IDENTIFIKASI POLIMORFIS MARKA-MARKA MOLEKULER YANG DIDUGA BERKAITAN DENGAN KARAKTER DAYA HASIL TINGGI PADA 30 GENOTIP PADI
Nono Carsono1*, Pradita N Lukman2, Farida Damayanti1, Untung Susanto4, Santika Sari3
1
Laboratorium Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran, 2
Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran, 3
Program Magister Pemuliaan Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran, Jl. Raya Bandung-Sumedang km. 21 Jatinangor, Sumedang, Jawa Barat 45363 Staf Peneliti pada Balai Besar Penelitian Tanaman Padi (BB Padi),
Jl. Raya Sukamandi, Subang, Jawa Barat.
*Alamat korespondensi: [email protected]
Abstrak: Identifikasi polimorfis marka yang diduga berasosiasi dengan karakter daya hasil tinggi sangat penting dilakukan guna aplikasi seleksi berbasis marka dalam rangka perakitan padi berdaya hasil tinggi. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi 30 genotip padi yang diduga berdaya hasil tinggi dengan menggunakan marka SSR. Amplifikasi produk PCR dipisahkan dengan menggunakan gel agarose 3% dan atau polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 8%. Tingkat keinformatifan marka dapat ditentukan dengan cara penghitungan Polymorphic Information Content (PIC). Hasil analisis menunjukan bahwa marka OSBLE3, RM 282, dan RM 259 memiliki nilai PIC 0,5. Marka SSR dan marka gene spesifik yang digunakan untuk mengidentifikasi padi berdaya hasil tinggi menunjukan bahwa tiga genotip padi terseleksi dapat direkomendasikan sebagai tetua donor dalam persilangan diantaranya yaitu genotip #1 (Fatmawati), #3 (Inpari13), dan #30 (IPB 160-F-3-3-1). Marka molekuler yang digunakan dapat memperkirakan tingkat polimorfisme dan juga berguna untuk mengkonfirmasi genotip padi yang berpotensi memiliki karakter daya hasil tinggi.
Kata kunci:hasil tinggi, marka polimorfis, padi, dan PIC.
Abstract: Identification of polymorphic markers that associated with high yielding character is highly important for application of marker assisted selection in developing such trait in rice. This study was aimed to identify SSR markers which was reported by some researchers to be associated with high yielding trait in 30 rice genotypes. PCR amplifications were separated on a 3% agarose or a 5% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The informative markers were determined by calculating the Polymorphic Information Content (PIC). The results of the analysis revealed that OSBLE3, RM 282, and RM 259 had PIC values 0.5 which were classified as informative markers. Based on SSR and the gene specific markers applied, genotype #1 (Fatmawati), #3 (Inpari13), dan #30 (IPB 160-F-3-3-1) are recommended as donor parents for developing high yielding rice lines. The molecular markers applied are able to estimate the level polymorphism and useful for confirming potential high yielding genotype.
Keywords:high yielding, PIC, polymorphic marker, and rice.
PENDAHULUAN
Beras merupakan makanan pokok bagi sebagian penduduk di dunia dan terutama di Indonesia. Peningkatan produktivitas tanaman padi merupakan bagian dari upaya untuk peningkatan produksi pertanian khususnya tanaman pangan. Ketersediaan tanaman pangan ini mengalami fluktuasi dari
waktu ke waktu, oleh karena itu untuk memenuhi kebutuhan pangan nasional maka produksi beras nasional perlu ditingkatkan (Deptan, 2008 dikutip Khomawatie, 2010).
digiling di industri penggilingan padi sebanyak 32.873.663 ton. Kebutuhan masyarakat terhadap beras sekitar 87.235 kg/kapita/tahun (Deptan, 2012) dengan jumlah penduduk Indonesia sekitar 230 juta jiwa, sehingga dibutuhkan sekitar 21 juta ton beras per tahun untuk mencukupi kebutuhan pangan. Permasalahan inilah yang membuat tanaman padi menjadi komoditas yang terus diusahakan dan dikembangkan agar dapat mencukupi kebutuhan pangan masyarakat. Oleh karena itu, Balai Besar Penelitian Tanaman Padi, Sukamandi, Subang bekerja sama dengan Laboratorium Pemuliaan
Tanaman Unpad untuk melakukan penelitian pengujian terhadap 30 genotip padi yang diduga berdaya hasil tinggi dengan menggunakan 10 marka yang terdiri dari empat marka SSR: RM 282 (Guo et al, 2009), RM 259 (Gramene, 2006), Rmw 513 (Weng et al, 2008), RM 531 (Gramene, 2006) dan enam marka gene spesifik, yaitu: FLO (Kyozuka et al, 1998), OsDOS (Kong et al, 1998), OsBLE3 (Yang et al, 2006), MOC1 (Li et al, 2003), GLN1;1 (Hakeem et al, 2012), dan NADH-NAR1 (Hakeem et al, 2012).
Tabel 1. Primer yang digunakan dalam Penelitian
No. Primer Chr Type Karakter yang
Diduga Terpaut Sumber
1 RM259 1 SSR Jumlah Malai Gramene
2 RM531 8 SSR Jumlah Malai Gramene
3 RMw-513 5 SSR Bobot bulir Weng et al. (2008)
4 RM282 3 SSR Bobot Bulir Guo et al. (2009)
5 FLO Gene-spesific primer Jumlah Malai Kyozuka et al. (1998) 6 OsDOS 1 Gene-specific primer Fase Senescence Kong et al. (2006)
gramene
7 OsBLE3 5 Gene-specific Primer Tinggi Tanaman Yang et al. (2006) Gramene
www.bioinformatics.nl 8 MOC1 6 Gene-Specific Primer (Tillering control in
rice)
Li et al. (2003) www.bioinformatics.nl 9 GLN1;1 Gene-specific Primer Kandungan Klorofil Hakeem et al. (2012) 10
NADH-NAR1
Gene-specific Primer Kandungan Klorofil Hakeem et al. (2012)
Marka-marka tersebut dipilih untuk mengkonfirmasi keberadaan dan polimorfisme (perbedaan ukuran) fragmen DNA yang dimiliki oleh 30 padi yang berdaya hasil tinggi koleksi BB Padi. Selain itu, 10 marka tersebut telah dilaporkan berkaitan dengan karakter daya hasil, baik daya hasil langsung maupun karakter komponen hasil, seperti jumlah malai, bobot bulir, fase senescence, tinggi tanaman, jumlah anakan, serta kandungan klorofil. Ketiga puluh genotipe padi yang memiliki potensi hasil tinggi dan digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 2.
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengidentifikasi marka-marka yang polimorfik sehingga data yang diperoleh
nantinya dapat digunakan untuk seleksi padi berdaya hasil tinggi. Selain itu varietas yang terseleksi dapat dijadikan tetua persilangan untuk perakitan padi berdaya hasil tinggi.
BAHAN DAN METODE
Percobaan dilakukan terdiri dari beberapa tahapan, yaitu isolasi DNA, spektrofometri, amplifikasi DNA (PCR), dan elektroforesis. Setiap tahapan percobaan memerlukan bahan yang berbeda.
Bahan Penelitian
(Cetyl Trimetil Ammonium Bromide), SDS, isopropanol, etanol 80%, buffer TE (Tris-Edta), alkohol 70%, pottasium asetat, cisam (fenol, kloroform, isoamil alkohol), cetakan DNA, gene specific primer dan SSR (Lampiran 2), Kappa polymerase, Top Vision Agarose (Fermentas), larutan TBE 0,5 x, 6 x loading Dye #R0611 (Fermentas), Gen Ruller #SM0311 1kb (Fermentas), Gen Ruller #SM0311 100bp (Fermentas), Ethidium Bromide (EtBr), dan DNA hasil PCR. Acrylamide 30%, ammonium persulfate 10%, TBE electrophoresis buffer 5x, H2O, TEMED.
Metode Penelitian Isolasi DNA Padi
DNA padi diisolasi dari sampel daun padi muda dengan menggunakan metode CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) (Doyle and Doyle, 1987 dengan modifikasi). Metode CTAB dilakukan melalui tiga tahap yaitu preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA, dan pemekatan DNA. CTAB berfungsi sebagai buffer pengekstrak yang dapat merusak membran menjadi suatu larutan kompleks yang mengandung DNA.
Table 2. Daftar genotipe yang diteliti
No. Genotipe Karakter menonjol Keterangan/Kontributor
1 Fatmawati Malai lebat VUB PTB/BB Padi
2 Ciherang Potensi Hasil VUB eksisting terpopuler/BB Padi 3 Inpari13 Umur sangat genjah VUB promising terpopuler/BB Padi 4 Silugonggo Umur sangat genjah VUB umur sangat genjah/ BB Padi 5 IR64/TIL 1 Adaptabilitas luas VU lama/BB Padi
6 TIL3 Potensi hasil NIL perbaikan IR64/ BB
Biogen/IRRI
7 TIL4 Potensi hasil NIL perbaikan IR64/ BB
Biogen/IRRI
8 TIL10 Potensi hasil NIL perbaikan IR64/ BB
Biogen/IRRI
9 Huanghuazhan Potensi hasil Calon VUB, GSR/BB Padi
10 Zhongzu14 Potensi hasil Calon VUB, GSR/BB Padi
11 ZX117 Tanaman tipe ideal Galur tipe baru, GSR/BB Padi 12 BP14574b-27-3-1M-3-2*B Umur ultra genjah Galur umur ultra genjah/ BB Padi 13 HIPA8 Malai lebat anakan sedang Hibrida/ BB Padi
14 HIPA Jatim 2 Daun bendera tegak, malai lebat Hibrida/ BB Padi 15 Ketan Putih (4655) Anakan paling banyak Plasma Nutfah/ BB Padi 16 Berem Batu (7818) Anakan paling sedikit Plasma nutfah /BB Padi 17 Padi Hungkai (3339) Jumlah gabah paling banyak Plasma nutfah /BB Padi 18 Nipponbare Jumlah gabah paling sedikit Plasma nutfah /BB Padi 19 BP14356e-1-B Galur sangat tegak Galur harapan/ BB Padi 20
B11143D-MR-1-PN-3-MR-3-Si-2-3-PN-1
PTB Galur tipe baru/BB Padi
21 B12404E-MR-20-PN-3-3 PTB Galur tipe baru/BB Padi
22 B12344-3D-PN-37-6 PTB Galur tipe baru/BB Padi
23 B12411E-MR-9-4-1 PTB Galur tipe baru/BB Padi
24 B12512E-MR-14-PN-1-3 PTB Galur tipe baru/BB Padi
25 PK21 Potensi hasil Tetua hibrida/BB Padi
26 PK88 Potensi hasil Tetua hibrida/BB Padi
27 IPB 3S Variasi daun bendera VUB/IPB
28 IPB159-F-3-1 Variasi daun bendera Galur harapan/ IPB 29 IPB159-F-17-1 Variasi daun bendera Galur harapan/ IPB 30 IPB160-F-3-3-1 Variasi daun bendera Galur harapan/ IPB
Kuantifikasi DNA dan pengujiann kualitas DNA melalui Spektrofotometri
UV-9200). Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA. Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm. Jumlah radiasi UV yang diserap oleh larutan DNA (absorbance = A) sebanding dengan jumlah DNA dalam sampel yang diukur. Hasil pengukuran dicatat dan dianalisis untuk membuat DNA template dengan konsentrasi 20 ng/microliter untuk digunakan dalam analisis PCR.
Amplifikasi DNA (PCR)
Pada tahapan ini, amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR membutuhkan temperatur, waktu, dan siklus yang berbeda untuk setiap primernya. Kappa DNA polymerase dimasukan kedalam tube sebanyak 9,5 µl/sample, kemudian primer forward dan reverse masing-masing dimasukan 1 µl/sample ke dalam tube, dilanjutkan dengan DNA template 1 µl/sample. Setelah tube dipersiapkan semuanya, kemudian mesin PCR diatur programnya sesuai dengan primer. Primer yang digunakan disajikan pada Tabel 1
Elektroforesis dan Visualisasi
Produk amplifikasi dielektroforesis dengan menggunakan gel agarose 3% dan atau polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 8%. Gel agarose 3% digunakan untuk elektroforesis beberapa primer seperti FLO, OSDOS, GLN1, dan NADH- NAR1 yang merupakan gene specific primer, sedangkan empat primer SSR dan dua gene specific primer lainnya menggunakan PAGE dikarenakan pada gel agarose tidak memperlihatkan polimorfisme. Selain itu, gel akrilamid mampu mendeteksi lebih banyak alel per lokus apabila susunannya berbeda 2bp.
Visualisasi dilakukan dengan menggunakan alat gel documentation system (Syngene) untuk melihat fragmen-fragmen DNA yang berbentuk pita-pita DNA. Setiap ukuran pita DNA berhubungan dengan karakter yang akan diamati.
Analisis Data
Analisis data molekuler dilakukan dengan skoring pita hasil visualisasi DNA. Setiap pita yang muncul pada gel merupakan alel tertentu. Alel tersebut diterjemahkan menjadi data biner yang diberi nilai berdasarkan ada tidaknya suatu alel (Hairinsyah, 2010). Nilai satu atau (+) akan diberikan apabila terdapat alel, dan nilai 0 atau (-) bila tidak terdapat alel.
Analisis persentase alel polimorfis dihitung untuk melihat berapa persen alel polimorfisme yang terbentuk di setiap primer yang digunakan. Untuk menghitung persentase pita polimorfis, digunakan rumus:
% Polimorfis = Jumlah alel polimorfis Total alel
Tingkat keinformatifan primer ditentukan dengan cara penghitungan Polymorphic Information Content (PIC) (Hildebrand, 1992) dengan menggunakan program online
PIC Calc yang tersedia di
http://www.genomics.liv.ac.uk/animal/Pic1.h tml.
Nilai PIC dijadikan standar untuk mengevaluasi marka genetik berdasarkan pita DNA hasil amplifikasi PCR, oleh karena itu nilai PIC dibagi menjadi tiga kelas yaitu PIC > 0.5 = sangat informatif, kemudian 0.25 > PIC > 0.5 = sedang, dan PIC < 0.25 = rendah.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari 10 primer yang digunakan, terpilih 6 primer yang polimorfis seperti yang disajikan pada Tabel 1.
Table 3. Daftar primer yang terpilih
No. Primer Karakter
terpaut
Jumlah alel polimorfis
Terdapat pada padi nomor
Polimor-fis (%) PIC Sumber
1 FLO Jumlah
Malai 2
1, 2, 4, 6, 7, 10, 13, 14, 17,
18, 21, 22, 24, 27 100
0,1167 Kyozuka et al.
(1998)
2 OSBLE3 Tinggi
Tanaman 4
1, 3, 5, 7, 8, 11, 13, 20,
25, 30 100
0,5786 Yang et al.
(2006)
3 MOC1
Tillering control in rice
2
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 28, 29, 30 100
0,3146
Li et al. (2003)
4 OSDOS Fase
Senescence 2
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30
100
0,2905 Kong et al.
(2006)
5 RM 259 Jumlah
Malai 3
1, 2, 3, 18, 22, 23, 24, 25,
26, 27, 28, 29, 30 100
0,5622
Gramene
6 RM 282 Bobot Bulir 5 1-30 kecuali 18, 25, 26, 27 80 0,765 Guo et al. (2009)
Sedangkan empat primer lainnya belum dapat mengamplifikasi dengan baik yang mungkin disebabkan karena program PCR nya yang belum tepat. Selain itu, primer yang tidak sesuai dengan sekuens DNA padi yang diteliti, juga dapat menyebabkan produk tidak teramplifikasi karena tidak terdapat kecocokan yang komplemen antara DNA padi dengan sekuens primer yang digunakan.
Primer-primer yang informative ditunjukkan oleh nilai PIC 0.5 (Zhang et al, 2011), sedangkan primer yang memiliki nilai PIC yang semakin besar merupakan primer terbaik yang dapat digunakan sebagai penanda molekuler seperti primer OSBLE 3, MOC1, dan RM 259. Nilai PIC untuk enam primer terpilih berkisar antara 0,1-0,76. Nomor tanaman yang terseleksi oleh enam primer yang polimorfis yaitu sampel #1 (Fatmawati), #3 (Inpari13), dan #30 (IPB 160-F-3-3-1). Ketiga genotipe tersebut dapat direkomendasikan sebagai tetua untuk persilangan guna perakitan padi yang berdaya hasil tinggi. Salah satu contoh hasil elektroforesis PAGE dengan menggunakan marka MOC1, disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. Pola pita DNA pad 19-27 menggunakan marka MOC
Kesimpulan
1. Dari sepuluh marka yang diperoleh enam marka yang yaitu FLO, OSLBE3, MOC RM 259, RM 282;
2. Marka yang informative ditun OSBLE 3, RM282 dan RM 25 3. Genotip-genotip yang ters
marka molekuler yang berka potensi hasil tinggi yaitu Inpari13, IPB 160-F-3-3-1. Ke tersebut dapat direkomendasi tetua persilangan dalam per yang berdaya hasil tinggi.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih kami sampai Balai Besar Penelitian Tana Sukamandi, Subang yang tela sebagian penelitian ini me Konsorsium Padi Nasional.
DAFTAR PUSTAKA
Badan Pusat Statistik, (2012). A http://www.bps.go.id/?news= Departemen Pertanian, (2012). A
http://www.deptan.go.id/Ind 15b-konsumsi-rata.pdf Doyle, J.J. & Doyle, J.L. (1987).
plant DNA from fresh tiss
12, 13-15. 200 bp
100 bp
adi genotipe # OC1.
g digunakan, ng polimorfis, C1, OSDOS,
tunjukkan oleh 259.
rseleksi oleh kaitan dengan u Fatmawati, Ketiga genotip asikan sebagai erakitan padi
aikan kepada naman Padi, lah mendanai elalui Dana
Available at: s=955
. Available at :
ndikator/tabe-. Isolation of issues. Focus,
Gramene, (2006). Oryza Available
http://www.gramene.org/spe ce_taxonomy.html
Guo, L., Lilian, M., Hua, J., Da H., Liwen, W., & Zhenyu Genetic analysis and fine two genes for grain shape a rice. Journal of Integr Biology, 51(1), 45-51. Hairinsyah, (2010). Pendugaa
genetik dan analisa keraga kelapa sawit (Elaeis guin dengan marka Simple Sequ (SSR). IPB. Bogor. A http://repository.ipb.ac.id/ha 789/ 46891.
Hakeem, K, R.., Ruby, C., Parva A., & Muhammad, Physiological and molecula applied nitrogen in rice gen Science, 19(1), 1-10. Khomawatie, I. (2010). Eksp
padi transgenik pembawa g terhadap variasi dosis nitrogen. Institut Pertan Available
http://repository.ipb.ac.id/bi le/123456789/59280/ G10ik Kong, Z., Yang, W., Xue, Y., L W. (2006). A novel nucl CCCH-type zinc fing OSDOS, is involved in d senescence in rice (Oryza Plant physiology, 141(4), 13 Kyozuka, J., Saeko, K., K Takeshi, I., & Ko, S. (19 regulation of RFL, the homolog of rice, accom panicle branch initiation. Pr Sci USA, 95(5), 1979-1982. Li, X., Qian, Q., Zhiming, F., Y Guosheng, X., Dali, Z., X Xinfang, L., Sheng, T., F Ming, Y., Da, L., Bin, H., (2003). Control of tiller Nature, 422, 618-621.
a Taxonomi. at species/oryza/ri
Dali, Z., Jiang, yu, G. (2009). ne mapping of e and weight in grative Plant
aan parameter gaman genetik ineensis Jacq) quence Repeat Available at /handle/123456
rvaiz, A., Altaf, I. (2012). ular analysis of enotypes. Rice
spresi fenotipe gen Csnitr1-L s pemupukan tanian Bogor. at /bitstream/hand 0ikh.pdf
, Li, M., & Xu, uclear-localized nger protein, delaying leaf yza sativa L).
1376-1388. Keisuke, N., 1998). Down-the FLO/LFY
mpanied with Proc Natl Acad
2.
Sambrook, J., & David, W.R. (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual.
Weir, B.S. (1990). Genetic Data Analysis: Methods for Discrete Genetic Data Sunderland Massachusetts. Sinauer Associates.
Weng, J., Suhai, Gu., Xiangyuan, Wan., He, Gao., Tao, Guo., Ning, Su., Cailin, L., Xin, Z., Zhijun, C, Xiuping, G., Jiulin,
W., Ling, J., Huqu, Z., & Jianmin, W. (2008). Isolation and intial characterization of GW5, a major QTL associated with rice grain width and weight. Cell Res, 18(12), 1199-209. Yang, G., Ichikawa, H., Komatsu, S.,
