BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Sesuai dengan latar belakang, rumusan masalah dan tujuan penelitian maka penelitian ini dilakukan secara eksperimental, dengan rancangan penelitian yang digunakan adalah Randomized Pre-Post Test Control Group Design.
Rancangan penelitian dapat digambarkan dengan skema sebagai berikut : O1 _______P0_______ O2 P S R O3 _______P1_______ O4 O5 _______P2_______ O6 Bagan 4.1 Skema Rancangan Penelitian in vivo
Keterangan :
P = Populasi
S = Sampel
R = Random
O1,O3, O5 = Observasi pre test sebelum perlakuan (kelompok pre-test). O2 = Observasi post test kelompok kontrol (kelompok plasebo). O4, O6 = Observasi post test kelompok perlakuan (kelompok post-test). P0 = Plasebo dengan injeksi aquadest subkutan 0,1 ml selama 28 hari. P1 = Perlakuan dengan injeksi GH subkutan 0,044 IU / 0,1 ml
P2 = Perlakuan dengan injeksi GH subkutan 0,022 IU/ 0,1 ml selama 28 hari.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian 4.2.1 Tempat Penelitian
1. Penelitian dilaksanakan di Animal Unit Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Denpasar.
2. Pemeriksaan histopatologi di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, Denpasar.
4.2.2 Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama 10 minggu dari pertengahan bulan Februari sampai Maret 2011, dengan perincian sebagai berikut :
Minggu I-IV = Persiapan, pengumpulan, pemilihan dan adaptasi tikus. Minggu V-VIII = Pemberian perlakuan pada tikus selama 28 hari (4 minggu). Minggu IX = Pembedahan tikus dan pembuatan preparat histologi otot. Minggu X = Pembacaan preparat histologi otot.
Lama perlakuan berdasarkan penelitian terdahulu mengenai pemberian terapi injeksi GH baru akan memberikan hasil setelah 6 bulan, sehingga pemberian GH menghambat proses penuaan pada tikus selama 28 hari (Nathasa, 2007).
4.3 Subjek dan Sampel 4.3.1 Kriteria Subjek
Sampel dalam penelitian in vivo adalah tikus (Rattus norvegicus) dewasa, yang memenuhi kriteria inklusi dan kriteria eksklusi sebagai berikut :
Kriteria Inklusi :
a. Tikus (Rattus norvegicus) dewasa dan sehat. b. Jantan, umur 6 bulan.
c. Berat 161-162 gram .
Kriteria Drop out : apabila tikus tidak mau makan dan apabila tikus mati pada saat penelitian.
Penentuan umur sampel berdasarkan pertimbangan usia matang tikus 6 bulan sedang usia dewasa manusia 19 tahun (Ducommun, 2007).
Sehingga diputuskan untuk menggunakan tikus usia 6 bulan.
4.3.2 Besaran Sampel Rumus Pocock
Pada penelitian ini perhitungan jumlah sampel dihitung dengan rumus (Pocock, 2008).
Rumus : n = 2σ2
_______________ x f (α,β)
n = jumlah sampel
σ = simpangan baku (SD) = 3,96
α = tingkat kesalahan I (ditetapkan 0,05) tingkat kemaknaan (1-α) = 0,95 β = tingkat kesalahan II (ditetapkan 0,1) f(α,β) = nilai pada tabel = 10,8
µ1 = rerata jumlah miofibril sebelum perlakuan µ2 = rerata jumlah miofibril setelah perlakuan
Dari penelitian pendahuluan diperoleh peningkatan jumlah myofibril dalam muscle fibre rata-rata dari 22,93 menjadi 35,85 pada kelompok I dengan SD 3,1 dan 32,43 pada kelompok II dengan SD 3,31 maka diperoleh :
n = 3
Dari rumus (Pocock, 2008), jumlah sampel (n) minimal yang diperoleh = 3 Pada penelitian ini terdapat kelompok pre-test yang terdiri dari 15 ekor tikus dan kelompok post-test yang terdiri dari 15 ekor tikus, yang kemudian dibagi menjadi 3 kelompok , yaitu : kelompok kontrol, kelompok dosis tinggi dan kelompok dosis rendah, masing-masing kelompok terdiri dari 10 ekor tikus yang diambil secara random, diberi label, sehingga total tikus yang digunakan berjumlah 30 ekor tikus. 4.3.3 Teknik penentuan sampel
a) Dari populasi tikus (Rattus norvegicus), diadakan pemilihan sampel berdasarkan kriteria inklusi : jenis jantan , sehat, umur6 bulan, berat 161-162 gram.
b) Dari sejumlah sampel yang telah memenuhi syarat diambil secara random untuk mendapatkan jumlah sampel yang diinginkan yaitu 30 ekor.
c) Dari sampel ini kemudian dibagi 3 kelompok secara random yaitu kelompok kontrol dan kelompok perlakuan , masing-masing 10 ekor.
d) Dari masing-masing kelompok ini diambil 15 ekor secara random yang akan diambil sebagai pre-test dan sisanya 15 ekor akan menjadi kelompok post test.
4.4 Variabel
4.4.1 Klasifikasi variabel
Variabel dalam penelitian ini adalah :
1. Variabel bebas (independent variable) : pemberian Growth Hormone.
2. Variabel tergantung (dependent variable) : adalah Lean Body Mass dengan indikator :
a. Jumlah miofibril pada pembesaran 100x pada potongan melintang (sagital).
b. Jumlah nukleus miofibril pada pembesaran 400x pada potongan melintang (sagital).
3. Variabel kendali : kualitas – kuantitas dari makanan dan kandang. 4.4.2 Definisi Operasional Variabel
1. Growth Hormone adalah hormon peptida yang berbentuk protein. GH merangsang pertumbuhan , reproduksi sel dan regenerasi pada manusia dan binatang. GH terdiri dari 191 asam amino, polipeptida rantai tunggal yang disintesa, disimpan dan disekresikan oleh sel-sel somatotrop di area lateral kelenjar hipofise anterior. Growth hormone memberikan efek terhadap masa otot manusia melalu hiperplasi sarkomer , yang pada tikus tampak dengan terjadinya hiperplasi miofibril dan perubahan lebar Band A dan Band I otot. 2. Injeksi Growth Hormone : sediaan Growth Hormone dalam bentuk
Recombinant Human Growth Hormone (rhGH) yang diberikan per injeksi subkutan dengan dosis 0,044 IU dalam 0,1 ml atau 0,0205 IU dalam 0,1 ml setiap harinya selama 28 hari.
3. Lean Body Mass : adalah masa tubuh tanpa lemak, dalam penelitian ini ditentukan oleh :
- Jumlah miofibril
- Jumlah nukleus dalam miofibril - Lebar Band A dan Band I
4. Miofibril : adalah bagian dari sel otot, yang merupakan bundle dari miofilamen (actin dan myosin). Miofibril terbagi menjadi beberapa segmen yang disebut dengan sarkomer.
5. Lebar Band A dan Band I secara kualitatif: adalah menunjukkan struktur dasar kontraksi serat otot. Serabur yang relaksasi menunjukkan gambaran yang khas, garis yang lebih gelap menunjukkan Band A dan garis yang lebih terang menunjukkan Band I. Disebutkan bahwa Band I terbelah menjadi 2 bagian oleh garis yang tipis namun gelap (Z line), sedangkan Band A dibelah oleh garis yang terang (Zona H).
6. Tikus : tikus jantan, sehat, berumur 5-6 bulan dan berat badan 161-162 gram. 7. Proses penuaan pada otot tikus : perkembangan ke arah menjadi tua pada otot
dengan melihat jumlah miofibril, jumlah nukleus dalam miofibril, gambaran lebar Band A dan Band I otot.
4.5 Hubungan Antar Variabel
Bagan 4.2 Kerangka Hubungan Antar Variabel
4.6 Bahan dan Instrumen penelitian 4.6.1 Bahan Growth Hormone
Perhitungan :
Penelitian Wilson (1991), Cuneo (1998), Kim (1999) dan Tjay (2008) menggunakan dosis GHRT initial relatif tinggi yaitu 0,15 IU/kg/minggu atau 0,03 IU/kg/hari yang berarti sekitar 2,1 IU/hari untuk manusia dewasa dengan berat badan (bb) 70 kg.
VARIABEL TERGANTUNG LBM dengan indikator : ________________________________ Jumlah miofibril
Jumlah nukleus dalam miofibril Gambaran lebar Band A dan Band I
VARIABEL KENDALI
Kualitas – kuantitas dari makanan dan kandang Genetik Rattus norvegicus
Jenis kelamin jantan VARIABEL BEBAS
Sedangkan menurut Hertoghe (2006) dosis GHRT optimal adalah 0,3 -1,2 IU/ hari, menurut Pangkahila (2007) adalah 0,45-0,9 IU/hari dan menurut Bengtsson & Johannsson (2000) adalah 0,6 – 1,8 IU/ hari. Berdasarkan referensi dosis ini dibuatlah dua bahan injeksi GH dengan dosis berbeda, dosis I : lebih tinggi dan dosis II : lebih rendah yaitu separuh dari dosis I.
Dosis I
Manusia dewasa dengan bb 70 kg, dosis GH = 0,03 IU x 70/hari = 2,1 IU/hari. Konversi manusia ke tikus (berat badan 161 gram) = dikalikan dengan 0,02093 (Paget, 1964 dikutip dari Tjhay, 2008; Laurence dan Bocharch, 1964 dikutip dari Ngatidjan, 2006).
Dosis GH tikus (161 gram) = 0,02093 x 2,1 IU/hari = 0,043953 IU/hari = 0,044 IU/hari.
Dosis GH tikus (162gram) = 162/161 x 0,043953 IU/hari = 0,044226 IU/hari = 0,044 IU/hari.
Satu vial berisi bubuk steril 16 IU hormon human recombinant somatropin. Volume injeksi yang akan diberikan pada tikus sebanyak = 0,1 ml.
Maka perhitungan pengenceran :
0,044 16 --- = --- 36,3636 0,1 ml
Pengenceran dengan diberikan 36,3636 ml aqua pro-injeksi untuk setiap 1 vial hormon human recombinant somatropin, menghasilkan dosis 0,044 IU/0,1 ml.
Perlakuan I diberikan dosis 0,044 IU/ 0,1 ml/hari. Dosis II
Manusia dewasa dengan bb 70 kg, dosis GH = 0,5 x 2,1 IU/hari = 1,05 IU/ hari. Konversi manusia ke tikus (berat badan 161 gram) = dikalikan dengan 0,02093. Dosis GH tikus (161 gram) = 0,02093 x 1,05 IU/hari = 0,0219765 IU/hari = 0,022 IU/hari.
Dosis GH tikus (162 gram) = 162/161 x 0,0219765 IU/hari = 0,0221129 IU/hari = 0,022 IU/hari.
Satu vial berisi bubuk steril 16 IU hormon human recombinant somatropin. Volume injeksi yang akan diberikan pada mencit sebanyak = 0,1 ml.
Maka perhitungan pengenceran :
0,022 16 --- = --- 72,72 ml 0,1 ml
Pengenceran dengan diberikan (2 x 36,36) ml = 72,72 ml aqua pro injeksi untuk setiap 1 vial hormon recombinant somatotropin, menghasilkan dosis 0,020475 IU/ 0,1 ml. Maka perlakuan II diberikan dosis 0,022 IU/0,1 ml/hari.
4.6.2 Hewan percobaan
Dalam penelitian ini digunakan tikus jantan umur 6 bulan, diperkirakan memasuki masa dewasa, berat badan 161-162 gram. Tikus dipelihara di kandang dengan persyaratan sesuai dengan penelitian eksperimental, yaitu tikus ditempatkan dalam kandang yang terbuat dari plastik, ukuran 23 cm x 17 cm x 9,5 cm dengan alas
sekam pasi dan tutup dari anyaman kawat. Kandang ditempatkan dalam ruangan berventilasi dan udara alami. Dalam 1 kandang ditempatkan 4-5 ekor tikus.
4.6.3 Bahan kimia
Bahan kimia untuk teknik pewarnaan preparat histologi otot terdiri dari : a. Larutan formalin 10% untuk menyimpan organ fiksasi
b. Etanol 96% teknis c. Parafin cair histosac d. Hematoxylin Eosin (HE) e. Xilol
f. Balsem 4.6.4 Alat penelitian
a. Timbangan gram
b. Kaca benda dan kaca penutup c. Mikroskop cahaya
d. Seperangkat alat bedah
e. Alat suntik 1 ml dan jarum sonde f. Mikrotom
4.7 Prosedur Penelitian
Sediaan injeksi GH adalah menggunakan somatotropin DNA rekombinan yang diproduksi oleh Pfizer dengan merek dagang adalah Genotropin dengan sediaan 16 IU per 1 ml.
Bubuk Genotropin lyophilized berisi somatropin [rDNA origin], yang merupakan hormon polipeptida asal DNA rekombinan. Memiliki 191 residu asam amino dan berat molekul 22.124 dalton. Urutan asam amino dari produk ini identik dengan hormon pertumbuhan manusia asal hipofisis (somatropin). Genotropin disintesis dalam strain Escherichia coli yang telah dimodifikasi dengan penambahan gen hormon pertumbuhan manusia. Genotropin adalah bubuk lyophilized steril putih ditujukan untuk injeksi subkutan.
………Genotropin 16 IU adalah dibuat dalam bentuk cartridge dua-ruang. Ruang depan somatropin mengandung 5,8 mg rekombinan (sekitar 17,4 IU), glisin 2,2 mg, manitol 1,8 mg, natrium dihidrogen fosfat anhidrat 0,32 mg, dinatrium fosfat anhidrat dan 0,31 mg, ruang belakang mengandung 0,3% m-kresol (sebagai pengawet) dan manitol 45 mg dalam 1,14 ml air untuk injeksi. Genotropin 16 IU kartrid dua bilik mg mengandung 5,8 mg somatropin. Konsentrasi pengenceran adalah 16 IU/ml. Bubuk somatotropin dan water for injection dicampur dengan menggunakan mixer (Gambar 4.3) sehingga diperoleh sediaan Genotropin 16 IU. Dari sediaan yang telah diencerkan maka harus disimpan di kulkas. Setiap hari akan diambil sesuai dengan dosis yang telah disesuaikan dengan kebutuhan masing-masing kelompok tikus menurut perhitungan pengenceran yang telah dilakukan.
Gambar 4.3 Genotropin Mixer dan vial.
4.7.2 Pengumpulan data
Tikus jantan yang memenuhi kriteria inklusi diambil secara random sebanyak 33 ekor dan diadaptasi. Lalu dibagi menjadi 3 kelompok juga secara random dan diberikan perlakuan 1x sehari pada pagi hari selama 28 hari.
Kelompok 1 = Plasebo dengan injeksi aquadest subkutan 0,1 ml.
Kelompok 2 = Perlakuan dengan injeksi GH subkutan 0,044 IU / 0,1 ml. Kelompok 3 = Perlakuan dengan injeksi GH subkutan 0,022 IU/ 0,1 ml .
4.7.3 Pembedahan
Pada awal penelitian, dari masing-masing kelompok diambil 15 ekor tikus sebagai kelompok pre test dan dilakukan pembedahan, setelah sebelumnya tikus diinhalasi dengan ether.
Pembedahan juga dilakukan setelah pemberian perlakuan selama 28 hari. masing-masing kelompok diambil 15 ekor sebagai kelompok post test . Tikus diinhalasi dengan ether, dibedah untuk mengangkat otot skeletal (femoral),
selanjutnya dibuat preparat histologis di laboratorium Histopatologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana dengan pewarnaan HE.
4.7.4 Pembuatan Sediaan
Pembuatan sediaan mikroanatomi otot dilakukan dengan metode paraffin dengan tahapan sebagai berikut ini.
4.7.4.1 Fiksasi
Otot difiksasi dalam larutan formalin buffer, dilanjutkan dengan larutan Bouin selama 3 jam.
4.7.4.2 Washing, dehidrasi dan clearing
Organ otot dicuci dengan alkohol 70% beberapa kali. Dehidrasi dilakukan dengan alkohol konsentrasi bertingkat dimulai dari alkohol 70%, 80%, 90%, 95% absolut. Untuk menjernihkan, organ direndam dalam toluol selama semalam.
4.7.4.3 Infiltrasi dan embedding
Infiltrasi parafin ke dalam jaringan dengan cara merendam organ dalam campuran toluol dan paraffin selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan embedding yaitu peneneman organ ke dalam paraffin padat.
4.7.4.4 Pengirisan dan penempelan
Blok paraffin yang berisi organ otot femoral diiris 6µm di bagian tengah menggunakan mikrotom. Kemudian ditempel pada gelas benda yang telah diolesi dengan Mayers albumin. Dibiarkan selama 24 jam agar penempelan cukup kuat.
Sediaan dipulas dengan pewarnaan Hematoxylin Eosin dengan urutan sebagai berikut :
a. Xylol I selama 5 menit b. Xylol II selama 5 menit c. Xylol III selama 5 menit
d. Alkohol 100% I selama 5 menit e. Alkohol 100% II selama 5 menit f. Aqudest beberapa celup
g. Harris-Hematoxylin selama 15 menit
h. Aquadest selama 1 menit ( dicelup naik – turun)
i. Acid alkohol 1% sebanyak 5 -7 celupan (jangan sampai pucat) j. Aquadest I selama 1 menit
k. Aquadest II selama 15 menit l. Eosin selama 2 menit
m. Alkohol 96% I selama 3 menit n. Alkohol 96% II selama 3 menit o. Alkohol 100% I selama 3 menit p. Alkohol 100% II selama 3 menit q. Xylol IV selama 5 menit
r. Xylol V selama 5 menit
4.7.5 Pengamatan
Setiap preparat diamati dari lima lapangan pandang. Pemeriksaan histologis dialakukan dengan menghitung jumlah myofibril, menentukan volume sarcomere otot dan mengamati gambaran nucleus otot dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x. Hasil perhitungan yang diperoleh adalah hasil rata-rata dari semua pengamatan.
4.8 Analisis Data
Data yang diperoleh akan dianalisis dengan langkah-langkah sebagai berikut: 4.8.1 Analisis deskriptif.
4.8.2 Analisis normalitas dengan Uji Shapiro-Wilk dan Uji homogenitas varians dengan Uji Levene’s test.
4.8.3 Analisis komparasi.
a. Data menyebar normal dan homogen, maka digunakan Uji One Way ANOVA pada taraf kemaknaan α = 0,05 untuk mengetahui efek pemberian growth hormon terhadap Lean Body Mass, dan dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil BNT) untuk mengetahui kelompok-kelompok yang berbeda.
b. Data berdistribusi normal maka tidak perlu dilakukan Uji Kruskal-Wallis (Armitage et al, 2002; Daniel, 1999; Siegel S, 1985).
Taraf kepercayaan dalam penelitian ini adalah 95% (α = 0,05). Ho ditolak jika p < 0,05.
