 で は,. 間 共 培 養 し た.共. 濃 度 で37,38),脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 共 培 養 し た 肝 細. ど の よ う に 関 与 して い る か を 明 らか に す る こ と は 臨 床 的. しか し,脾. 養 液 を 洗 浄 後,. 合 成 阻 害 薬NG-monomethyl-. 100ｵMの. 異 に. 刺 激 を し た.. 察 と生 化 学 的 測 定 を 経 過 を 追 っ て 施 行 し た.NOの. L-arginine(以. 連 物 質 が 肝 細 胞 のDNA変. units/mlで. マ ク ロ フ ァ ー ジ をLPSか. 割 合 に 加 え て24時. た ら し め る 傷 害 性 因 子 の 一 っ と な る 可 能 性 が 考 え ら れ る. 症 が持 続 した状 態 下 で肝 臓 に お い て マ ク. よ びIFN一. 間 刺 激 を し た.培. の 時 に 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ は肝 に遊 走 し,肝 細 胞 を 死 に い. ロ フ ァ ー ジ 由 来 のNO関. Test. 離 され た脾 マ ク ロ フ ァー ジを. 共 培 養 の 系 に お い て は,脾. 変 異 を 起 こ す 事 を 証 明 して お り,ま. Lysate. 測 定 し確 認 した.. な り こ れ が 強 力 な 細 胞 毒 性 を 持 っ こ とが 報 告 され て い. DNAに. 養 液,. 害 を生 じさ せ る か. れ らの研 究 を通 じて脾 マ ク ロ. 2.iNOSお. よ びnitrotyrosineの. iNOSお. よ びnitrotyrosineの. 二重免疫蛍光法 分 布 を特 異 的 モ ノク ロー. ナ ル 抗 体 を 使 用 し て 二 重 免 疫 蛍 光 法 で 観 察 し た.8穴. の. フ ァー ジの 肝 細 胞傷 害 に お け る役割 とそ の メ カ ニ ズ ム に. チ ャ ンバ ー(Nunc. つ いて 明 らか に す る こ とを 目的 と した.. マ ク ロ フ ァ ー ジ と 共 培 養 し た 肝 細 胞 をphosphatebuffered. 材料および方法. 間4%パ. saline(以. Inc., Naperville,. 下PBS)で3回. 胞 の単 離 と培 養 法. す べ て の 実 験 は,本. 養 し た.チ. 医 学 部 に お け る 動 物 実 験 ガ イ ドラ. イ ン に も とつ い て 行 な わ れ た.200∼250gの. ウイ ス タ ー 一T112一. 培 養 した脾. 洗 浄 し た 後,30分. ラ フ ォ ル ム ア ル デ ヒ ドに て 固 定 し た.PBSで3. 回 以 上 洗 浄 して0.1%TritonXを 1.細. IL)に. ャ ンバ ー はPBSで. 含 むPBSで5分 洗 い,. iNOSに. 間培 対 す るマ. ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(N32020,. Transduction. Laboratories,. 20ｵg/ml)お. KY;final. concentration.

渡 部:マ. よ びnitrotyrosineに (Upstate tion. 対 す る ウ サ ギ ポ リク ロ ー ナ ル抗 体. Biotechnology. Inc.,. で 培 養 し た.1%BSAを. (20ｵg/ml,. Southern. Birmingham, 体. Chemicon. 含 むPBSで. 胞 を 再 び 洗 浄 し,チ. グ ラ ス を の せ,緑. 色(iNOS),赤. の 蛍 光 を63Xの. レ ン ズ(Diaplot,. Japan)を Rad,. Associates. 体 Inc.,. International. CA)を1%BSAを. 分 間 反 応 さ せ た.細. (Bio. 細 胞 を3. 識 ウ サ ギ 抗 マ ウ スIgG抗. UK)に. に 抽 出 さ れ たDNAを. Tris-HCI. Inc., 室 温 で30. ャ ンバ ー に カ バ ー. OH-dG/dGを. 測 定 は,高. 測 定 し た.8-OH-dGの. 行 な い,dGの JAPAN)で. 測 定 はUV検 測 定 し た.測. [electrode. 極Model15011. 電 極Model. 1]と0.30. 25020ガ. ー ドセ ル(設. USA)を. 用 い て,こ. こ に 検 体 を50ｵ1注. 色(nitrotyrosine). 8-OH-dGの. 測 定 を 行 っ た.感. TMD-25:Nikon,. PUT=1Vで. 測 定 し た.ま. で 吸 光 度290nmで. 度 はR=50. たdGの. 鎖DNAの. DNAの. マ ク ロ フ ァー ジと共. 大 腸 菌 由 来 のnitrate還. 還 元 さ れ た も の を 測 定 し た.100. ｵ1の 培 養 液 を,0.1MHEPES. buffer(PH. 7.4),0.3. formate,0.05units/mlの. trateの. 元 酵 素(Sigma. Chemical. Co)を. で 培 養 し た.培. 含む反応液. 養 後 に反 応 液 は. 吸 光 度 を 測 定 し,. 培 養 液 濃 度 は, sodium. M. 大腸 菌 由来 の. して 上 清 に1mlのGriess反. cal Co)とsodium. 応液 を. 傷 害(単. ン オ レ ン ジ(以. nitrite(Sigma. nitrate(Sigma. 鎖DNA)を. 下AO,. 見 る た め に,ア. Molecular. Probes. Chemical. dium. isolation. よ び 二 重 鎖DNA(正. ま り,単. 鎖 お よ び 二 重 鎖 の 肝 細 胞DNAを. と が で き,二. iodide法. 比)を. 測 定 す る た め に,培. プ し て 洗 浄 し,再 rpmで5分. 30分. so・. 細胞 か. 対す る. ・. 赤 色 蛍 光 と な る.こ. び 培 養 液 に 浮 遊 さ せ た あ と,1600. 間4%パ. nmで. 緑 色蛍. れ ら の 特 性 に てAOは. 洗 浄 し た 後,0.1%TritonX,0.08N. で60分. NHCIで. 種々. 検 出 す るの に用. の チ ャ ンバ ー に 培 養 した肝 細 胞 を. Sigma. 間 処 理 し た.PBSで. 数 秒 間 冷 却 し た.再. 間4℃. で反応. 胞 を さ ら に5 Chemical. Co)で. 洗 浄 し た あ と,細 間 処 理 し,そ. 度PBSで. し. HCI,. で5分. 洗 浄 し た あ と,細. Kunits/m1RNase(Type-1A, 37℃. 光. ラ フ ォ ル ム ア ル デ ヒ ドで 固 定 し た.そ. 細 胞 は 室 温 で15分. の 操 作 に よ り肝. 視覚 化 す る こ. 光525. 本 鎖DNAとRNAを. を さ ら に2NHC1で300Cで8分. 養 肝 細 胞 を 一 度 ス ク レー. 間 勾 配 遠 心 器 に か け た.こ. 時 は,測. 光 と な る の に 対 し て 単 鎖DNAとRNAは,測. い ら れ て い る.8穴. に て 培 養 肝 細 胞 か ら抽 出 し た.肝. ら抽 出 したDNAの8-OH-dG/dG(dGに dGの. 本 鎖DNAの. Chemi-. 用 い,. 染 性 赤 色 蛍 光,. 同 時 蛍 光 が 染 色 可 能 な 点 で メ リ ッ トが あ る.つ. 0.88%NaCl,0.0039%EDTA中. 光 純 薬)を. 染性 に蛍 光. 染 性 緑 色 蛍 光,γ525. nm)の. さ せ た.PBSで kit(和. 重. γ650nm)お. Co)の. 測定. DNAはDNA. 色 を. 酸 加 水 分 解 に よ っ て,核DNA二. の 細 胞 で 単 鎖,二. 8-hydroxy-deoxyguanosine(8-OH-dG)/deoxy. ク リジ. Inc)染. 鎖(異. てPBSで. guanosine(dG)の. 出器. 染 色 す る こ と が で き る.AOは,単. 650nmで. nitriteとni・. 種 々 の 濃 度 に よ り 作 成 し た 標 準 曲 線 か ら決 定 し た.. 4.. OUT. 検 出. 鎖 の 解 離 に よ っ て 生 成 し た 単 鎖DNAを,異. 添 加 し た.543nmで. nA,. 測 定 を 行 っ た.. 元酵. 遠 心 器 で 遠 心 し,そ. 入 し,. 測 定 は, UV検. を 測 定 し た39).Nitrateは. 間37℃. V. 接 続 した電 気 化 学 測 定 器 ク ー ロ ケ ム. 行 っ た.AOは,塩. 500ｵ1で,60分. 用 いて. 定 電 位0.15V[electrode. 2])と. II(ESA,. 定 法 は,電. 濃度. nitrate還. 速 液体. 出 器(SHIMADZU. 培 養 し た 肝 細 胞 の 培 養 液 中 のnitriteとnitrateの. ammonium. 溶解. の 方 法40)に 従 い8-. 定 電 位0.35V)を. 濃度. の 方 法 に 従 っ て,脾. 素 に よ っ てnitriteに. bufferに. て 観 察 し た.. 養 液 中 のnitriteとnitrateの. Granger36)ら. 用 い て,. し た 標 準 液 を 基 準 と し て,Kasaiら. 5.単 3.培. 害. 高 感 度 セ ル(設. 装 着 した 共 焦 点 レー ザ ー蛍 光 顕 微 鏡. Watford,. 肝 細 胞DNA傷. ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー 電 気 化 学 測 定 器(HPLC)を. ロ ー ダ ミ ン 標 識 ヤ ギ 抗 ウ サ ギIgG. (20ｵg/ml,. Tokyo,. 細 胞 を60. 含 むPBSで. Biotechnology. AL)と. Temecula,. concentra-. 含 むPBSで. 回 以 上 洗 浄 し た 後,FITC標. 抗. NY;final. 20ｵg/ml)を1%BSAを. 分 間4℃. ク ロ フ ァー ジ由 来NOの. 胞. れ を0.1. 洗 浄 し た あ と,. 間,30ｵg/mlのAOに. て 染 色 し た.. 細 胞 を 再 び 洗 浄 し チ ャ ンバ ー に カ バ ー グ ラ ス を 乗 せ 観 察. 細 胞 と 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ を 効 率 良 く分 離 す る こ と が で き. し た.緑. た.肝. の 蛍 光 が 各 々 共 焦 点 レー ザ ー 蛍 光 顕 微 鏡 に て 観 察 さ れ た.. 細 胞 は5ｵMのpropidium. 培 養 し,PI陽 ちPI陰. 下PI)で. 性 細 胞 を 除 外 し て 実 験 に 用 い た.す. 性 細 胞 は,細. れ ら をDNAの. iodide(以. なわ. 胞 膜 の 傷 害 の な い 細 胞 で あ り,こ. 分 離 解 析 た 使 用 し た.こ. な い 肝 細 胞 を 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 共 培 養 した.こ. 単 鎖DNAは400倍. 本 鎖DNA)お. よ び 赤 色(単. の 倍 率 の1視. 光 を 発 す る 細 胞 と し て 計 測 し,全. の 方 法 に よ り,. 傷 害 の あ る 肝 細 胞 と 傷 害 の な い 肝 細 胞 と 区 別 し,傷. 色(二. 各 々 の 平 均 を 算 出 し た.. 害の. のよ う 一T113一. 鎖DNA). 野 当 た り で,赤 部 で10視. 色蛍. 野 を選 ん で.

慶懸医学. 6.統. 80巻2号(平. nitrotyrosineモ. 計. 数 値 は,異 て6回. 成15年6月). な る ラ ッ トか ら 各 々 取 り 出 し た 細 胞 を 用 い. の 平 均 を 求 め,satnadard. 意 差 の 検 定 はScheffe's pく0.05を. errorで. post. hoc. 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と8時. 表 現 し た.有. testに. て 解 析. ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(第1図C)に. 共 に ほ と ん ど 染 色 さ れ な か っ た.一. はiNOS抗. し,. 果. た脾 マ ク ロ フ ァー. 体 で 染 色 さ れ た(第1図B).ま. 共 培 養 し た 後 のnitrotyrosineを. 結. よ り 間LPSで. 間 共 培 養 し た肝 細 胞. 体 に て 緑 色 に 染 色 さ れ,ま. ジ も 緑 色 にiNOS抗. 有 意 差 あ り と し た.. 一IJ,8時. た. 示 す 赤 色 蛍 光 も,肝. 細. 胞 と脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 両 方 で 増 強 し て い る の が 観 察 さ れ た(第1図D).. 1.. 肝 細 胞 と 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 共 培 養 後 のiNOSお. よ びnitrOtyrOSineの 第1図. は,共. お け る,iNOSお の で,二. 2.培. 局在. 第1表. 培 養 し た肝 細 胞 と脾 マ ク ロ フ ァ ー ジに よ びnitrotyrosineの. は 抗iNOSモ. 局 在 を 示 した も. 間 後 のnitriteとnitrateの. 養 液 中 の8時. 定 結 果 を 示 す.脾. よ び抗. 間 後 のnitriteとnitrate. るい は種 々 の試 薬 を投 与 して の測. マ ク ロ フ ァ ー ジ の 単 培 養 に お い て は,. 無 刺 激 の 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ培 養 液 中 のnitriteとnitrate. A. B. M②. HC. 撫. 艮ート .﹃︹. 澱. .嵩 7帖 ε. .. HC. 描 あ; f「. C. M② ・. ., .. 麟難. D. . 翫 ・ . ヤ. 肝 細 胞(HC)と. 疫 蛍 光 法.脾. 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ(M②)に. お け るiNO5お. よ びnitrotyrosineの. マ ク ロ フ ァ ー ジ と 共 培 養 し な い 単 離 培 養 さ れ た 肝 細 胞(A&C)と,LPSで8時. 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 共 培 養 し た 肝 細 胞(B&D)際 nitrotyrosine(赤. 色)の. A. iNOSで. 染 色 さ れ た 肝 細 胞.. Panel. B. iNOSで. 染 色 さ れ た 肝 細 胞 とLPSで. Panel. C. nitrQtyrosineで. Panel. D. nitrotyrosineで. (×400).(Watanabe. のiNOS(緑. 二 重 免 疫 蛍 光 法.. Panel. Fig.1よ. HC. Mの. 》. 第1図. N. 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ.. 染 色 さ れ た 肝 細 胞. 染 色 さ れ た 肝 細 胞 とLPSで et al:Free. Radical. 濃度. れ は 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 単 独 培 養,. 肝 細 胞 と の 共 培 養,あ. 培 養 せ ず に 単 離 培 養 され た肝 細 胞 で. ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(第1図A)お. は,培. の 濃 度 を 示 し た.こ. 重 免疫 蛍 光法 で特 異 的 モ ノ ク ロー ナ ル抗 体 を使. 用 して 観 察 し た.共. 養 液 中 の8時. Biology. り 許 可 を 得 て 転 機). 一T114一. 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ. Medicine.30(9):1019-1028,2001の. 二重免 間. 色)お. よ び.

渡部:マ. 第1表. ク ロ フ ァー ジ由来NOの. 肝 細 胞DNA傷. 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 培 養 液 中 のnitriteとnitrate濃. 度.肝. 害. 細 胞 と 共 培 養 し た 場 合,及. び,種. 々の. 試 薬 を 添 加 し た 際 の 影 響. Nitrite. and. nitrate. level(ｵmole/の. Hepatocyte(十). Hepatocyte(‐). None. 12.3±1.3. I. 16.1±2.0. 19.2±1.8. LPS-MQJ. 56.5±2.3*. 187.0±10.6*§. 十L-NMMA. 19.0±2.0*'. 136.7±6.8*†. 十AG. 18.0±1.8*'. 118.0±10.8*'ｧ. 十SOD. 44.3±2.2*. 164.9±12.3*§. 56.0±2.0*. 153.3±12.0*ｧ. 十L-NMMA. 18.3±5.0*#. 105.4±11.4*#ｧ. 十AG. 17.5±0.5*#. 102.9±13.3*#§. 十SOD. 53.0±1.9*. 145.9±13.9*§. IFN-y-MQ1. 数 値 は,異. な る ラ ッ トか ら 各 々 取 り 出 し た 細 胞 を 用 い て6回. Hepatocyte(一):肝. 細 胞 と共 培 養 し な い 場 合.. 添 加 し な い 場 合. ジ.IFN一. G:脾. γ一G:IFN一. γ(1000. units/ml).*p<0.05. vs. units/ml)で8時. 間 刺 激. None,†p<0.05. vs. N. et al:Free. Radical. Biology. errQrで. 表 現 した. も. 間 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー一. した 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ.. L-NMMA:NG-. SOD:superoxide. LPS-G,#p<0. §. 細 胞 と 共 培 養 し た 場 合 . None:何. AG:aminoguanidine(10ｵM).. マ ク ロ フ ァ ー ジ の 培 養 液 中 のnitriteとnitrate濃. し た.(Watanabe. の 平 均 を 求 め,satnadard. Hepatocyte(+):肝. マ ク ロ フ ァ ー ジ.LPS・1:LPS(1ｵg/ml)で8時. monomethyl-L-arginine(100ｵM).. (一).脾. 15.6±1.5. .05 度 は,種. vs. dismutase(300. IFN†MO,§p<0.05. vs. Hepatocyte. 々 の 試 薬 を 添 加 し た 後,8時. 間後 に 測 定. Medicine.30(9):1019-1028,2001のtable. 1よ. り. 許 可 を 得 て 転 機). 濃 度 は,観 LPSで. 察 中 大 き な 変 化 は 認 め られ な か っ た.し. 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ で は 約4倍,. で 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ で も 約4倍 ら れ た.肝. 細 胞 と 共 培 養 し て8時. か し IFN一γ. の上昇 が認 め. 間 後,LPSで. 刺激 し. た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ で,無. 刺 激脾 マ ク ロ フ ァー ジの単 培. 養 に 比 べ て 約10倍,IFN一. γで 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー. ジ で も 約8倍 nitrate濃. の 上 昇 が 認 め ら れ た.こ. れ ら のnitriteと. て 抑 制 さ れ た,し. 処 置 に よ っ. か し,SODの. 投 与 に よ っ て は,単. 培. 養 ま た は 共 培 養 の い ず れ に お い て も抑 制 さ れ な か っ た. 一 方. ,LPSで. trate濃. 刺 激 し た 単 培 養 の 肝 細 胞 のnitriteとni-. 度 は,コ. 1.3(ｵmole/Z)に. 約10分. の 部 位 に当 た る範 囲 を 検 体 にお い て. 測 定 し 計 算 し た.こ. の 実 験 に お い て,LPSで. 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 肝 細 胞 を 共 培 養 し た 後,肝 DNAの8-OH-dG/dG値. は4.81±0.67で. 細 胞DNAの8-OH-dG/dG測. 第2表. は,肝. 細 胞 を,24時. HPLCで. 定 法. 測 定 し た 代 表 的 な 結 果 を 第2図. っ き に 示 す.我. の 予 備 実 験 の 結 果 で は,肝. 細 胞 のDNA障. フ ァ ー ジ と の 共 培 養16時. 間 後 に 発 現 し,24時. 有 意 と な る 成 績 が 得 ら れ た.そ て はDNA抽. 出前 に24時. 間LPSで. ジ と 肝 細 胞 を 共 培 養 した.こ. 々. 害 は脾 マ ク ロ. れ ゆ え に,本. 間後 に. さ ら に 種 々 の 試 薬 を 投 与 し た 場 合 に 分 け て 表 示 を した. 細 胞 膜 の 破 壊 を 示 すPI陽. 性 細 胞 数 の%は,. LPSで. 刺激. る た あ に 使 用 し た.活. 性 化 され て い な い無 刺 激 の脾 マ ク 細 胞 で の8-OH-dG/dG. 方,LPSやIFN一. と も に, LPSやIFN-yで. γで 刺 激 し. 間 共 培 養 し た 肝 細 胞 は,著. 明 な 上 昇 を 認 め た.L-NMMA, SODは. 測定す. aminoguanidine, 刺 激 した 脾 マ ク ロ フ ァ ー. ジ で 培 養 し た 肝 細 胞 の8-OH-dG/dGの. 上 昇 を 有 意 に抑. 制 し た.. 実 験 にお い. 刺 激 した脾 マ ク ロ フ ァ ー. の 第2図. 性. 間 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 共 培 養 し た 場 合,. た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と24時. 用 い て,8-OH-dG/dGに. あ っ た.. 細 胞DNAの8-OH-dG/dGとPI陽. は 上 昇 を 認 め な か っ た.一. 肝 細 胞 のDNAを. 細胞. 定値. ロ フ ァ ー ジ と の 共 培 養 で は,肝. 細 胞DNAの8-OH-dG/dG測. 刺 激 した. そ れ ゆ え 生 き 残 っ た 細 胞 の み を8-OH-dG/dGを. の 値 は 図 に示 して い. な い).. 3.肝. の と こ ろ に標 準 物 質. した脾 マ ク ロ フ ァー ジと共 培 養 した後 に上 昇 を認 め た。. ン ト ロ ー ル に 対 し て 上 昇 せ ず23.3± と ど ま っ た(こ. に, dGは. が 出 現 して お り,そ. 4.肝. 度 の 上 昇 は単 培 養 あ る い は共 培 養 の いず れ に. お い て もL-NMMAやaminoguanidineの. dGは14∼15分. に お い て,8-OH一. 5.肝 第3図. 一T115一. 細 胞 の 単 鎖DNA(AO染 に,LPSで. 色). 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と,24.

慶鷹医学. 80巻2号(平. iOOO. 成15年6月). 400 cou.r+sn :aYl ti. A. 800. 300 600. 400. 200. ZOO. k-. 0. 幽 ・ 一. 一200. 100 ■. 一硲 一. 一400. 0.1. 2.0. 4.0. 6.0. 8.0. 10.0. 8-OH-dG iOOO. 12.0. 14.0. 一5019 .0 0.1. 16.0. 2.0. 4.0. 6.0. 8.0. 10.0. 12.0. 14.0. 19.0. 16.O. dG standard. standard 40. `0器滞. の. c. 600 400. ㌔. ー伽. ψ }. ∼. ず. 200. ⋮ よ. 800. 30. 20. 10. a ‐zoo. 一400 0.1. 2.0. 4.0. 6.0. 8.0. 8-OH-dG 第2図. 10.0. 12.0. 14.0. =1-5 19.0. 16.0. .o. dG in hepatocyte. in hepatocyte DNA. 肝 細 胞 のDNAを. 用 い て,8-OH-dG/dGに. に お い て,8-OH-dGは14-15分. に,. dGは. つ きHPLCで 約10分. Medicine,30(9):1019-1028,2001のFig.2よ. N. et al:Free. Radical. 性細 胞 の比 率. 単 独 で培 養 した場 合 と24時. 間脾 マ ク ロ フ ァー. ratio in hepatocytes(x10-5). PI-positivehepatocytes (%). None. 1.05±0.20. i. 1.30±0.17. 3.10±0.60. LPS-MQj. 4.81±0.67. 22.50±2.60*. 2.90±0.50. 十L-NMMA. 2.27±0.20*t. 十AG. 2.19±0.22*'. 9.30±1.70*t. 十SOD. 2.82±0.25*'. 11.10±1.50*r. 8.20±1.30*`. 6.65±0.55. 24.30±2.10. 十L-NMMA. 2.55±0.33*#. 12.50±2.00*#. 十AG. 3.09±0.35*#. 10.80±1.20**. 十SOD. 3.90±0.45*#. 14.30±1.40*#. IFN-y-MO. な る ラ ッ トか ら 各 々 取 り 出 し た 細 胞 を 用 い て6回. 8-OH-dG:8-hydroxy-deoxyguanosine,. Biology. ・-dG/dGの. の 平 均 を 求 め,satnadard. dG:deoxyguanosine.8-OH-dGとdGは. ラ フ ィ ー 電 気 化 学 測 定 器 とUV検 IFN-y-MQj.. Biology. ら に種 々の 試 薬 を投 与 した場 合 の 影 響.. 8-OH-dG/dG. 数 値 は,異. の図 の部. り許 可 を 得 て 転 機). 肝 細 胞DNAの8-OH-dG/dGとPI陽. ジと共 培 養 した場 合,さ. 測 定 した 代 表 的 な 結 果.こ. の と こ ろ に 標 準 物 質 が 出 現 し て お り,そ. 位 に 当 た る 範 囲 を 検 体 に お い て 測 定 し計 算 し た.(Watanabe. 第2表. DNA. 出 器 で 測 定 し た.*p<0.05. 比 は,共. 培 養 し た 後24時. vs. None,. tp〈0.05. 間 後 に 測 定 し た.(Watanabe. Medicine.30(9):1019-1028,2001のtable. 2よ. 一T116一. errorで. 表 現 し た.. 高 速 液 体 ク ロ マ トグ. り 許 可 を 得 て 転 機). vs. LPS・M②,#p<0.05 N et a1:Free. vs Radical.

渡部. マ ク ロ フ ァ ー ジ 中来NOの. A. 肝 細 胞DNA傷. 害. 繋. HC. 雛. B Mの HC. ・・霧.. HC轟. MO. 、. HC葡 Hc. r守・ 『{柵 一. HC HC. M￠ Mの. Mの. 第3図. LPSで. 色 写 真.緑. 刺 激 した 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ(MO)と,24時. 色 蛍 光(A)は,二. と 結 び つ い たAOを. 本 鎖DNAと. 結 び っ い たAOを. 示 す.(×izso)(Watanabe. (9):lol9-1028,2001のFig.3よ. 間 共 培 養 し た 肝 細 胞(日C)のAO染. N. 示 し,赤. et a1:Free. 色 蛍 光(B)は,単. Radical. Biology. 鎖DNA Medicine.30. り 許 可 を 得 て 転 機). 時 間 共 培 養 し た 肝 細 胞 のAO染 第3表. 活 性 化 さ れ た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と共 培 養 した 後. (A)は,脾. 24時 間 の 肝細 胞 の単 鎖DNA of hepatocytes. single stranded. with. に 核 内 中 のAOで. DNA(%). り蛍 光(A)で. None. 示 し,蛍. 光(B)は,そ. 染 ま っ た 単 鎖DNAを. 光(B)で. 5.4±1.0. LPS-Mg. ず,ま. 43.2±4.8". 十L-NMMA. 19.2±2.5*'. +AG. 21.0十2.6*'. 十SOD. 19.8-2.1*'. IFNry-MO. 示 した.こ. れ よ. 染 色 さ れ て い た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ は,蛍 は傷 害 を受 け な か った た め に染 色 され て お ら. た 傷 害 を 受 け な か っ た 肝 細 胞 も 蛍 光(B)で. 色 さ れ な か っ た.こ. れ ら の 写 真 か ら,蛍. は染. 光(A)を. 発 す. る 全 肝 細 胞 中 の う ち 傷 害 を 受 け た で あ ろ う 蛍 光(B)を. 45.1十3.3*. 発 す る 肝 細 胞 の 比 率 を 計 算 し て,単. 十L-NMMA. 18.9=ヒ2.1半#. て 第3表. 十AG. 16.5±1.7". 十SOD. 14.2±1.3". に 示 し た.肝. 鎖DNA比. 細 胞 の み24時. 鎖DNAの. 鎖DNAの. 割合 とし. 間 培 養 し た 時 は単. 率 は,..ヒ 昇 を 認 め な か っ た.ま. マ ク ロ フ ァ ー ジ は,単. た無 刺 激 の脾. 肝 細 胞 の割 合 を上 昇 さ. な る ラ ッ トか ら 各 々 取 り 出 し た 細 胞 を 用 い て6. 回 の 平 均 を 求 め,satnadard. errQrで. 単 鎖DNAの. 色 で 施 行 し た..Pく0.05. 比 率 は,. None,†p<0.05. AO染. 表 現 し た.肝. vs LPS・M②,緋pくD.05. 胞 の 単 鎖DNAの (Watanabe. 染. の うち特. 4.8±0.6. MO. 数 値 は,異. 光. マ ク ロ フ ァ ー ジ と 肝 細 胞 の 核 内 中 のAOで. ま っ た 「 本 鎖DNAを Rate. 色 写 真 を 示 し た.蛍. N. 比 率 は,添 et al:Free. (9):1019-1028,2001のtable. vs IFN・ γ一MO.肝. 加 後24時. Radical. か し,LPSやIFN-Yで. ロ フ ァ ー ジ と24時. vs 細. 刺 激 した 脾 マ ク. 間 共 培 養 し た 肝 細 胞 で は ,単 鎖DNA. の 比 は 著 明 に 上 昇 を 認 め た.ま. た 第3表. に は,活. 性化. 間 で 測 定 し た.. Biology 3よ. せ な か っ た.し. 細胞 の. さ れ た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 共 培 養 し た 後24時. Medicine.30. 胞 の 単 鎖DNA比. り 許 可 を 得 て 転 機). し た,L-NMMA, IFN-Yで 単 鎖DNA比. aminoguanidine,. SODは,. LPSや. 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ で 培 養 した 肝 細 胞 の 率 の ヒ昇 を 抑 制 し た.さ. らに 活 性 化 され た. 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と共 培 養 し た 後 の 肝 細 胞DNA変 一T117一. 間の肝細. 率 に対 す る種 々 の 薬 物 の 効 果 を あ らわ. 化に.

慶鷹医学. お け る 活 性 酸 素 の 役 割 を 見 る た あ に,NOと0,一 産 生 す るSIN-1の. 効 果 や,. SIN-1やONOO一. ONOO一. 両者 を. の 効 果,お. 投 与 下 で のSODの. 80巻2号(平. よ び. 成15年6月). 第5表SIN-1やONOO一. 投 与 が,肝 細 胞 の 単 鎖DNA出. 現 比 率 に与 え る影 響.. 効 果 にっ き検 討 し. Rate of hepatocytes with single stranded DNA(%). た. None. 6.SIN-1や. …. 4.5±0.5. SIN-1. 投 与 の 肝 細 胞DNAの8-OH・dG/. 100ｵM. dGに. 対 す る影 響. 第4表. はSIN-1やONOO一. OH-dG/dGに. 投 与 の 肝 細 胞DNAの8-. OH-dG/dGは. 間 培 養 後,肝. え る こ と に よ り10mMのSIN-1で お け る8-OH-dG/dGの 1mMで. SODを. 加. 培 養 した 肝 細 胞 に. 60.3±7.8 22.1±2.2*'. 10wM. 4.8±0.4. 100ｵM lmM. 60.5±4.4 82.6±6.5. Peroxynitrite(1. 上 昇 効 果 を 著 明 に 抑 制 し た が,. 培 養 し たONOO一. 10mM. peroxynitrite. 細 胞 の8-. 用 量 依 存 的 に 上 昇 を 認 め た.. 38.6±4.4. SIN-1(10mM)十SOD. 対 す る 影 響 を 示 し た. SIN-1(>1mM). やONOO-(>100ｵM)と24時. 4.6±0.4. lmM. で はそ の 抑 制 効 果 は認 あ られ. 数 値 は,異. mM)十SOD. 78.5±9.3*. な る ラ ッ トか ら各 々 取 り 出 し た 細 胞 を 用 い て6. 回 の 平 均 を 求 め,satnadard. な か っ た.. peroxynitrite,. 7.SIN-1やONOO一. 投 与 の 肝 細 胞 の 単 鎖DNA出. 現比. 第5表. はSIN-1や,. ONOO一. 投 与 が,. AO染. 間後. 現 比 率 を 測 定 し た.*p<0.05. vs. None,. tpGO.05. 間 培 養 後,肝. 培 養 し たONOO一. SIN-1やONOO一. dG/dGに. et. al:Free. Medicine.30(9):1019-1028,2001の. り許 可 を 得 て 転 機). 対 して は抑 制 効 果 を示 さ な か った.. 率 は著 明 に 上. 考. 率 を著 明 に 抑 制 した に よ る 単 鎖DNA比. 率 に. 本 研 究 の 結 果 よ り,活 肝 細 胞 のDNAに. 案. 投 与 の 肝 細 胞DNAの8-OH-. NMMAを. 対 す る 影 響.. 性 化 さ れ た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ が,. 傷 害 を 与 え る こ と が 明 ら か に な っ た.. 教 室 のKuroseら 第4表. N. 加 え る こ と に よ り10mMのSIN-. 1で 培 養 し た 肝 細 胞 の 単 鎖DNA比 が,1mMで. Biology 5よ. SIN-1.(Watanabe. 投与. 細 胞 の 単 鎖DNA比. 昇 を 認 め た.SODを. vs. 色 に て評. 現 比 率 に与 え る影 響 を示 し. た.SIN-1(>1mM)やONOO-(>100ｵM)を し24時. SIN-1,. の 肝 細 胞 の 単 鎖DNA出. table. 価 した 肝 細 胞 の 単 鎖DNA出. 表 現 し た.. 肝 細 胞 培 養 液 に 添 加 し,24時. Radical. 率 に 与 え る影 響. errorで. SODを. は,. NOの. 胞35,41)の両 者 でKupffer細. 8-OH-dG/dG ratio in hepatocytes(x10-5) None. 1.21±0.14. 100ｵM lmM. 5.71±0.99*. 10mM. 10.71±1.42*. 胞 に よ って生 じた ミ トコ ン ド 回 の 研 究 に て,. 活 性 化 さ れ た マ ク ロ フ ァ ー ジ の 培 養 液 中 に 過 剰 なNO マ ク ロ フ ァ ー ジや 肝 細 胞 内 で のiNos発. 現 を 認 め た.さ. 1.30±0.12. 細 胞33)と 肝 癌 細. リ ア の 障 害 を 減 少 し た こ と を 報 告 した.今. 産 生 を 認 め,脾. SIN-1. 選 択 的 合 成 阻 害 薬L-. 加 え る こ と に よ っ て,肝. ら にNO合. 成 阻 害 薬 が,マ. ジ に よ り 惹 起 さ れ た 肝 細 胞 変 化,す tyrosineの. 形 成 とDNA傷. クロフ ァー な わ ちnitro-. 害 を 抑 制 し た こ と を 示 し た.. 4.36±1.24*'. SIN-1(10mM)十SOD. こ れ ら の 結 果 を 考 え 合 わ せ る と,LPSやIFN-yで. peroxynitrite 10ｵM. 1.61±0.12. 100ｵM. 11.71±0.99*. lmM. 24.65±2.30*. Peroxynitrite(1. mM)十SOD. さ れ た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ に よ っ てiNosの 多 量 のNOを. 生 じ た 結 果,肝. と 想 定 さ れ る.サ. 20.33±1.87*. 刺 激. 発 現 が 充 進 し,. 細 胞 傷 害 を 引 き起 こ した. イ トカ イ ンや 脂 質 メ デ イ エ ー タ ー や 活. 性 酸 素 な ど の 種 々 の メ デ イ エ ー タ ー は 炎 症 が 生 じた 肝 臓 数 値 は,異. な る ラ ッ トか ら 各 々 取 り 出 し た 細 胞 を 用 い て6. 回 の 平 均 を 求 め,satnadard peroxynitrite, の vs. ・. SODを. ・/dGを. SIN-1.(Watanabe. errorで. 表 現 し た.. 肝 細 胞 培 養 液 に 添 加 し,24時. 測 定 し た.*p<0.05 N. et al:Free. Medicine.30(9):1019-1028,2001のtable. vs. に お い て 多 量 に 放 出 さ れ る こ と が 知 ら れ て お り7,42),と. SIN-1,. く にIFN一 γやTNF一. 間後. None,†p<0.05 Radical. αは,マ. ク ロ フ ァ ー ジ に よ るNO産. 生 を 刺 激 す る 物 質 と し て 知 られ て い る.こ. れ ら は さ ら に,. Biology 4よ. 炎 症 を起 こ した肝 臓 や 他 の臓 器 にお いて 細 胞 傷 害 を 引 き. り許 可. 起 こす 物 質 を 誘 導 す る と 考 え られ て い る43,44).. を 得 て 転 機). NO依 一T118一. 存 性 のTNF-aの. 役 割 は 知 ら れ て い る が, NO依.

渡 部:マ. 存 性 お よ びNO非. 依 存 性 のIFN-yに. よ る肝 細 胞 傷 害 に. っ い て は 未 だ 詳 細 が 明 ら か で な い.そ IFN一γのNO産. ク ロ フ ァー ジ由来NOの. こ で 本 研 究 で は,. 比 較 して 検 討 を 加 え た.. IFN一γ で. 害. こ れ ま で の 成 績33)お よ び 本 研 究 の 結 果 か ら考 え ら れ る一 方,共. 物 に 対 す る影 響 と そ れ に 引 き 続 く肝 細 胞. 傷 害 に つ い てLPSと. 肝 細 胞DNA傷. 培 養 中 の 肝 細 胞 自 体 がNOを. 残 さ れ て い る.さ. ら に,活. 放 出 す る可 能 性 は. 性 化 さ れ た脾 マ ク ロ フ ァー ジ. の み な ら ず 肝 細 胞 自体 がiNosを. 産 生 し て い る こ と も免. 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 肝 細 胞 の 共 培 養 液 中 で は,. 疫 蛍 光 染 色 に よ っ て 示 さ れ て い る.し. LPSで. のnitriteとnitrateの. 刺 激 した 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 同 様 に8時. triteとnitrate濃 DNA傷. 度 の 上 昇 を 認 め た.さ. 害 はNO合. 間 でni-. ら に,肝. 細 胞. 成 阻 害 薬 で 効 果 的 に 抑 制 を 認 め た.. こ れ ら の 結 果 は,肝. 細 胞 に 対 す るIFN-yで. と えLPSや. IFN一 γで 刺 激 後 で あ っ て も変 化 は 認 め られ な か っ た の で, 肝 細 胞 の み で は 多 量 のNOを. 刺 激 を した. か し肝 細 胞 単 独 で. 培 養 液 濃 度 は,た. と考 え ら れ る.と. 産 生 す る可 能 性 は 少 な い. こ ろ が 一 方,本. 研 究 で は,活. 性 化 され. 脾 マ ク ロ フ ァー ジの傷 害 性 が や は り過 剰 に産 生 さ れ た. た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ単 独 よ り肝 細 胞 と共 培 養 し た 場 合 の. NOに. 方 がnitriteとnitrateの. 依 存 し て い る こ と を 示 して い る.こ. 結 果 と 考 え 合 わ せ,こ 症 の 際 に,脾. れ らの 成 績 か ら エ ン ド トキ シ ン血. 臓 や 肝 類 洞 の 炎 症 細 胞 がLPSで. さ れ る と い う以 外 に,活 ロ フ ァ ー ジ が,炎 接 的 にNO依. 直接刺激. 性 化 され て遊 走 して きた脾 マ ク. 症 に よ り増 加 し たIFN一 γ に よ り ,間. そ の酸 化 的代 謝 物 の 一 つ で あ る. は 種 々 の ス テ ップ にて 肝 細 胞 の ミ トコ ン ド リア. の エ ネ ル ギ ー 代 謝 を 抑 制 す る .一. 般 的 に,細. 養 中 のNOは, さ れ た.こ. NO阻. 培 養 液 濃 度 は 高 く,こ 害 薬 やSODに. 胞 のATP. γに よ って 活 性. 化 さ れ た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ に よ って 放 出 さ れ る メ デ イ エ ー 産 生 を 刺 激 し た 可 能 性 が あ り,. こ れ は 以 前 の 報 告 に 一 致 し て い る2',48).マ ク ロ フ ァ ー ジ は,LPSやIFN一. γの 刺 激 に 反 応 し て,. IL-1やTNF-a. な どを 含 む 種 々 の 炎 症性 メデ イ エ ー ター を 産生 し放 出 す る こ と が 知 ら れ て い る.一. 方,LPSと. これ らの メ デ イ. 減 少 は虚 血 再 潅 流 に よ って もた らされ る細 胞 傷 害 の 特 徴. エ ー タ ー が 混 在 し た 場 合 に は 肝 細 胞 にiNosを. で あ る が,ミ. と が 示 さ れ て い る21・48).教 室 のKurose33)ら. トコ ン ド リア のATP合. 成 の 崩 壊 は,種. 々. の共培. よ り効 果 的 に 阻 害. れ ら の 結 果 は,LPSやIFN一. タ ー が 肝 細 胞 にiNosの. 存 性 に 肝 細 胞 傷 害 を 起 こ す と い う傷 害 経. 路 が 考 え ら れ た.NOと ONOO一. れまでの研究. 生 じるこ サ イ トカ イ. の 活 性 酸 素 に よ って 引 き 起 こ さ れ る 傷 害 に よ り 肝 細 胞 死. ン 刺 激 に よ り 産 生 さ れ た 肝 細 胞 由 来 のNOの. を 導 く45).し. 臓 の ミ トコ ン ド リア の 機 能 を 抑 制 す る可 能 性 を 報 告 した.. ONOO一. た が っ て ミ ト コ ン ド リ ア 障 害 は,NOや. に よ って 肝 細 胞 傷 害 が 惹 起 さ れ る際 の 大 きな要. 因 と な る と考 え ら れ る.と ら産 成 さ れ,非. く にONOO一. はNOと0、. 究 で 最 も 重 要 な 所 見 の 一 っ は,SODやNO合 が,活. 一か. 常 に 毒 性 の 強 い 活 性 酸 素 と な る46).本 研 成阻害剤. 性 化 さ れ た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と共 培 養 し た 後 に 見. られ た 肝 細 胞DNA傷 こ と はNOと0、. 害 を 抑 制 し た こ と で あ る が,こ. 一の 両 者 の 代 謝 経 路 が こ の モ デ ル で の 肝. 細 胞 傷 害 に 役 割 を 果 た す こ と を 示 し て い る.ま 果 は,ONOO一. の. が,活. た この結. 性 化 され た マ ク ロ フ ァー ジ に よ る. した が っ て,活. 性 化 され た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジに よ って 誘. 導 さ れ た 肝 細 胞iNosが,こ. の 共 培 養 の 系 に お いて 肝 細. 胞 傷 害 を 惹 起 させ る要 因 の 一 っ とな って い る可 能 性 も否 定 で き な い. 本 研 究 の 目 的 の 一 っ は,活. 性 化 され た脾 マ ク ロ フ ァー. ジ に よ っ て 肝 細 胞 に 重 篤 な 傷 害 を 引 き 起 こ し た 後 に,残 存 す る 細 胞 に 酸 化 的DNA傷. 害 を生 じ るか ど うか を 明 ら. か に す る こ と で あ っ た.多. く の 臨 床 的 知 見 か ら49∼52),肝. 臓 の持 続 性 の炎 症 に伴 い傷 害 され た多 くの肝 細 胞 は除 去. 肝 細 胞 傷 害 の発 生 に一 役 買 って い る可 能 性 を示 唆 して お. さ れ る が,細. り,こ. ま ま 生 き残 る と こ と が 想 定 さ れ る.DNAに. の 仮 説 は,活. 性 化 脾 マ ク ロ フ ァー ジと共 培 養 した. 肝 細 胞 に お い てnitrotyrosineの. 存在が免疫蛍 光染色 か. ら 明 ら か に さ れ た 事 実 に よ っ て も支 持 さ れ る.し nitrotyrosineはONOO一 我 々 は,こ. の モ デ ル に お い て,ONOO一. が直接肝細胞傷. 害 に 関 与 し て い る と断 定 す る こ と は で き な い.し や は り本 実 験 でNOと0、 産 生 す るSIN-1を DNA傷. か し. に 特 異 的 な も の で な い の で47),. か し,. 『を 放 出 し結 果 的 にONOO一. 加 え る こ と に よ り,効. 害 を 生 じ た と い う結 果 か ら, ONOO一. を. はNO依. NOが. H,0,+ア. 々 の 酸 化 的 活 性 物 質,例 ス ベ ス ト55),H,0、+鉄. ノ ー ル56)な ど に よ り,生 な る.最. 本 研 究 で は,LPSとIFN一. 害 を受 け た あ るC-8基. え ば 還 元 剤53),X線54), イ オ ンを伴 うポ リフ ェ. 体 内 で 水 酸 化 さ れ8-OHdGに. 近,Tannenbaums',s8)ら. はONOO一. を介 す る反. 形 成 さ れ る こ と を 報 告 して い る. γで 刺 激 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー. ジ に よ っ て 肝 細 胞 を 共 培 養 し た 際 に,コ 較 し て3∼5倍. 存 性 の 肝 傷 害 の 主 要 な 成 因 の 一 っ で あ る と 考 え られ る. LPSで. が,種. 胞 の あ る も の は 酸 化 的DNA傷. 応 に お い て8-OHdGが. 率 的に肝細胞. 一 部 が肝. に8-OHdG/dG比. ン トロー ル と比. は 上 昇 し て い た が,. こ の 時 点 で 活 性 化 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と共 培 養 後 に 生 き残 っ. 刺 激 さ れ た マ ク ロ フ ァ ー ジに 由来 し た大 量 の. 肝 細 胞 ミ ト コ ン ド リ ア 障 害 を 引 き 起 こ す 可 能 性 が, 一T119一. た 肝 細 胞 の 数 は,コ 少 し て い た(デ. ン ト ロ ー ル の 肝 細 胞 の 約40%に. ー タ は 示 して い な い).こ. 減. の 際 の肝 細 胞.

慶鷹医学. 内8-OHdGの. 上 昇 は, NO阻. こ と よ り,NOやONOO一. 害 薬 やSODで. AO染. 阻 害 され る. が 肝 細 胞DNA傷. 原 因 で あ る こ と を示 唆 して い る.ま. 80巻2号(平. 害 の大 き な. 成15年6月). 2.活. 性 化 さ れ た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と共 培 養 し た 後 の. 肝 細 胞DNA変. 化 に お け る 活 性 酸 素 の 役 割 を 見 る た め に,. た本研究 にお ける. NOと0、. 一両 者 を 産 生 す るSIN-1の. 色 の結 果 は,活 性 化 脾 マ ク ロ フ ァー ジで 共 培 養 し. 効 果,お. よ びSIN-1やONOO一. た後 に,生 き残 っ た肝 細 胞 内 で の単 鎖DNAの して お り,そ れ は や は りSODやNO阻 果 的 に抑 制 され た.DNA単. 増 加 を示. 害薬 に よ って 効. 鎖 はDNA傷. 害 の も う一 っ. 時 間 共 培 養 後,肝. 細 胞 の8-OH-dG/dGは. が って,も. N-1で. 培 養 し た 肝 細 胞 に お け る8-OHdG/dGの. 果 を 著 明 に 抑 制 し た が,1mMで. 胞 よ り放 出 され るNOお. そ の 抑 制 効 果 は 認 め られ な か っ た.. よ びONOO一. が,生. き残 った 肝. 発 癌 に もっ なが る ので は な いか と想 像 され た59).. 括. 間 培 養 後,肝. SIN-1で. 性 化 脾 マ ク ロ フ ァー ジ と肝 細 胞 の共 培 養 に よ り. 以 下 の 結 果 を 得 た. 1)IFN-yやLPSで. 胞 の 共 培 養 液 中 で は,8時. 間 でnitriteとnitrate濃. ら に,こ. 効 果 的 に 抑 制 を 認 め た.こ. れ ら はNO合. 度. の こ と に よ り,活. 性化脾マ ク 産 生 され る. こ と が 明 らか と な っ た.. 加 え る こ と に よ り10mMの. 培 養 し たONOO一. 間LPSで. 率 を 著 明 に抑 制 に よ る 単 鎖DNA比. 率 に 対 し て は 抑 制 効 果 を 示 さ な か っ た.. 大 き な 原 因 で あ り,用. が 肝 細 胞DNA傷. 害 の. 量 依 存 的 に傷 害 され る こ とが 示 さ. れ た.. 稿 を 終 え る に あ た り,御. 刺 激 した 脾 マ. 指 導 と御 校 閲 を 賜 り ま し た 慶 慮. 義 塾 大 学 医 学 部 内 科 学 教 授 石 井 裕 正 教 授 に深 甚 な る 謝 意 を あ らわ し ま す.本. 疫 蛍 光 染 色 に よ り,8時. 率 は著 明 に. 成 阻害薬 で. ロ フ ァ ー ジ と肝 細 胞 の 共 培 養 に よ り,NOが. 2)免. では. 投. 細 胞 の 単 鎖DNA比. こ の こ と に よ りNOやONOO一 刺 激 した脾 マ ク ロ フ ァー ジ と肝 細. の 上 昇 を 認 め た.さ. 培 養 し たONOO一. 培 養 し た 肝 細 胞 の 単 鎖DNA比. し た が,1mMで 1.活. 上昇効. 2)SIN-1(>1mM)やONOO-(>100ｵM)を 与 し24時. 上 昇 を 認 め た.SODを. 総. 用量依存 的に. 加 え る こ と に よ り10mMのSI. 活 性 化 され た マ ク ロ フ ァー ジや そ の近 傍 に存 在 す る肝 細. 害 を 引 き起 こす可 能性 が あ り,将 来 的 な. の 効. 1)SIN-1(>1mM)やONOO-(>100ｵM)と24. 上 昇 を 認 め た.SODを. 細 胞 にDNA傷. ONOO一. 果 に っ き 検 討 した.. の マ ー カー で あ り,初 期 を示 唆 す るか も知 れ な い.し た し肝 細 胞 に炎 症 が 続 き慢 性 化 した場 合 に は,. 効 果 や,. 投 与 下 で のSODの. 研 究 にあ た って直 接御 指 導御 助言 いた だ. き ま した 防 衛 医 科 大 学 校 内 科 学 第 二 講 座 教 授 三 浦 総 一 郎 教. ク ロ フ ァ ー ジ と共 培 養 し た 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ と 肝 細 胞 は. 授 に 深 謝 致 しま す.さ. iNOS抗. い た だ き ま した 消 化 器 内 科 学 教 室 の 諸 各 先 生 方 に 厚 く御 礼. 体,. nitrotyrosineを. 示 す蛍光 の両方 で増 強 し. て い る の が 観 察 ぎ れ た.nitrotyrosineはONOO一 異 的 な も の で な い が,ONOO一 3)肝. の 関 与 が 疑 わ れ た.. 細 胞 の 酸 化 的DNA傷. OHdG/dG比. を 測 定 し た.. に特. 会,第96回. 刺 激 した 脾. マ ク ロ フ ァ ー ジ に よ っ て 肝 細 胞 を 共 培 養 し た 際 に,コ ト ロ ー ル と 比 較 し て3-5倍 た.こ. に8-OHdG/dG比. の 際 の 肝 細 胞 内8-OHdGの. やSODで. 上 昇 は,. 阻 害 さ れ た 。 こ の こ と よ り,活. 4)DNA傷. NO阻. 内 で の 単 鎖DNAの. 性化 されたマ. 色 を 行 っ た.そ. の 結 果,活. が,. 性化. き残 っ た 肝 細 胞. 増 加 を 示 し て お り,そ. れ はや は り. 害 薬 に よ って 効 果 的 に 抑 制 さ れ た.. こ の こ とか ら,活. 性 化 され た脾 マ ク ロ フ ァー ジや そ の. 近 傍 に 存 在 す る肝 細 胞 よ り 放 出 さ れ るNOやONOO一 肝 細 胞DNA傷. 害薬. 害 の も う 一 つ の マ ー カ ー で あ るDNA単. 脾 マ ク ロ フ ァ ー ジ で 共 培 養 し た 後 に,生. SODやNO阻. ン. 害 の 大 き な 原 因 で あ る こ と が 示 さ れ た.. 鎖 を 見 る た め にAO染. 研 究 の 一 部 は 第32回. 全 米 消 化 器 病 学 会(San. 研 究 の 一 部 は,1996,1997,1998年 (奨 励 研 究A番. 号32612)に. 日本 肝 臓 病 学 会 総. Francisco,1996)第 て 発 表 した.本 度文 部省 科学 研 究費. よ リ援 助 を 受 け た.. は上 昇 し. ク ロ フ ァ ー ジや 肝 細 胞 よ り 放 出 さ れ るNOやONOO一 肝 細 胞DNA傷. 研究 に当 た り多大 な御 協 力. 47回 全 米 肝 臓 病 学 会(Chicago,1996)に. 害 を 見 る た め に8-. LPSとIFN-yで. 申 し上 げ ま す.本. ら に,本. が. 害 の 大 き な 原 因 で あ る こ と が 示 さ れ た. 一T120一. 文. 献. 1)Takano S,Yokosuka O,Imazeki F, Tagawa M, Omata M:lncidence of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitisB and C:prospective study of 251 patients. Hepatology 21:650-655,1995 2)ShiratoriY, ShiinaS, Imamura M, Kato N, Kanai F, Okudaira T, TerataniT, Tohgo G, Toda N, Ohashi M, Ogura K, Niwa Y, Kawabe T, Omata M:Characteri sticdifferenceof hepatocellular carcinoma between hepatitisB-and C-viralinfectionin Japan.Hepatology 22:1027-1033,1995 3)Stark ME, Szurszewski JH:Role of nitricoxide in gastrointestinal and hepatic function and disease. Gastroenterology1103:1928-1949,1992.

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