laporan HPLC KA_dewi.docx

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS

Hight Performance

Hight Performance Liquid Chromatograph

Liquid Chromatograph

!HPLC"

!HPLC"

A

A##ii##tteenn $ $ %%u u &&mmii

'

'oo((oonnggaann))KKee((oommppoo** $ $ S S ) ) &&

N

Naamma a **ee((oommppoo** $$

A(+ertu# Kri#tian Si#,anto !-../01/0.2" A(+ertu# Kri#tian Si#,anto !-../01/0.2" 3,i Augu#nita !-../01/044"

3,i Augu#nita !-../01/044" 5ran#i#ca 6u

5ran#i#ca 6unita 3,i 7u(andari nita 3,i 7u(andari !-../01//0."!-../01//0." Maria Krien#ia !-../01/18."

Maria Krien#ia !-../01/18."

LA%ORATORIUM KIMIA ANALISIS LA%ORATORIUM KIMIA ANALISIS

5AKULTAS 5ARMASI 5AKULTAS 5ARMASI

UNI9&RSITAS KATOLIK 7I36A MAN3ALA SURA%A6A UNI9&RSITAS KATOLIK 7I36A MAN3ALA SURA%A6A

-018 -018

I: 3ASAR T&ORI

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair - cair yang dapat digunakan  baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar (hopkar, !""#$.

Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sampel untuk selan%utnya diidentifikasi (kualitatif$ dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif$. Analisa kualitatif bertu%uan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analit dalam suatu sampel. &edangkan analisa kuantitatif untuk mengetahui %umlah dan konsentrasi analit tersebut dalam sampel (hopkar, !""#$.

HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran komponen (analit$. Prinsip ke%a HPLC adalah pemisahan setiap komponen dalam sampel  berdasarkan kepolarannya. 'ang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya

adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Contoh fasa diam yang digunakan (pada kolom$ HPLC %enis fasa terbalik adalah P!), dimana  adalah rantai alkana C-!) atau C-). &ementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi$, hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan *aktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah (hopkar, !""#$.

omponen utama HPLC adalah +

• eseroir pelarut + at pelarut yang dipakai polaritasnya dapat berariasi tergantung

dari senya*a yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bah*a tempat pelarut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada dalam pelarut.

• Pompa + digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase gerak dengan kecepatan

dan tekanan yang tetap.

• n%ektor + saat sampel diin%eksikan ke dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak 

mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. n%eksi dapat menggunakan syringe.

• olom kromatografi + kolom yang dipakai memiliki pan%ang !# / 01 cm dan diameter 

2,1 / 1 mm yang diisi dengan fase stasioner berukuran 1-!# mikrometer dan terbuat dari logam atau stainless steel.

• 3etektor + digunakan untuk mendeteksi sampel. 3etektor dibutuhkan untuk 

mempunyai sensitiitas yang tinggi, linear untuk %angka konsentrasi tertentu dan dapat mendekati eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi (Adnan,!""4$. egunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan se%umlah senya*a organik, anorganik, maupun senya*a biologis, penentuan molekul - molekul netral, ionic, maupun *itter ion, isolasi dan pemurnian senya*a, pemisahan senya*a-senya*a yang strukturnya hampir sama, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif  maupun kuantitatif (Adnan,!""4$.

5at dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan banyak digunakan dalam industi farmasi dan pestisida. HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar  senya*a aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk - produk degradasi dalam sediaan farmasi. eterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senya*a, kecuali %ika HPLC dihubungkan dengan spektrometer massa (6&$. eterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Adnan,!""4$.

Si#tem Pera(atan HPLC

nstrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas+ *adah fase gerak, p ompa, alat untuk

memasukkan sampel (tempat in%eksi$, kolom, detektor, *adah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

!. 7adah 8ase gerak dan 8ase gerak 

7adah fase gerak harus bersih dan lembam (inert$. 7adah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai *adah fase gerak. 7adah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara ! sampai 0 liter pelarut. 8ase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. 3aya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. 9ntuk  fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak$, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. &ementara untuk fase terbalik (fase diam kurang  polar daripada fase gerak$, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas  pelarut.

8ase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari  partikel-partikel kecil ini. &elain itu, adanya ga s dalam fase gerak %uga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor  sehingga akan mengacaukan analisis. :lusi dapat dilakukan dengan cara isokratik  (komposisi fase gerak tetap selama elusi$ atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi$ yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. :lusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama %ika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. 8ase gerak  yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. 9ntuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut- pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut  %enis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase

terbalik. 0. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat *adah pelarut yakni+ pompa harus inert terhadap fase gerak. ;ahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, ba%a tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 1### psi dan

mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir < mL=menit. 9ntuk tu%uan  preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 0# mL=menit. Tu%uan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak  adalah untuk men%amin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 0 %enis pompa dalam HPLC yaitu+  pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe  pompa dengan aliran fase gerak yang konstan se%auh ini lebih umum dibandingkan

dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. <. Tempat penyuntikan sampel

&ampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak  yang mengalir di ba*ah tekanan menu%u kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop$ internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

2. olom dan 8ase diam

Ada 0 %enis kolom pada HPLC yaitu kolom konensional dan kolom mikrobor. olom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya  proses pemisahan solut=analit.

olom mikrobor mempunyai < keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konensional, yakni+

• onsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya )#> atau lebih kecil dibanding

dengan kolom konensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (!# -!## ?l=menit$.

• Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal

 %ika digabung dengan spektrometer massa.

• &ensitiitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya

 %enis kolom ini sangat bermanfaat %ika %umlah sampel terbatas misal sampel klinis. 6eskipun demikian dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. ebanyakan fase diam  pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimia*i, silika yang tidak 

dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan diinil benen. Permukaan silika adalah  polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (&i-@H$.

&ilika dapat dimodifikasi secara kimia*i dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. eagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

@ktadesil silika (@3& atau C!)$ merupakan fase diam yang paling banyak  digunakan karena mampu memisahkan senya*a-senya*a dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. @ktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk  solut yang polar. &ilika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril$ lebih cocok sebagai  pengganti silika yang tidak dimodifikasi. &ilika yang tidak dimodifikasi akan memberikan *aktu retensi yang berariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

1. 3etektor HPLC

3etektor pada HPLC dikelompokkan men%adi 0 golongan yaitu+ detektor  uniersal (yang mampu mendeteksi at secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak   bersifat selektif$ seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa dan

golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor 9B-Bis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. dealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut+

• 6empunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

• 6empunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar 

yang sangat kecil.

• &tabil dalam pengopersiannya.

• 6empunyai sel olume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran

 pita.

• &ignal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran

yang luas (kisaran dinamis linier$.

• Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

;eberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut +

3etektor &ensitifitas (g=ml$ isaran linier  arakteristik   Absorbansi Uv-vis 8otometer filter  &pektrofotometer  spektrometer photo-diode array 1  !#-!# 1  !#-!# D 0  !#-!# !#2 !#1 !#1

&ensitiitas bagus, paling sering digunakan, selektif  terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak   %enuh.

8luoresensi !#-!0 _!#2 _{&ensitifitas sangat bagus,}

selektif, Tidak peka terhadap  perubahan suhu dan kecepatan

alir fase gerak.

ndeks bias 1  !#-4 _!#2 _{Hampir bersifat uniersal akan}

tetapi sensitiitasnya sedang. &angat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan  pada elusi bergradien

 Elektrokimia onduktimetri Amperometri !#-) !#-!0 !#2 !#1

Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. &ensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (%ika fase diamnya lebih  polar dibanding dengan fase geraknya$ atau fase terbalik (%ika fase diamnya kurang non polar 

dibanding dengan fase geraknya$. ;erdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan men%adi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. &elain klasifikasi di atas, HPLC %uga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan %enis-%enis HPLC sebagai berikut+

!. romatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar "#> kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Eugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

0. romatografi fase terikat

ebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimia*i atau fase terikat. &e%auh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. 8ase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (@3& atau C!)$ dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. &ebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. 9ntuk solut yang  bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase

gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam men%adi lebih lemah dibanding %ika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

<. romatografi penukar ion

CT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. ebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air  karena sifat ionisasinya. 3alam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya

air-alkohol dan %uga pelarut organik. romatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi  puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.

enaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus  penukar ion pada resin.

2. romatografi Pasangan ion

romatografi pasangan ion %uga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. &ampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berla*anan.

1. romatografi :ksklusi 9kuran

romatografi ini disebut %uga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senya*a dengan berat molekul D 0### dalton. 8ase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat mele*ati porus (le*at diantara partikel$, atau berdifusi le*at fase diam. 6olekul solut yang mempunyai ;6 yang %auh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang %auh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan ;6 yang besar tidak mele*ati  porus, akan tetapi le*at diantara partikel fase diam. 3engan demikian, dalam pemisahan

dengan eksklusi ukuran ini tidak ter%adi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

F. romatografi Afinitas

3alam kasus ini, pemisahan ter%adi karena interaksi-interaksi biokimia*i yang sangat spesifik. 8ase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel %ika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu  pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi$. romatografi %enis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enim$ dari campuran yang sangat kompleks (iai, !""1$.

3&RI9ATISASI PA3A HPLC

3eriatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk  mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tu%uan utama penggunaan deriatisasi pada HPLC adalah untuk+

!. 6eningkatkan deteksi

0. 6erubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik 

<. 6erubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik  2. 6enstabilkan ana analit yang sensitif.

3etektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor 9B-Bis sehingga  banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada pan%ang gelombang tertentu. 3i samping itu, %uga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senya*a yang mamapu berfluoresensi$ sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.&uatu reaksi deriatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni+ produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraiolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senya*a berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri proses deriatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar  mungkin (!## >$ produk hasil deriatisasi harus stabil selama proses deriatisasi dan deteksi serta sisa pereaksi untuk deriatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi (iai, !""1$. SI5AT %AHAN !. Paracetamol = Asetaminofen o C_<H₄NO -o %M = 181>1? o Pemerian

&erbuk hablur, putih, tidak berbau + rasa sedikit pahit

o elarutan

Larut dalam air mendidih dan dalam Ga@H !G mudah larut dalam etanol 0. ofeinum

o C_<H₁₀N_.O -o %M = 14.>14 o Pemerian

&erbuk putih atau bentuk %arum mengkilat putih, biasanya menggumpal tidak  berbau rasa pahit. Larutan bersifat netral terhadap kertas lakmus. ;entuk hidratnya

o elarutan

Agar sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar dalam eter.

. 8ase gerak  6etanol + Air   11 + 21 . 8ase gerak  6etanol + Air 

 21 + 11

II: ALAT %AHAN

Alat ;ahan

HPLC Paracetamol

Labu ukur 01 mL, 1 6l Coffein

 Bekker glass 6ethanol for HPLC ;otol timbang 6ethanol for pa  Geraca analitik

Pipet olum

III: CARA K&R;A

• Pembuatan paracetamol <# ppm

<# mg paracetamol dilarutkan dalam 01ml methanol  <#mg= 01 ml  !0# mg= !## ml  !0## ppm Pengenceran  30 _ppm 1200 _ppm   1 ml  #,!01 ml I !01 μl  ad 1 ml methanol • Pembuatan coffein <# ppm

<# mg coffein dilarutkan dalam 01ml methanol  <#mg= 01 ml  !0# mg= !## ml  !0## ppm Pengenceran  30 _ppm 1200 _ppm   1 ml  #,!01 ml I !01 μl  ad 1 ml methanol

• Pembuatan campuran paracetamol dan coffein

Pipet paracetamol !01 μl  ke dalam labu ukur 1 ml J coffein !01 μl   ad kan dengan methanol hingga tanda.

!. Pembuatan fase gerak 

;uat cammpuran methanol + air (21+11$ &aring dengan membrane filter 

3egassing selama !1 menit 0. Pembuatan larutan u%i

KLarutan standar paracetamol dalam methanol konsentrasi <# ppm &aring dengan membrane filter 

3egassing selama 1 menit

KLarutan standar coffein dalam methanol konsentrasi <# ppm &aring dengan membrane filter 

3egassing selama 1 menit

KLarutan campuran standar coffein-paracetamol dalam methanol konsentrasi <# ppm &aring dengan membrane filter 

3egassing selama 1 menit <. Penentuan pan%ang gelombang terpilih

6engamati spektrum tunggal paracetamol maupun coffein dengan spektro 9B 6entukan pan%ang gelombang dan lakukan pengamatan secara HPLC 2. Pemisahan paracetamol / coffein dengan HPLC

&etting HPLC denga pan%ang gelombang detector 9B (atur flo* rate ! ml=min$ 8lushing kolom dengan methanol for HPLC yang telah disaring dan didegass 6engganti methanol dengan fase gerak methanol + air (21+11$, tunggu kolom sampai

stabil

6engin%ect larutan standar paracetamol, coffein, campuran keduanya, amati kromaogram 6engubah komposisi fase gerak methanol + air (11+21$ untuk mendapatkan hasil

B. HASIL P&N'AMATAN

• Pembuatan fase gerak dan larutan yang dipakai dalam praktikum tidak dilakukan

 praktikan karena bahan tersebut telah tersedia di laboratorium.

• Hasil pengamatan pada perbandingan pelarut methanol + Air (21 + 11$

Tr A  0,40 cm 7a  #,11 cm Tr ;  2,## cm 7b  #,2 cm  Tr  2,##-0,40  !,0) cm 7aJ7b #,"1 s  2.

(

∆ Tr

)

Wa

+

Wb  2 X 1,28 0,95  2,56 0,95  0,F

• Hasil pengamatan pada perbandingan pelarut methanol + Air (F1 + <1$

Tr A  0,2) cm 7a  #,2 cm Tr ;  <,< cm 7b  #,1 cm  Tr  ),)-4,<  !,1 cm 7aJ7b #," s  2.

(

∆ Tr

)

Wa

+

Wb  2 X 0,82 0,9  1,64 0,9  !,) 9: P&M%AHASAN

Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan pemisahan paracetamol dan coffein dalam suatu sampel obat. nstrumen yang dipilih pada percobaan ini adalah kromatografi cairan kiner%a tinggi (HPLC$. Teknik HPLC merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yaitu suatu metode pemisahan dari suatu analit berdasarkan perbedaan interaksi antara

fasa diam dengan fasa geraknya. Teknik HPLC ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif  dan kualitatif. Analisis kuantitatif dapat dilihat dari pengukuran luas puncak=area dari analit  pada kromatogram yang dibandingkan dengan luas area standar dengan menggunakan kura

kalibrasi, pada percobaan kali ini digunakan dua deret larutan standar. Analisis kualitatif  dapat dilihat dari *aktu retensinya yang dibandingk an dengan standar.

Penggunaan %enis kromatografi fasa terbalik (reerse phase$ ini karena sampel yang akan kita pisahkan bersifat polar, oleh karena itu dalam %enis kromatografi ini fasa gerak  yang digunakan memiliki sifat yang polar yaitu campuran antara air + methanol dengan  perbandingan 21+11 dan fasa diamnya bersifat nonpolar biasanya fasa diam yang memiliki rantai alkil ) (C-)$ atau !) (C-!)$ dan dalam praktikum ini digunakan adalah oktadesilan (@3&$ .

3alam melakukan analisis perlu diperhatikan setiap tahapnya agar kesalahan yang ter%adi men%adi seminimal mungkin. &ampel u%i harus disaring dahulu dengan membran PT8: agar tidak ter%adi penyumbatan dalam kolom dan menghilangkan udara atau gas dari  pelarutnya. arena %ika sampel masih ada gas yang terlarut dapat menyebabkan gangguan  pada sistem pengatur gradient dari eluennya.

3i dalam kolom HPLC komponen-komponen dipisahkan berdasarkan perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. &olut yang berinteraksi kurang kuat maka akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut yang lebih kuat interaksinya. Prinsipnya  %uga dapat dikatakan sama dengan proses LT yakni like dissolve like, dimana senya*a yang lebih polar akan keluar lebih dahulu keluar kolom karena mengikuti fase gerak yang  bersifat polar %uga. omponen tersebut selan%utnya keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan apabila puncak keluar saling berdekatan sehingga sulit untuk dibedakan mana puncak parasetamol dan coffein maka fase gerak harus dibuat lebih polar.

Pengin%ekan pertama adalah campuran parasetamol-coffein dengan fase gerak air + methanol (21+11$. ead out dari hasil analisis dengan HPLC adalah suatu kromatogram. romatogram adalah grafik yang menghubungkan antara intensitas komponen yang diba*a oleh fasa gerak terhadap *aktu retensi. ;anyaknya puncak menun%ukkan %umlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi. 3ari hasil pengin%ekan pertama terlihat dua  peak yang muncul pada kromatogram dan diantara dua puncak tersebut terlihat %uga ada  puncak kecil yang nampak. 3ari hasil ini belum dipastikan secara %elas peak yang keluar 

lebih dahulu merupakan peak dari paracetamol atau coffein. @leh karena itu, praktikan melakukan pengin%ekan larutan standar paracetamol ke dalam kolom dengan kondisi fase gerak yang sama. 3ari hasil kromatogram terlihat bah*a peak  yang muncul memiliki *aktu retensi 0,4). 7aktu retensi tersebut merupakan %angka *aktu yang terukur saat sampel mele*ati kolom HPLC. Hasil tersebut memiliki kesamaan dengan kromatogram pertama  pada  peak  pertama. Hal ini menun%ukan bah*a  peak   yang yang muncul pertama pada  pengin%ekan campuran pertama adalah paracetamol. 3ari hasil tersebut %uga menun%ukan  bah*a memang benar paracetamol lebih polar dari coffein. Pada hasil kromatogram %uga terlihat  peak kecil yang sama seperti  peak yang muncul di antara kedua  peak   pada kromatogram campuran pertama tadi. 3ata tersebut menun%ukan bah*a peak  kecil tersebut hanya merupakan pengotor dan pengotor tersebut berasal dari sampel paracetamol. &etelah  pengin%ekan larutan standar parasetamol, praktikan tidak melakukan pengin%ekan larutan

standar coffein karena hanya terdapat dua peak   pada kromatogram campuran dan sudah dapat disimpulkan bah*a peak  yang muncul terakhir adalah coffein.

3ari data kromtogram sampel didapatkan puncak dari kafein lebih kecil dari pada  puncak paracetamol karena kadar dari kafein dalam sampel lebih sedikit. 3ari data kromatogram tersebut %uga menun%ukan bah*a pemisahan antara paracetamol dan coffein terlihat sempit. Hal tersebut dapat terlihat %elas dari gambar yang ditun%ukan dan dari rasio *aktu retensi yang sempit. @leh karena itu, praktikan mengubah fase gerak men%adi lebih  polar yakni air+ methanol (11+21$. &etelah sampel diukur, didapat kromatogram dari sampel. 3ari data kromatogram terlihat bah*a gambar pemisahan terlihat %elas dengan perbedaan *aktu retensi kedua senya*a tersebut adalah !,0). 3an puncaknya semakin bergeser ke kanan. 3ari kromatogram tersebut diperoleh harga s yakni 0,F. 3ibandingkan dengan kromatogram campuran pertama didapat perbedaan *aktu retensi kedua senya*a adalah #,)0 dan harga s adalah !,)0.

Pada dua fase gerak yang berbeda ini terlihat spektrum parasetamol dan coffein yang  berbeda, dapat terlihat mana pemisahan yang lebih baik antara campuran air + methanol

(21+11$ dan air + methanol (11+21$. Pan%ang gelombang yang digunakan adalah pan%ang gelombang terpilih, bukan pan%ang gelombang maksimum. Pada praktikum ini pan%ang gelombang yan g digunakan adalah 0F# nm. Pan%ang gelombang maksimum adalah pan%ang gelombang tertinggi dari parasetamol maupun coffein, tetapi bila digunakan pan%ang

gelombang tersebut ada kemungkinan spektrum salah satu (parasetamol atau coffein$ tidak  nampak. &ehingga digunakan pan%ang gelombang terpilih, pan%ang gelobang ini tidak harus maksimalnya dari pan%ang gelombang sampel. Pan%ang gelombang dipilih supaya kedua sampel spektrumnya dapat teramati. s yang baik adalah M!,1. s yang didapat pada  percobaan sudah sesuai dengan harga s yang baik sehingga pemisahan dapat dikatakan  baik.

7aktu keluarnya spectrum pada campuran air + methanol (21+11$ adalah parasetamol  pada menit ->-> coffein pada menit/>0 &edangkan pada air + methanol (11+21$ parasetamol keluar pada menit ke ->8> coffein keluar pada menit />.: Pemisahan lebih baik ter%adi pada campuran air + methanol (11+21$ karena kura tidak berhimpitan, pada campuran air + methanol (21+11$ kura berhimpitan. 9ntuk mendapatkan pemisahan yang baik adalah dengan meningkatkan kepolaran fase gerak dimana dalam praktikum ini yang ditambahkan olume fase geraknya adalah air. .

9I: K&SIMPULAN

Pada percobaan menggunakan instrument HPLC didapatkan puncak parasetamol lebih besar dibandingkan dengan coffein. Pemisahan paracetamol dan coffein yang paling  bagus adalah pada perbandingan konsentrasi methanol + air (11+21$ dengan harga s  0,F. 9ntuk mendapatkan pemisahan yang baik maka diubah kondisi fase gerak ke arah polar  apabila pemisahan terlalu sempit (s kecil$.

9II: 3A5TAR PUSTAKA

Adnan, 6. !""4. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Andi @ffset+ 'ogyakarta.

hopkar, &.6., !""#. Konsep Dasar Kimia Analitik . 9niersitas ndonesia + Nakarta. iai, H. !""1. Asas Pemeriksaan Kimia. Penerbit 9 + Nakarta.