PENGEMBANGAN VAKSIN HEPATITIS B BERBASIS PROTEIN
REKOMBINAN SUBUNIT INDONESIA
*Neni Nurainy 1) Dicky M 1) Gilang N 1) David H. Muljono 2) Turyadi 2)
Tarwadi 3) Danang Waluyo 3) Fifit Juniarti3) Astuati 3) Vanny Narita 4) Ade Djamal 4)
Ernawati Giri R 5) Debbie R 5) Dessy N 5)
1) PT Bio Farma (Persero) Div. Penelitian dan Pengembangan, 2) Lembaga Eijkman,
3 )Badan Pengkajian dan penerapan teknologi, 4) Universitas Al Azhar Indonesia,
5) Institut Teknologi Bandung PT Bio Farma (Persero) Divisi Penelitian dan Pengembangan
Jl. Pasteur No. 28 Bandung 40161 e-Mail: nur.ainy@biofarma.co.id
ABSTRAK
Hepatitis B masih merupakan masalah epidemiologi global, termasuk Indonesia dengan tingkat HBsAg positive yang relatif tinggi. Indonesia pada tahun 2010 mengusulkan pada World Health Assembly tanggal 28 Juli sebagai hari Hepatitis sedunia dan memutuskan untuk melakukan aksi pencegahan dan eliminasi Hepatitis B. Hal ini seiring dengan program WHO, bahwa pada tahun 2012, diharapkan Western Pacific Region adalah daerah pertama yang menjadi target WHO untuk mengurangi angka infeksi kronik Hep B menjadi 2% pada anak usia 5 tahun. Vaksinasi Hepatitis B telah masuk ke dalam Program Imunisasi Nasional sejak tahun 2000 dan sukses dalam menurunkan angka prevalensi Hepatitis B di Indonesia, namun Indonesia masih tergantung pada impor bulk antigen Hepatitis B dari luar negeri. Dalam rangka membangun kemandirian bangsa dalam produksi bulk Hepatitis B, telah dibentuk Konsorsium Hepatitis B (HBV) yang merupakan program Kementrian Riset dan Teknologi dalam upaya sinergi, produktivitas, dan pendayagunaan sumberdaya penelitian dan pengembangan (litbang) nasional, serta peningkatan peran sektor produksi/swasta dalam program litbang kolaborasi. Konsorsium yang terdiri dari PT BIOFARMA, Lembaga Eijkman, Pusat Teknologi Farmasi dan Medika BPPT, ITB dan Universitas Al Azhar Indonesia. Dalam proyek satu tahun yang didanai oleh Insentif Sistem Inovasi Nasional (Isinas) Ristek ini, disiapkan rancangan konstruk vaksin Hepatitis B rekombinan dengan memanfaatkan informasi sekuens nukleotida virus Indonesia. Makalah ini memaparkan hasil-hasil yang diperoleh selama 10 bulan penelitian dan lesson learnt dari proyek Konsorsium HBV.
Kata Kunci:Virus Hepatitis B (VHB), Vaksin Hepatitis B Rekombinan, Konsorsium Hepatitis B, Isinas
I. PENDAHULUAN
Hepatitis B masih merupakan permasalahan kesehatan serius di dunia termasuk Indonesia. Salah satu resolusi yang diajukan oleh Indonesia pada sidang World Health Assembly 2010, adalah penetapan hari Hepatitis sedunia dengan aksi pencegahan dan eliminasi virus Hepatitis B salah satu upayanya melalui vaksinasi Hepatitis B [1]. Walaupun
vaksinasi Hepatitis B sudah menjadi program Imunisasi nasional dan telah berhasil menurunkan angka prevalensi Hepatitis B, bulk vaksin masih diimpor dari luar negri. Dalam rangka kemandirian bangsa dalam penyediaan
vaksin, maka dipandang perlu usaha dalam penguasaan teknologi produksi vaksin Hepatitis B yang merupakan vaksin rekombinan subunit protein antigen Hepatitis B (HBsAg).
PT Bio Farma yang merupakan perusahaan kelas dunia menyatakan bahwa produk vaksin Hepatitis B belum menggunakan vaksin yang diproduksi di Indonesia dan teknologi vaksin Hepatitis B terkini masih sangat tergantung pada negara lain. Biaya royaltydari seed vaksin dan teknologi vaksin ini relatif tinggi. Padahal Vaksin ini merupakan kebutuhan nasional sesuai dengan inisiatif pemerintah
untuk melenyapkan Hepatitis B dalam program Indonesia Sehat 2010 [2].
Beberapa universitas dan lembaga litbang di Indonesia telah melakukan penelitian di bidang pengembangan seed vaksin. Namun, sebagian besar penelitian tersebut kadang masih merupakan penelitian dasar dan belum merupakan jawaban dari kebutuhan pasar. Oleh karena itu, bottleneck yang dihadapi adalah belum dikomunikasikannya kebutuhan industri vaksin Indonesia akan indigeneous seed vaksin kepada para pelaku penelitian vaksin.
Dengan dikembangkannya vaksin Hepatitis B ini, maka kerugian beban sosial ekonomi dan kesehatan karena pengobatan dan kematian akibat penyakit Hepatitis B dapat diturunkan. Vaksin Hepatitis B juga dapat diproduksi dalam skala industri, sehingga bisa diperjualbelikan tidak hanya di negara Indonesia, namun juga pada negara-negara. Prakiraan oleh Amarasinghe et al. (2010) menunjukkan sekitar 2.4-3.5 milyar dosis vaksin dibutuhkan pada 5 tahun pertama setelah pengenalan produk dengan >75% diberikan oleh sektor publik. Debottleneckingdapat dilakukan dengan percepatan sinergi antara universitas/badan litbang bersama-sama dengan industri (PT Bio Farma) dan tentu saja Pemerintah sebagai pemilik saham dari sebagian industri dan sekaligus sebagai regulator yang akan melengkapi satu sama lain dan menghasilkan produk vaksin Indonesia.
Atas inisiasi dari Kemenristek dibentuklah Konsorsium Hepatitis B yang terdiri dari PT BIOFARMA, Lembaga Eijkman, Pusat Teknologi Farmasi dan Medika BPPT, ITB dan Universitas Al Azhar Indonesia. Melalui program Isinas 2012, diberikan pendanaan penelitian untuk Konsorsium Hepatitis B. Kegiatan konsorsium merupakan proyek multiyears dimulai dari tahun 2012 dan direncakan sampai tahun 2014. Program kerja Konsorsium meliputi desain dan konstruksi gen pengkode protein subunit rekombinan (tahun 2012); ekspresi dan purifikasi protein rekombinan subunit kandidat vaksin Hepatitis B (kegiatan tahun 2013) dan verifikasi fungsi protein rekombinan subunit kandidat vaksin Hepatitis B (tahun 2014).
Sasaran yang ingin dicapai pada proyek penelitian selama 10 bulan di tahun 2012, sekurang-kurangnya tersedia satu klon yang merupakan konstruksi gen pengkode protein rekombinan sub unit kandidat vaksin Hepatitis dalam vektor ekspresi yeast. Untuk mencapai sasaran tersebut dilakukan pembagian tugas atau Working Breakdown structure(WBS) di Konsorsium. Lembaga Eijkman bertugas dalam deteksi, isolasi dan karakterisasi molekular VHB dan konsensus gen yang diperlukan untuk vaksin Hepatitis B. Tim UAI bertugas untuk menyiapkan design contruct pada vektor ekspresi di sistem yeast dan membuat data base sekuens untuk kemudahan akses informasi sekuens VHB di Indonesia. PT Bio Farma sebagai koordinator Konsorsium bertugas untuk menyiapkan
konstruk gen HbsAg pada sistem Hansenula polymorpha, sedangkan BPPT pada sistem Saccaromyces cereviseaedan ITB pada sistem Pichia pastoris.
Tulisan ini menjelaskan progres yang dicapai oleh Konsorsium Hepatitis B terhadap dua tujuan ditahun 2012, yaitu (i). deteksi, isolasi, dan karakterisasi virus Hepatitis B isolat Indonesia sampai ke tingkat molekular; dan (ii) konstruksi vektor ekspresi gen subunit kandidat vaksin Hepatitis B di dalam sistem mikroba, seperti yeast.
II.
METODOLOGI
Deteksi, isolasi, dan karakterisasi molekuler patogen virus Hepatitis B
Virus diisolasi dan diamplifikasi dari serum pasien asal isolat Indonesia. Karakterisasi sampai tingkat molekuler dilakukan terhadap semua isolat yang mewakili setiap kelompok antigen, baik yang sudah berada dalam koleksi maupun yang baru diperoleh dari kasus baru. Hasil karakterisasi molekular akan dijadikan dasar untuk memilih galur dan sekuens gen virus yang dianggap paling sesuai maupun untuk penyusunan sekuens konsensus untuk pengembangan benih protein rekombinan vaksin. Isolasi, amplifikasi, dan karakterisasi isolat virus Hepatitis B akan dilakukan di fasilitas kultur sel Lembaga Eijkman. Sekuensing gen akan dilakukan oleh tim peneliti lembaga Eijkman, sedangkan analisa sekuens akan dilakukan bersama-sama antara tim peneliti lembaga Eijkman, PT Bio Farma dan Universitas Al Azhar Indonesia (UAI).
Identifikasi, isolasi dan persiapan konstruksi gen pengkode protein subunit rekombinan kandidat vaksin.
Berdasarkan hasil karakterisasi molekuler akan disiapkan sekuens fragmen materi genetik yang akan dibuat secara sintetik ke dalam vektor ekspresi mikroba yeast. Teknologi platform vaksin yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah protein subunit rekombinan yang diekspresikan di dalam yeast. Konstruksi ini akan dilaksanakan secara kolaboratif antara tim peneliti PT. Bio Farma, UAI, BPPT dan ITB.
Penelitian pada tahun anggaran 2012 lebih bersifat desain dan pembuatan konstruksi vektor ekspresi. Tahap ini sangat penting agar nantinya didapat seed dengan kriteria yang diharapkan oleh industri vaksin, yaitu konstruksi gen yang diinginkan dalam vektor ekspresi yang sudah ditransformasi ke dalam sel inang dengan karakteristik yang konstan dan stabil dari sisi genetik dan yield. Adapun metode kerja penelitian seperti yang dijelaskan pada Gambar 1.
Gambar.1 Metode kerja konsorsium Hepatitis B yang terdiri dari Lembaga Eijkman, Universitas Al Azhar Indonesia, Institut Teknologi Bandung (ITB), BPPT dan PT Bio Farma.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Luaran utama dari penelitian ini adalah diperoleh klon HBsAg dalam vektor ekspresi yeast, dalam penelitian ini telah dicapai tiga kandidat klon, yaitu dalam vektor ekspresi S.cereviseae, P.pastoris dan H.polymorpha. Luaran tambahan yang diperoleh adalah draft patent vektor ekspresi H. polymorpha dan tiga makalah penulisan ilmiah serta database Genbank Indonesia. Luaran tambahan ini digambarkan pada Gambar 2.
PT Bio Farma
Telah melakukan analisa dan penentuan sequence DNA Hepatitis B untuk kandidat vaksin. Design konstruk vektor ekspresi baru pada H. polymorphadan kandidat klon HBsAg dalam sistem ekspresi tersebut telah diperoleh.
Lembaga Eijkman
Dalam studi ini telah di dapat informasi sekuens sHBsAg sebanyak 47 isolat dari Indonesia wilayah Barat, Tengah dan Timur. Studi yang bertujuan untuk mendapatkan sekuens yang representatif isolat Indonesia untuk dijadikan acuan dalam pembuatan vaksin rekombinan mengusulkan VHB genotipe adw-B3 isolat Indonesia untuk
dapat dipertimbangkan sebagai acuan dalam sekuens S-HBsAg.
Gambar 2. Luaran tambahan konsorsium Hepatitis B berupa kandidat patent dan tiga makalah publikasi serta database genbank Indonesia.
UAI
Telah didapat desain konstruk gen sintetik HBsAg yang merupakan genotipe adw-B3 yang dapat diekspresikan di dalam S. cerevisiaedan P. pastoris. Khusus untuk H.
polymorpha desain telah dilakukan oleh tim Bio Farma dan ITB. Telah dikembangkan pula sebuah database meliputi genbank yang berfomat Fasta dan protein yang berformat Fasta-seq dapat diakses pada alamat bionformatic.uai.ac.id Tahap pembuatan phylogenetic tree program, telah diselesaikan komputasi fase awal yaitu PSA (Pairwise Sequence Alignment). T
Telah dilakukan karakterisasi sekuens yang dikumpulkan yang menunjukkan pemisahan clade B, C, dan D.
Telah dilakukan analisa gen sintetik dengan mempertimbangkan codon bias yang menunjukkan bahwa gen sintetik berpotensi terekspresikan dengan baik
ITB
DNA pengkode HBsAg yang telah dirancang sebelumnya dengan menggunakan optimasi kodon oleh UAI, telah berhasil disintesis dalam plasmid pJHBsAg dan diperbanyak dalam E.coliTOP10. Hasil analisis restriksi dan sekuensing menunjukkan bahwa DNA pengkode HBsAg yang paling sesuai dengan rancangan (100 % identik) adalah pJHBsAg1. DNA pengkode HBsAg tersebut selanjutnya telah disubklon dengan pAO815 menghasilkan kandidat rekombinan pAOHBs1 yang mengandung 3 copy fragmen HBsAg.
BPPT
DNA sintetik pengkode HBsAg yang telah dirancang dan dioptimasi dikonstruksi ke dalam vektor ekspresi pKS1-ST yanng merupakan vektor ekspresi Saccharomyces cereviseae
Dalam kegiatan konsorsium ini telah diperoleh data genotipe VHB di Indonesia yaitu genotipe B, C dan D. Genotipe B3 (serotipe adw) dipilih untuk design gen HBsAg dengan mempertimbangkan sebaran dan mayoritas genotipe VHB di Indonesia. Meskipun adw-B3 Indonesia dijadikan acuan dalam penyusunan design konstruk HBsAg, tidak berarti bahwa vaksin ini tidak dapat digunakan di negara di luar Indonesia karena adanya daerah determinan “a” pada design construct yang bersifat lestari pada semua serotype/genotype di dunia.
Dalam pemilihan sistem ekspresi, tahun 2012 ini dilakukan tiga pendekatan sekaligus untuk sistem H. polymorpha, P. Pastoris dan S. cereviseae. Tiga pendekatan ini dilakukan mengingat adanya kelebihan dan keterbatasan dari masing-masing sistem. Pada sistem H. polymorpha, dikatakan produksi di sistem ekspresi ini memberikan yield yang lebih tinggi dari dua sistem lainnya [3]. Akan tetapi ada keterbatasan yaitu tidak tersedianya secara komersial vektor ekspresi maupun galur H. polymorpha baik untuk kebutuhan penelitian maupun kebutuhan produksi, dengan demikian Konsorsium harus merancang sendiri vektor ekpresi dan melakukan rekayasa dalam pengadaan galur H.
polymorpha spesifik untuk produksi vaksin rekombinan dengan memperhatikan kaidah patent yang ada.
Pada sistem S. cereviseae, produksi protein rekombinan akan lebih visible karena teknologi sudah off patent, akan tetapi dari sisi yield masih rendah dibanding dua sistem lainnya, sehingga diperlukan strategi khusus untuk peningkatan yield produksi.
SistemP. pastoristelah tersedia secara komersial untuk kebutuhan penelitian, sehingga memudahkan untuk pembuatan multi kaset ekspresi yang nantinya dapat meningkatkan level ekspresi HBsAg[4]. Keterbatasan sistem
ini adalah penggunaan methanol dalam sistem fermentasinya yang merupakan bahan berbahaya dan harus ditangani dengan baik, demikian pula sampai saat ini belum ada vaksin Hepatitis B rekombinan yang telah diakui WHO menggunakan sistem ini [5]. Dengan demikian untuk
mendapat pengakuan WHO diperlukan upaya pembuktian bahwa vaksin yang dihasilkan dari sistem ini aman dan memberikan respon imun yang diharapkan.
Hasil yang diperoleh dalam kegiatan penelitian ini telah memenuhi luaran wajib dan luaran tambahan, namun dalam pelaksanaanya ditemui beberapa kendala yaitu kendala administrasi karena waktu penelitian yang terbatas, padahal birokrasi antara lembaga berbeda dan perlu penyesuaian; kendala berikutnya adalah komunikasi antar lembaga, dan komitmen dari semua pihak dalam rangka pencapaian tujuan bersama diantaranya dukungan dalam pengadaan bahan baku. Kendala lainnya adalah isu patent teknologi yang digunakan oleh para peneliti. Peneliti menguasai teknologi tersebut, akan tetapi secara komersial tidak dapat diproduksi karena dilindungi oleh paten. Oleh karena itu strategi untuk penguasaan teknologi atau akses terhadap patent diperlukan.
Dinamika pada tahun 2012 dijadikan pembelajaran bagi semua pihak termasuk Kemenristek yang secara positif telah melakukan perbaikan dari sisi administrasi terutama dalam seleksi InSinas dan penetapan dilakukan pada tahun sebelum kontrak proyek dan adanya key person yang ditempatkan Kemenristek untuk mengawal konsorsium baik dari sisi esensi meupun administrasi. Konsorsium Hepatitis B secara internal akan melakukan langkah perbaikan untuk kinerja yang lebih baik di masa yang akan datang.
IV. KESIMPULAN
Pada program InSinas 2012 ini, Konsorsium Hepatitis B telah memperoleh capaian yang diharapkan yaitu tersedianya klon HBsAg berdasarkan informasi sekuens dari isolat asli Indonesia pada vektor ekspresi yeast S. cerevisiae, H. polymorpha, dan P. pastoris, Selain juga capaian tambahan berupa satu draft patent, tiga kandidat makalah untuk journal nasional/international dan suatu databased sekuens Hepatitis B di Indonesia.
Klon HBsAg tersebut diharapkan akan dikarakterisasi dan diuji stabilitasnya pada kegiatan konsorsium selanjutnya. Akselerasi melalui akuisisi teknologi protein rekombinan pada sistem yeast akan membantu percepatan pengembangan vaksin Hepatitis B. Agar kandidat seed dapat diterima dan digunakan di industri kandidat tersebut harus terkarakterisasi dengan baik, stabilitasnya teruji dan data pembuatan seed didokumentasi dengan baik. Oleh karena itu penyediaan infrastruktur (Laboratorium penelitian) dan peralatan/instrumen yang tersertifikasi dan dapat digunakan bersama sangat diperlukan dalam kegiatan Konsorsium di masa yang akan datang.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini di biayai dari Dana Insentif Riset Nasional 2012 Kementrian Riset dan Teknologi Indonesia dan PT Bio Farma (Persero)
DAFTAR PUSTAKA
[1] World Health Organization, World Health Assembly Newsletter, May, 2010.
[2] Departemen Kesehatan RI, Paradigma Indonesia Sehat 2010, Depkes RI, 2000.
[3] Boer, E., Steinborn, G., Kunze, G., Gellisen, G., (2007) Yeast expression platforms – mini review. Appl Microbiol Biotechnol 77:513-523
[4] Vassileva, Ana; Chugh, Dipti-Arora; Swaminathan, Sathyamangalam; Khanna, Navin, 2001: Effect of Copy Number on the Expression Levels of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris. Protein Expression and Purification 21(1): 71-80
[5] Brocke, P., Schaefer, S., Melber, K., Jenzelewski, V., Müller, F., Dahlems, U., Bartelsen, O., Park, K.-N., Janowicz, Z. A. and Gellissen, G. (2005) Recombinant Hepatitis B Vaccines: Disease Characterization and Vaccine
