PERCOBAAN VII KINETIKA REAKSI ENZIM I. Tujuan
Dapat memahami kinetika reaksi enzim dan factor-faktor yang mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim
II. Teori Dasar
Enzim mengkatalisis hampir semua reaksi-reaksi biologis penting. Oleh karena itu bagi ahli kesehatan pengetahuan mengenai sifat-sifat kimia dan fungsi enzim sangat diperlukan apabila akan mempergunakannya dalam prosedur diagnosa. Beberapa cabang ilmu kesehatan telah memperoleh manfaat dari pemakaian analisis enzim ini, seperti pada penyakit infark miokardial, hepatitis, kanker prostat, penyakit penyumbat hati. Aktivitas enzim pada beberapa penyakit mungkin tinggi dan pada beberapa yang lainnya mungkin rendah. Proses uji enzim juga menjadi semakin penting pada pemeriksaan genetik, karena dapat dipakai untuk mendeteksi pembawa heterozigot penyakit-penyakit keturunan seperti fenilketonuria. Telah diketahui dengan jelasbahwa enzim jaringan didistribusikan dengan cara yang terorganisasi baik; sel bukan hanya meruipakan “kantong longgar” enzim. Namun hasil dari reaksi enzim dalam satu komponen jaringan akan mempunyai pengaruh cukup besar pada proses enzim lain pada komponen yang lainnya dalam jaringan tersebut atau bahkan pada jaringan yang lainnya sama sekali. Pengetahuan yang lebih mendalam mengenai distribusi enzim didlaam sel menjadi sangat penting guna pemahaman mekanisme penyakit beserta terapinya.(Mentgomery,Rex. 1993)
membentuk ion bikarbonat. Disosiasi ini tentunya tidak tergantung pada katalisis enzim, tapi merupakan sifat struktur asam itu sendiri.
H2O + CO2 ↔ HCO3↔ H+ + HCO3
-Penguraian asam karbonat tapa melalui katalisis menjadi H2O dan CO2 tidak terjasi seketika. karena laju reaksi ini dalam kenyataanya sangat lambat, keseimbangan mungkin tidak akan tercapai dalam 1 jam. Jika diambil contoh air karbonat lalu ditambahkan enzim anhhidrase kabonat, maka keseimbangan akan tercapai dalam 1 menit. Sel darah merah dalam tubuh sangat kaya memacu perubahan CO2menjadi bikarbonat melalui bentuk perantara asam karbonatyang terdisosiasi. (Mentgomery,Rex. 1993)
Enzim dibagi menjadi enam bagian berdasarkan mekanisme reaksinya, antara lain:
Oksidoreduktase adalah kelompok enzim yang mengkatalisis reaksi oksidasi dan reduksi. Contohnya yaitu alkohol dehidrogenase, suatu oksidoreduktase untuk mengkonversi alkohol menjadi aldehid atau keton.
Transferase adalah kelompok enzim yang mengkatalisis pemindahan gugus fungsional. Contohnya yaitu aminotransferase, suatu transferase yang mengkatalisis degradasi asam amino dengan membuang gugus amin.
Hidrolase yaitu kelompok enzim yang mengkatalisis hidrolisis berbagai ikatan. Contohnya yaitu glukosa-6-fosfatase, suatu hidrolase yang membuang gugus fosfat dari glukosa-6-fosfat, meninggalkan glukosa dan asam tetrafosfat.
Liase adalah kelompok enzim yang memotong berbagai ikatan selain hidrolisis dan oksidasi. Contohnya yaitu piruvat dekarboksilase, suatu liase yang membuang karbondioksida dari piruvat.
Isomerase adalah kelompok enzim yang mengkatalisis perubahan isomerasi di dalam molekul tunggal. Contohnya yaitu ribulosa fosfat epimerase, suatu isomerase yang mengkatalisis interkonversi ribulosa-5-fosfat dan xylulosa-5-fosfat.
mengkatalisis interkonversi glukosa dan ATP dengan glukosa-6-fosfat dan ADP. (Suryono. 2011)
Kecepatan enzim pengatur didalam sel dapat ditingkatkan atau diturunkan oleh perubahan konsentrasi substrata tau produk, oleh senyawa enzim yang mengubah ketersediaan gugus fungsional ditempat aktif atau oleh perubahan jumlah enzim yang tersedia. Mekanisme pengaturan tergantung pada jalur metabolic dimana enzim berada dan tujuan pengaturan. (Allan, Collen dan Dawn. 1996)
Kecepatan dan konsentrasi substrat
Kecepatan semua enzim tergantung pada konsetrasi substrat. Ketergantungan ini dapat mengatur jalur metabolic apabila pasokan substrat bagi enzim dengan kecepatan terbatas berubah-ubah sesuai dengan kebutuhan akan jalur yang bersangkutan. Persamaan kinetika enzim memberi suatu cara kuantitatif untuk menjelaskan enzim dalam kaitannya dengan ketergantungan enzim terhadap konsentrasi substrat. (Allan, Collen dan Dawn. 1996)
Persamaan Michaelis-Menten
tinggi konsentrasi substrat makin tinggi konsentrasi ES, dan makin tinggi kecepatan reaksi. (Allan, Collen dan Dawn. 1996)
Km enzim untuk suatu substrat didefinisikan sebagai konsentrasi substrat dimana V1 sama dengan separuh Vmakx dikali Km biasanya setara dengan (K2+K3)/K1 atau kombinasi konstanta kecepatan yang lebih komplek dimana kecepatan disosiasi muncul dibagian pembilang dan kecepatan pengikatan dibagian penyebut. (Allan, Collen dan Dawn. 1996)
Persamaan Briggs-Haldone
Persamaan Briggs-Haldonemenyatakan dimana lajureaksi pembentukan kompleks ES sama dengan laju reaksi penguraian ES menjadi P dan E yang akan menghasilkan persamaan yang sama untuk hubungan laju reaksi enzim dengan konsentrasi substrat. (Murrey, Robert K. 2002.)
(Vo=Vmax .[S])/([S]+ Km)
III. Alat dan Bahan ALAT - Stop watch - Tabung reaksi - Pengaduk gelas - Pipet ukur - Pipet tetes
- Water bath 35 Oc - Kertas saring - Kuvet
BAHAN - Larutan TCA 20% - Larutan kasein 2 %
(b/v)
- Larutan dapar fosfat 0,1 M Ph 8,0
- Larutan NaOH 0,5 N - Aquadest
- Reagen
folin-ciocalteu
- Larutahn tripsin
IV. Prosedur
V. Hasil Pengamatan dan Perhitungan Hasil pengamatan :
Tabung A0 A20 ΔA
(A0. A20)
ΔT (T20-T0)
V( ∆ A∆T )
1
V s=
Vkasein Vtotal ×2 )
1 S
1 0,010 -0,019 -0,029 20 -1,45×10-3 -689,655 2,85×10-4 3508,771 2 -0,004 -0,015 -0,021 20 -1,05×10-3 -952,381 1,42×10-3 704,225 3 -0,002 -0,028 -0,026 20 -1,3×10-3 -769,231 2,85×10-3 350,877 4 -0,037 -0,026 -0,063 20 -3,15×10-3 -317,46 8,57×10-3 120,918
5 -0,025 -0,020 -0,045 20 -2,25×10-3 -444,444 0,0142 70,42
Hasil Perhitungan :
Antara sumbu x (1/s) dan y(1/v) A = -588,107
b = -0,048 r = -0,279 y = bx+a y =0
0 = -588,107 x – 0,048 0,048 = -588,107x
x = 0,048/-588,107 = -8,161×10-5 2. Mencari Vmaks
Vmaks = 1/b
= 1/-0,048 = -20,833 3. Mencari Km
Km = a× Vmaks
= -588,107×-20,833 = 12252,033
4. Kurva
VI. Pembahasan
faktor-faktor yang mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim. Pada praktikum mengenai kinetika reaksi enzim ini pengerjaan dibagi menajadi 2 bagian waktu, yaitu dengan t=0 dan t=20.
Pada t=0 di masukan tripsin, buffer fosfat , dan TCA 20% pada tabung 1-5 dengan volume yang berbeda. Lalu di inkubasi selama 30 menit lalu di tambahkan kasein . Begitu pula dengan tabung t=20. Data yang diperoleh yaitu dari tabung 1-5, larutan berwarna putih keruh di bagian atas dan bagian bawah sedikit bening. Perbedaan dari kedua waktu tersebut yaitu terletak pada pengerjaannya, yaitu pada t=0 pemberian kasein dilakukan terakhir setelah dimasukkan larutan buffer fosfat, tripsin serta TCA 20%. Sedangkan pada t=20 kasein dimasukkan diawal sebelum memasukkan larutan buffer fosfat dan larutan tripsin agar terlihat reaksi awal yang terjadi pada kasein.
Dalam hal ini tripsin berperan sebagai enzim yang akan dianalisis kinetika reaksinya yang mempunyai pH 6-8 sedang kasein berperan sebagai substrat yang akan bereaksi dengan tripsin (enzim). Yang dimana suatu enzim mempunyai ukuran yang lebih besar daripada substrat. Oleh karena itu tidak seluruh bagian enzim dapat berhubungan dengan subsrtat. Hubungan antara substrat dengan enzim hanya terjadi pada bagian atau tempat tertentu saja. Tempat atau bagian enzim yang mengadakan hubungan atau kontak dengan substrat dinamakan sebagai bagian aktif (active site). Hubungan hanya mungkin terjadi apabila bagian aktif mempunyai bentuk atau konformasi lain. (Poedjiadi,2009)
isoelektrik, pH pada titik isoelektrik, sebagian patokan, berbeda dengan pH pada waktu aktivitas maksimal. Jika enzim diberi pada pH yang ekstrim maka akan terdenaturasi. Kemudian larutan TCA disini digunakan sebagai agen yang dapat mempresipitasi enzim agar dapat menghentikan reaksi enzimatika, sehingga enzim menjadi in aktiv dan enzim akan kehilangan fungsi katalitiknya. Kemudian di inkubasikan pada suhu 35oC karena agar sesuai dengan suhu tubuh. Lalu didiamkan dalam air es yang berfungsi agar proses presipitasi menjadi lancar dan menghasilkan endapan. Kemudian disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan pelletnya. Filtratnya diambil untuk diuji dengan metode Anson.
Metode Anson yaitu adanya penentuan konsentrasi produk yang dihasilkan dari reaksi tripsin-kasein menggunakan spektrofotometer. Metode Anson bertujuan untuk supaya jumlah substrat bisa diketahui yang dikatalisis oleh enzim. Penambahan NaOH pada metode Anson ini untuk menetralkan filtrat TCA yang bersifat asam dan ditambahkan juga folin ciocalteu yang berfungsi untuk memberikan warna untuk pembacaan absorbansi pada spektrofotometer. Kemudian ditetapkan serapannya pada 650 nm, pada serapan tersebut merupan panjang gelombang maksimum larutan yang diuji. Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu objek kaca. Sebagian cahaya akan diserap dan sebagian lagi dilewatkan. Pada percobaan kinetika reaksi enzim ini didapat nilai Vmaks = -20,833, dan didapat nilai Km =12252,033 .
VII. Kesimpulan
Ketika semua enzim berada dalam keadaan ES (jenuh oleh substrat), laju reaksi mencapai nilai maksimum pada kecepatan absorban per detik. Beberapa faktor yang mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim
diantaranya adalah derajat keasaman (pH), suhu inkubasi, dan ada tidaknya inhibitor.
V maksimum didapat sebesar -20,833, dan didapat nilai Km 12252,033 .
VIII. Daftar Pustaka
Allan, Collen dan Dawn. 1996. Biokimia Kedokteran Dasar. Jakarta: EGC Montgomery, rex, dkk. 1993. Biokimia. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta
Murrey, Robert K. 2002. Biokimia, Jakarta : Harper Ecg
Poedjiadi, anna dan Suprianti, Titin. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas
