LAPORAN PRAKTIKUM PHARMACEUTICAL ANALYSI docx

LAPORAN PRAKTIKUM

PHARMACEUTICAL ANALYSIS

IDENTIFIKASI SENYAWA NITRAT DAN NITRIT DALAM

MAKANAN SOSIS

Disusun oleh :

Nama : Yoanes Deni 118114016

Gigih Prayoga 118114020 Elisabeth Indah 118114022 Vivo Puspitasari 118114030 Gemah Restuti 118114031

Kelompok : A2

LABORATORIUM KIMIA ANALISIS

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Seiring berkembangnya jaman, banyak berbagai macam makanan yang terdapat di dunia. Banyak produk yang ditawarkan oleh konsumen terkait dengan pemenuhan gizi, makanan cepat saji, dll. Salah satu makanan yang berkembang pesat saat ini adalah sosis. Sosis merupakan salah satu produk olahan daging dan yang sangat populer serta digemari oleh berbagai kalangan, hal ini disebabkan karena sosis memiliki rasa yang enak, harga yang relatif murah dan dapat diproduksi dalam berbagai bentuk yang menarik serta daya simpan yang baik. Karena memiiki daya simpan yang baik, sosis sering dipertanyakan apakah menggunakan bahan kimia sebagai pengawet dalam proses pembuatannya. Faktor yang mendorong untuk digunakannya bahan tambahan pangan, antara lain supaya meningkatkan kualitas daya simpan, mempermudah dalam preparasinya, mempertahankan nilai gizi. Pengawet yang paling umum digunakan pada produk-produk daging olahan yaitu senyawa nitrat dan senyawa nitrit ( Cahyadi, 2008).

Nitrat nitrit telah lama digunakan dalam produk-produk daging dan dimanfaatkan sebagai komponen senyawa curing, pengawet, antimikroba dan sebagai bahan pembentuk faktor-faktor sendiri, misalnya warna, rasa dan aroma. Kombinasi dari penggunaan senyawa nitrat dan senyawa nitrit sebagai pengawet dalam makanan dapat meningkatkan daya tahan makanan karena peningkatan efek antimikrobanya, nitrat nitrit dalam bentuk garam banyak digunakan untuk memperoleh warna merah yang seragam pada produk daging yang diawetkan. Menurut Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM), penggunaan nitrat nitrit di Indonesia diatur dalam Permenkes RI Nomor 722/Menkes/Per/IX/88 tentang bahan tambahan makanan yang mengizinkan penggunaan nitrat nitrit dalam produk olahan dengan batas maksimum nitrat 500 mg/kg per kg bahan, nitrit batas maksimum 125 mg/ kg per bahan.

amina dan amida membentuk senyawa N-nitroso yang kebanyakan bersifat karsinogenik (dapat menyebabkan kanker). Tidak seperti nitrit, nitrat tidak bereaksi dengan cara yang sama, namun nitrat yang terkandung dalam pangan dapat direduksi menjadi nitrit dengan bantuan bakteri Penitrifikasi. Melihat pemaparan di atas, maka diperlukan pengawasan dan analisis kuantitatif terhadap pengawet nitrat nitrit secara rutin. Apabila pemakaian bahan psangan dan dosisnya tidak diatur dan diawasi, kemungkinan besar akan menimbulkan kerugian bagi pemakainya, baik yang bersifat langsung,misalnya keracunan, maupun yang bersifat tidak angsung atau kumulatif, misanya karsinogenik. Di Indonesia, regulasi hukum yang mengatur mengenai penggunaan senyawa nitrat dan nitrit sebagai pengawet diatur dalam Peraturan Menteri Kesehatan RI Nomor 722/Menkes/Per/IX/1988.

Dalam beberapa literatur, penetapan kadar nitrat nitrit dapat dilakukan antara lain dengan metode Griess dan metode Xylenol (Cahyadi,2008). Metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah Metode Griess. Metode ini dipilih karena kadar nitrit dan nitrat yang digunakan dalam jumlah yang kecil (dalam satuan ppm). Metode yang digunakan untuk anlaisis kadar nitrit harus mempunyai sensitifitas yang tinggi untuk dapat menetapkan kadar secara akurat. Maka metode kolorimetri yang banyak digunakan menggunakan alat spektrofotometer visible karena intensitas warna hasil reaksi dapat ditangkap pada daerah tampak yaitu pada panjang gelombang antara 400nm – 800nm. Pemilihan metode ini dipertimbangkan juga daari ketersediaan bahan-bahan di laboratorium. Parameter validasi yang akan dilakukan dalam praktikum ini adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantifikasi.

B. Perumusan Masalah

1. Berapa kadar senyawa nitrat maupun nitrit yang terkandung dalam Sosis merk. Y? 2. Apakah kandungan senyawa nitrat maupun nitrit yang terkandung dalam Sosis

merk. Y telah memenuhi persyaratan yang berlaku? C. Hipotesis

D. Tujuan

1. Mengetahui kadar nitrat serta nitrit yang terkandung dalam Sosis merk. Y.

2. Mengetahui apakah kadar nitrat serta nitrit dalam Sosis merk Y telah memenuhi persyaratan yang berlaku.

E. Manfaat

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. SOSIS DAGING 1. Definisi Sosis

Sosis atau sausage berasal dari bahasa latin Salsus yang berarti digarami atau secara harafiah berarti daging yang disiapkan melalui penggaraman (Kramlich,1971). Sedangkan menurut SNI 01-3020-1995 (DSN,1995) sosis adalah produk makanan yang diperoleh dari campuran daging halus (mengandung daging tidak kurang dari 75%) dengan tepung atau pati dengan atau tanpa penambahan bumbu-bumbu dan bahan tambahan makanan lain yang diizinkan dan dimasukkan ke dalam selubung sosis. Syarat mutu sosis dapat dilihat pada tabel berikut ini

Tabel 1. Syarat mutu sosis berdasarkan SNI 01-3020-1995

Nutrisi Jumlah (%)

Air Maks 67,0

Protein Min 13,0

Abu Maks 3,0

Lemak Maks 25

Karbihidrat Maks 8

Sumber : Dewan Standar Nasional (1995)

Bahan utama dalam pembuatan sosis adalah jaringan hewan. Selain daging lean (tanpa lemak), daging berlemak juga ditambahkan untuk member rasa lezat. Jaringan hewan yang berada dalam hal rasio kadar protein-air, rasio lemak daging dan jumlah pigmen (Kramlich, 1971). Daging (termasuk lemak) merupakan bahan terbanyak dalam sosis, yaitu sekitar 85-90% atau bahkan boleh lebih, daging yang digunakan adalah bagian-bagian yang tingkat penerimaannya kurang (Wilson et al, 1981).

2. Proses Pembuatan

(Purnomo, 2009). Adonan sosis dimasukkan ke dalam selubung (casing) dengan menggunakan alat khusus dengan tujuan membentuk dan mempertahankan kestabilan (Karmlich, 1971) dan mengurangi terbentuknya kantong-kantong udara (Henrickson, 1978).

Pemanasan bertujuan untuk menyatukan komponen utama adonan sosis, inaktivasi mikroorganisme dan meningkatkan atau menurunkan keempukan tergantung tempertur serta jenis daging (Lawrie, 1991).

3. Clostridium botulinum

Clostridium botulinum termasuk mikroorganisme/ bakteri gram positif berbentuk

panjang, besar, dan membentuk spora serta tidak dapat tumbuh apabila terdapat oksigen. Mikroorganisme ini tetap dapat berkembang dalam makanan, dan dapat tumbuh hanya beberapa millimeter saja di bawah permukaan makanan di mana kondisi anaerobic terpenuhi, sekalipun makanan tersebut berhubungan langsung dengan udara (Volk dan Wheeler, 1993).

4. Sifat Fisika Kimia dari Setiap Bahan

Tabel 2. Sifat Fisika kimia bahan yang digunakan

Senyawa

Fisiokimia

Sulfamid Acid α-naftalamin H2O

Bau - Amoniak Tidak berbau

Bentuk Solid Crytal powder Cair

Berat molekul

97,10 g/mol 143,18 g/mol 18,02 g / mol

Warna - Tidak berwarna

pH 1,18 (250_{C) 7,1 7}

Titik didih 3010_{C 100 ° C}

(212 ° F) Titik leleh Decomposes

Kelarutan 6,5 bagian di air

HgCl2 NaCl Asam asetat AgNO3

karbon 5. Nitrit (NO2) dan Nitrat

a. Pemerian Nitrit

Nitrit dalam bentuk garamnya (natrium nitrit) merupakan salah satu bahan tambahan makanan yang diijinkan oleh pemerintah untuk menjadi bahan pengawet makanan. Simbol dari natrium nitrit adalah NaNO2. Natrium nitrit adalah senyawa nitrogen yang reaktif. Pemerian natrium nitrit yaitu:

Warna : Putih sampai kekuningan Bentuk : Solid/ serbuk solid Berat jenis : 2,17 g/ml (250_C)

Kelarutan : Mudah larut dalam air panas, larut dalam air dingin, sebagian larut dalam methanol tetapi sulit larut dalam diethyl eter

Sifat : Alkalis (pH9) Titik leleh : 2710_C

Efek toksik yang dihasilkan terhadap manusia sangat berbahaya terutama pada saluran pernapasan dan saluran pencernaan. Pada kulit akan menimbulkan iritasi/ skin contact. Efek kronis yang mungkin akan dialami manusia yang disebabkan paparan nitrit adalah teratogenik dan mutagenik pada sel somatis pada mamalia.

b. Pemerian Nitrat

Nitrat merupakan senyawa kimia yang terdiri dari satu atom nitrogen dan tiga atom oksigen, biasanya disimbolkan dengan No3. Ini adalah bentuk paling umum dari nitrogen yang ditemukan dalam air. Nitrat yang digunakan sebagai bahan pengawet biasanya dalam bentuk garam dan disimbolkan dengan NaNO3. Pemerian nitrat yaitu

Warna : Putih

Bentuk : granular dan serbuk Massa jenis : 2,26 g/ml

Kelarutan : sangat mudah larut dalam air panas (180 g/100 ml – 1000_C), larut dalam air (92,1 g /100 ml – 250_{C), sebagian larut dalam} methanol (1g/300ml methanol dan 1g/125ml alcohol), sangat sulit larut dalam aseton, dan sangat larut dalam larutan ammonia.

Titik leleh : 3080_C Titik didih : 3800_C Berat molekul : 84,99 g/mol Bau : not avaible

LD50 : 12,67 mg/kg (tikus)

Efek toksik yang dapat ditimbulkan nitrat pada manusia adalah iritasi pada kulit (kemerahan, gatal-gatal, dan nyeri), pada mata juga menimbulkan tanda yang sama dengan kulit, pada saluran pernafasan iritasi pada membrane mukosa degan gejala batuk dan sesak nafas), bahaya apabila tertelan dan masuk dalam system pencernaan, dan kemungkinan menyebabkan keracunan pada Gastroenteritis, nyeri padabagian perut, mual, muntah, diare, pusing, gangguan mental, dan lain-lain.

Nitrit dapat bersifat sebagai substansi pereduksi maupun oksidasi, dan ion nitrit bersifat sangat reaktif terhadap zat organic dan labil terhadap panas. Nitrit dapat dioksidasi menjadi nitrat, sebaliknya nitrit dapat mengoksidasi iodide menjadi iodium (Furia, 1983). Dalam suasana asam ion nitrit ada dalam kesetimbangan dengan molekul asam nitrit seusai dengan:

Gambar 1. Reaksi keseimbangan antara ion nitrit dengan molekul asam nitrit

Banyaknya asam nitrit tergantung pada pH larutan, makin rendah pHnya maka makin besar asam nitritnya karena pKa nya 3,4 maka dalam daging biasanya mempunyai pH ± 5,5 – 6,0 hanya sedikit dari nitrit yang ditambahkan ada dalam bentuk asam nitrit (Furia, 1983).

Gambar 1. Reaksi pembentukan warna merah pada daging

Food Additives and Contaminant Committee menjelaskan tentang pemakaian

nitrat pada daging curing dan keju perlu dilakukan penurunan total maksimum nitrit dan nitrat yang diizinkan. Hal ini didasarkan pada studi pada tahun 1978 menyatakan bahwa pemakaian nitrit dengan dosis tinggi menyebabkan kanker pada sistem hewan percobaan (tikus). Karena pada kondisi tertentu akan terjadi reaksi antar nitrit dan beberapa amin secara alami kepadatan dalam bahan pangan sehingga membentuk senyawa nitrosamine yang dikenal sebagai senyawa karsinogenik. Reaksi pembentukan nitrosamine dalam pengolahan atau dalam perut yang bersuasana asam:

R2NH + N2O3  R2N.NO + HNO2 (amin sekunder)

R3N + N2O3  R2N.NO + RNO2 Nitrosoamina (karsinogenik)

Gambar 2. Reaksi pembentukan nitrosamine

Salah satu kelebihan nitrosamine dibandingkan dengan karsinogenik lainnya adalah kapasitasnya untuk menimbulkan tumor pada bermacam-macam organ. Beberapa senyawa N-nitroso lain (seperti nitrosodialkilamin, nitrosourea, nitrosoguanidin, dll) dapat menyebabkan tumor hanya setelah satu dosis, bahkan ada beberapa yang dapat menembus plasenta dan menimbulkan tumor pada janin.

6. Metode Gries

Reaksi nitrit, asam sulfanilat, dan 1-naftilamin dalam metode Griess :

Asam sulfanilat asam nitrit ion diazonium

Ion diazonium 1-naftilamin senyawa azo (ungu)

Gambar 3. Reaksi pembentukan garam diazonium dan senyawa azo

(Marczenko, 2000) Senyawa azo yang terbentuk memiliki λ max = 520 nm dengan absorpsivitas spesifik 4,0.10-4 _{(Marczenko, 2000). Panjang gelombang 520 masuk dalam range} panjang gelombang 500-560 yang akan memberikan warna hijau dengan warna komplementer ungu kebiruan (Sitorus, 2009). LOD metode Griess secara teoretis untuk nitrit harus pada level koncentrasi 10-6 _{M - 10}-7 _{M (Trojanowicz, 2008). Jadi,} warna ungu yang dihasilkan senyawa azo dari reaksi diazotasi nitrit dengan pereaksi Griess dapat terukur dengan spektrofotometer-Vis dengan λ max = 520 nm.

Pengukuran nitrat dan nitrit dengan metode ini digolongkan menjadi dua klasifikasi analisis yaitu:

1. Range besar (0-4.5 mg NO3- _N/L)

2. Range kecil (0-0.4 mg NO3- _{N/L) (Zhang, 2007).}

Metode Griess memiliki sensitivitas yang tinggi dan cukup spesifik hanya dengan presisi yang baik. Namun metode ini memiliki kekurangan yaitu nitrat dengan reaksi ini terlebih dahulu membutuhkan reduksi kimia atau enzimatik untuk mengubah nitrat menjadi nitrit sebelum reaksi diazotasi.

Granul cadmium diperlukan dalam metode analisis ini untuk mereduksi nitrat menjadi nitrit. Granul cadmium yang digunakan harus dalam ukuran 0,5-2mm. Kolom cadmium berupa kolom gelas dengan lapisan-lapisan tembaga yang berdiameter 3-5mm dan panjang 10-20cm, dapat dipanaskan dan dibengkokkan menjadi bentuk U. Lapisan tembaga yang digunakan untuk melapisi granul adalah CuSO4 [Tembaga(II) Sulfat]. Kolom cadmium harus dibilas menggunakan asam, misalnya HCl atau H2SO4 untung menghilangkan senyawa yang mungkin dapat mengoksidasi dan selanjutnya dicuci dengan aquabidest. Kolom admium harus diperiksa dan dicek dengan pH meter untuk melihat pembilasan telah berjalan sempurna dan bersifat netral (Elsevier, 2001).

Mekanisme reaksi reduksi nitrat menjadi nitrit oleh cadmium dengan

etilediamin-tetraacetic acid adalah :

(Margeson, 1980) Mekanisme reaksi reduksi nitrat menjadi nitrit oleh cadmium dengan sulfanilat

adalah :

(Zhang, 2007)

8. Spektofotmeter UV-VIS

Prinsip spektroskopi didasarkan adanya interaksi dari energi radiasi elektromagnetik dengan zat kimia. Dalam analisis kimia peristiwa absorbs merupakan dasar dari cara spektroskopi karena proses absorbs bersifat unik/spesifik untuk setiap zat kimia. Disamping itu banyaknya absorbs berbanding lurus dengan banyaknya zat kimia (Sudarmaji, dkk, 1989).

rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi (Fessenden dan Fessenden, 1975).

Panjang geombang cahaya UV ataua cahaya tampak bergantung pada mudahnya promosi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi electron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang memerlukan energi lebih sedikit akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap cahaya dalam daerah tampak mempunyai elektron yang lebih mudah dipromosikan daripada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV yang lebih pendek (Fessenden dan Fessenden, 1975).

Interaksi radiasi elektromagnetik dengan bahan yaitu bila cahaya jatuh pada senyawa maka sebagian dari cahaya di serap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul. Setiap senyawa mempunyai tingkatan tenaga yang spesifik (Sudarmaji, dkk, 1989).

9. Regulasi yang berlaku di Indonesia

Pengujian toksisitas jangka pendek terhadap suatu bahan biasanya dilakukan dengan tiga macam percobaan pada hewan. Pertama, penentuan LD50 yaitu dosis suatu bahan saat 50% hewan percobaan mati, dan hal ini memberikan indikasi toksisitas relatif senyawa yang diuji. Kedua, penentuan dosis maksimum yang dapat ditolerir, yaitu dosis harian maksimum saat hewan percobaan dapat bertahan hidup untuk periode 21 hari, di mana tujuan pengujian ini adalah untuk menunjukkan bahan organ yang diperiksa memperlihatkan adanya efek keracunan. Ketiga, pengujian pemberian pakan selama 90 hari, di mana setelah 90 hari percobaan maka dapat diketahui gejala tidak normal pada hewan percobaan sehubungan dengan pakan yang diberikan. Hasil ketiga, pengujian tersebut dapat menunjukkan atau menetapkan dosis “tidak ada efek” dan dari data percobaan pada hewan dapat di tentukan ADI (Acceptable Daily Intake) (Cahyadi,2008).

Tabel 3. Beberapa Bahan Pengawet yang Diizinkan Pemakaiannya dari Nilai ADI

Bahan Pengawet Fungsi dalam Bahan Pangan (mg/kg Berat

Badan)

ADI

Natrium nitrit Antimikroba, pelindung warna

0-0,2

Sulfur dioksida Antimikroba 0-0,5

Sumber : FAO/WHO, 1974

Menurut Peraturan Menteri Kesehatan RI Nomor 722/Menkes/Per/IX/1988 tentang bahan tambahan pangan. Bahan tambahan pangan yang diproduksi, diimpor, atau diedarkan harus memenuhi persyaratan yang tercantum pada Kodeks Pangan Indonesia tentang bahan tambahan pangan atau persyaratan lain yang ditetapkan menteri kesehatan.

Tabel 4. Daftar Bahan Pengawet Anorganik yang Diizinkan Pemakaiannya dan Dosis Maksimum yang Diperkenankan Oleh Dirjen POM (Lampiran Peraturan Menteri Kesehatan RI Nomor 722/Menkes/Per/IX/1988)

No .

Nama BTP Jenis Bahan

Pangan

Batas Maksimum Penggunaan

1. Kalium nitrat Daging olahan; daging awetan

500 mg/kg, tunggal/ campuran dengan Na-nitrat dihitung sebagai Na-nitrat

Keju 50 mg/kg tunggal/ campuran dengan Na-nitrat

2. Kalium nitrit Daging olahan; daging awetan

125 mg/kg, tunggal/campuran dengan Na-nitrit

Korned kalengan 50 mg/kg, tunggal/campuran dengan Na-nitirit, dihitung sebagai Na-nitrit

3. Natrium nitrat Daging olahan ; daging awetan

500 mg/kg, tunggal/ campuran dengan K-nitrat

dengan K-nitrat 4. Natrium nitrit Daging olahan;

daging awetan

125 mg/kg, tunggal/campuran dengan K-nitrit

10. Kerangka Konsep

Daging olahan seperti sosis menggunakan pengawet nitrit serta nitrat dalam proses pengolahannya. Pada praktikum ini dilakukan pemeriksaan laboratorium untuk mengetahui kadar nitrit nitrat disesuaikan dengan Permenkes Nomor

722/Menkes/Per/IX/1988.

Gambar 4. Kerangka Konsep Praktikum

11. Validasi Metode

Parameter validasi terdiri dari kecermatan (akurasi), keseksamaan (presisi), selektivitas (spesifisitas), linearitas dan rentang, batas deteksi dan batas kuantitasi, ketangguhan metode (ruggedness) dan ketahanan (robustness), Rohman (2007).

Akurasi dari suatu metode analisis adalah kedekatan nilai hasil uji yang diperoleh dengan prosedur tersebut dari harga yang sebenarnya. Akurasi merupakan ukuran ketepatan prosedur analisis (Rohman, 2007).

Presisi dari suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian di antara masing-masing hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan berulang kali pada sejumlah cuplikan yang diambil dari satu sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai deviasi standar atau deviasi standar relatif (koefisien variasi) (Rohman, 2007).

Sosis

Pengawet Nitrit

Pengawet Nitrat

Kadar Nitrit

Kadar Nitrat

Kespeksifikan dari suatu metode analisis adalah kemampuannya untuk mengukur kadar analit secara khusus dengan akurat, di samping komponen lain yang terdapat dalam matriks sampel. Kespesifikan sering kali dinyatakan sebagai derajat bias dari hasil analisis sampel yang mengandung pencemar, hasil degradasi, senyawa sejenis yang ditambahkan atau komponen matriks, dibandingkan dengan hasil uji sampel analit tanpa zat tambahan (Rohman, 2007).

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima (Rohman, 2007).

Limit deteksi dari suatu metode analisis adalah nilai parameter uji batas, yaitu konsentrasi analit terrendah yang dapat dideteksi, tetapi tidak dikuantitasi pada kondisi percobaan yang dilakukan. Limit deteksi dinyatakan dalam konsentrasi analit (persen, bagian per milyar) dalam sampel. Limit kuntitasi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi eksperimen yang ditentukan (Rohman, 2007).

Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dan lain-lain. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji (Rohman, 2007).

Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan melakukan variasi parameter-parameter metode seperti : presentase pelarut organik, pH, kekuatan ionik, suhu, dan sebagainya (Rohman, 2007).

Ada dua macam kesalahan pada analisis kimia yaitu: 1. Kesalahan sistematik

instrumen karena penurunan tegangan listrik dan efek temperatur pada detektor sifat kimia dari reagen yang tidak memadai, kontak reaksi yang tidak sempurna, dan kesalahan individu dalam pengamatan dan pembacaan instrumentasi yang dihadapi. Untuk memperkecil kesalahan ini, dapat dilakukan kalibrasi instrumen secara berkala, pemilihan metode dan prosedur standard dari bahan resmi, pemakaian bahan kimia dari derajat untuk analisis (pro analisis / p.a), dan peningkatan pengetahuan dari peneliti yang bekerja di laboratorium analisis (Mulya dan Suharman, 1995).

2. Kesalahan tidak sistematik

BAB III METODE ANALISIS

Materi dan Metode

Metode Griess a. Sampel

Sampel yang digunakan dalam praktikum ini adalah sosis beredar di pasaran dengan yang diambil berdasarkan metode simple random sampling, yaitu metode pengambilan sampel yang setiap anggota atau unit dari populasi mempunyai kesempatan yang sama untuk diseleksi seabgai sampel. Pengambilan sampel dilakukan dengan cara acak sederhana ke populasi sosis. Dari setiap penjual dibutuhkan 1 sampel, maka total sampel adalah 2 buah sosis. Hal ini dilakukan untuk mengetahui apakah pada setiap sosis terkandung kadar nitrit dan nitrat dan apakah dalam kadar yang berbeda-beda tiap kemasan.

Cara Pengambilan Sampel

Masing-masing sampel diambil sebanyak 5-10 g dan dilakukan pemeriksaan kadar nitrit dengan metode Griess (pengukuran menggunakan spektrofotometri untuk analisis kuantitatif), sedangkan untuk pemeriksaan analisis kualitatif dilakukan dengan melihat perubahan warna yang terjadi serta spectra yang terjadi. Adapun pemilhan metode tersebut karena mempertimbangkan metode lain dari literatur dan metode yang kita pilih inilah yang memungkinkan untuk dilaksanakan di Laboratorium Farmasi Kimia Analisis Sanata Dharma.

b. Keseragaman Bobot

Keseragaman bobot dilakukan dengan menimbang sosis pada tiap kemasan plastik dan mencocokannya dengan berat bersih yang tercantum pada kemasan. c. Analisis Organoleptis

Setelah semua itu dipertimbangkan dan layak digunakan maka dilakukan tahap selanjutnya sosis dibuka dari kemasannya kemudian sosis dilepas dari plastik pelindung, haluskan dengan mortir hingga homogen. Analisis warna, bau, dan bentuk dari sampel analisis. Sampel analisis berupa sosis, sehingga harus memiliki karektiristik-karakteristik dari sosis.

d. Persiapan Alat

Alat dicuci dengan menggunakan sabun, lalu dibilas dengan air keran, kemudian dibilas dengan menggunakan air bebas nitrit dan reagen yang akan diambil.

e. Alat-alat

Peralatan yang digunakan adalah : Neraca Analitik, Spektrofotometer UV-Vis Mini 1240 Shimadzu,Mortir, stamper, Penangas air, alat destilasi, hot plate, kertas saring dan alat-alat gelas (Pyrex), antara lain : labu ukur, Erlenmeyer, pengaduk, Pipet tetets, pipet volum, gelas beker, gelas ukur, corong kaca.

f. Analisis kualitatif nitrit nitrat

Sampel ditimbang lebih kurang 5 gram, dihaluskan dalam mortir, ditambahkan air pada suhu 80o_{C selama 2 jam, didinginkan lalu disaring dengan kertas saring.} Larutan hasil penyaringan kemudian ditambah dengan reagen pereaksi Griess didiamkan selama Operating time. Dibaca serapan panjang gelombang 480-580. Apabila serapan panjang gelombang maksimum berada di daerah serapan natrium nitrit diperkirakan sampel mengandung natrium nitrit-nitrat.

g. Pembuatan Pereaksi 1). Pereaksi Griess

Menggunakan botol kaca berwarna coklat supaya mencegah terjadinya degradasi senyawa karena cahaya.

2). Larutan Baku Nitrit

Larutan stok NaNO2 1 mg/ml

Timbang seksama lebih kurang 100 mg NaNO2 kemudian dilarutkan dengan aquadest dalam labu ukur 100 ml sampai tanda.

Larutan kerja NaNO2 0,05 mg/ml

Pipet 5,0 ml larutan stok kemudian encerkan dengan aquadest dalam labu ukur 100 ml sampai tanda.

3). Pembuatan Larutan Blanko

. Ukur serapan pada spektrofotometer dan larutan blanko diharapkan tidak memberikan serapan atau sama dengan 0. Apabila larutan blanko memberikan serapan, maka serapan yang terukur untuk sampel dan kurva dikurangkan dengan serapan blanko. Dapat juga dilakukan dengan auto zero pada instrumen.

4). Pembuatan HgCl2

5). Pembuatan Larutan Amonium Klorida

Timbang seksama 175 gram NH4Cl kemudian larutkan dengan aquadest dalam labu ukur 500 ml sampai tanda batas (Larutan I). Ambil Larutan I sebanyak 12,5 ml diencerkan sampai 500 ml dengan aquadest (Larutan II).

6). Pengecekan Kertas Saring

Kertas saring yang digunakan sebagai penyaring ditetesi dengan pereaksi Griess. Adanya kandungan nitrit ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah muda sampai ungu.

7). Pengecekan Air Bebas Nitrit

Air yang digunakan sebagai pelarut disaring dengan kertas saring. Kertas saring yang telah jenuh dengan air ditetesi denganpereaksi Griess. Adanya kandungan nitrit ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah muda sampai ungu.

h. Prosedur Kerja Optimasi Metode

1. Penetapan operating time

2. Penetapan panjang gelombang

Penetapan panjang gelombang maksimum larutan natrium nitrit padaseri konsentrasi 1 µg/ml. Pembuatan natrium nitrit konsentrasi 1 µg/ml dilakukan dengan cara mengambil 5,0 ml larutan kerja NaNO2 5µg/ml masukkanke labu ukur 25 ml, kemudian tambahkan 2,5 ml reagen Griess diamkan selama OT yang diperoleh. Lalu tambahakan aquadest bebas nitrit sampai batas 10 ml. Intensitas warna diukur pada panjang gelombang antara 480 nm - 580 nm. Setelah itu tentukan panjang gelombang larutan tersebut menghasilkan absorbansi maksimum. Panjang gelombang ini kemudian digunakan sebagai λ maks. λmaks dihitung dengan tiga variasi kadar untuk menghindari kesalahan penetapan.

3. Penetapan kurva baku

Larutan seri kadar dibuat dengan cara pengambilan 1,0;2,0;3,0;4,0;5,0 dan 6,0 ml larutan kerja NaNO2 0,05 mg/ml ke dalam labu ukur 25 ml, kemudian tambahkan 2,5 ml reagen Griess diamkan selama OT diperoleh. Lalu tambahkan air bebas nitrit sampai batas volume 25 ml sehingga didapat konsentrasi seri larutan dengan kadar larutan natrium nitrit 2;4;6;8;10; dan 12 µg/ml. Intensitas warna diukur pada panjang gelombang maksimum teoretis 520 nm, hasil penetapan dan buat persamaan kurva bakunya dengan mengeplotkan ke dalam kurva dimana absorbansi sebagai sumbu Y dengan konsentrasi sebagai sumbu X.

4. Orientasi Sampel

menyaring 2 kali dengan Erlenmeyer terpisah. Corong yang telah diberi kertas saring dijenuhkan dengan air bebas nitrit terlebih dahulu. Pada Erlenmeyer pertama saring sebagian larutan dalam labu ukur 250 ml. Pindahkan corong pada Erlenmeyer kedua, saring sisa larutan dalam labu ukur 250 ml. Filtrat yang digunakan adalah filtrat dari Erlenmeyer kedua, karena dikhawatirkan adanya pengenceran dari penjenuhan kerts saring menggunakan air bebas nitrit.

Pipet 5,0 ml hasil penyaringan, masukkan ke dalam labu ukur 25 ml tambahkan 2,5 ml pereaksi Griess dan encerkan sampai tanda batas menggunakan air bebas nitrit. Diamkan sesuai OT yang didapat supaya terbentuk warna. Ukur larutan dengan spektrofotometer dan tetapkan serapannya pada panjang gelombang maksimal.

5. Orientasi Metode Penyiapan Sampel

Menambahkan 5,0 ml NaNO2 5 µg/ml ke dalam penyiapan 5gram sosis. Timbang 5 g sampel dalam gelas beker 100 ml, tambahkan ±40 ml aquadest bebas nitrit yang telah dipanaskan sampai 80˚C aduk dengan pengaduk kaca, ,masukkan ke labu ukur 250 ml. Tambahkan air panas ke dalam labu ukur hingga 200 ml, panaskan di atas penangas air selama 2 jam sambil sesekali digoyang. Tambahkan 5,0 ml larutan HgCl2 jenuh, goyangkan, pada suhu kamar, kemudian encerkan sampai tanda batas, kocok, dan saring. Penyaringan dilakukan dengan menyaring 2 kali dengan Erlenmeyer terpisah. Corong yang telah diberi kertas saring dijenuhkan dengan air bebas nitrit terlebih dahulu. Pada Erlenmeyer pertama saring sebagian larutan dalam labu ukur 250 ml. Pindahkan corong pada Erlenmeyer kedua, saring sisa larutan dalam labu ukur 250 ml. Filtrat yang digunakan adalah filtrat dari Erlenmeyer kedua, karena dikhawatirkan adanya pengenceran dari penjenuhan kerts saring menggunakan air bebas nitrit.

batas menggunakan air bebas nitrit. Bandingkan dengan spektrum absorbansi yang dihasilkan dari penambahan 5,0 ml NaNO2 5 µg/ml yang diencerkan sampai 250 ml lalu diambil 5,0 ml filtrat ke dalam labu ukur 50 ml. Tambahkan 2,5 ml reagen Griess. Diamkan selama OT. Lalu tambahkan aquadest bebas nitrit sampai bataas volume 25 ml. Ukur larutan dengan spektrofotometer dan tetapkan serapannya pada panjang gelombang maksimal.

6. Penetapan Kadar Nitrit dalam Sampel

Hancurkan sosis yang diambil secara acak dengan mortir atau blender. Timbang seksama 5 gram sosis. Buat 5 sampel masing-masing 5 gram, dan dimasukkan masing-masing dalam gelas beker 100 ml. Masing-masing sampel ditambahkan 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ml NaNO2, tambahkan ±40 ml aquadest bebas nitrit yang telah dipanaskan sampai 80˚C aduk dengan pengaduk kaca, ,masukkan ke labu ukur 250 ml. Tambahkan air panas ke dalam labu ukur hingga 200 ml, panaskan di atas penangas air selama 2 jam sambil sesekali digoyang. Tambahkan 5 ml larutan HgCl2 jenuh, goyangkan, pada suhu kamar, kemudian encerkan sampai tanda batas, kocok, dan saring. Penyaringan dilakukan dengan menyaring 2 kali dengan Erlenmeyer terpisah. Corong yang telah diberi kertas saring dijenuhkan dengan air bebas nitrit terlebih dahulu. Pada Erlenmeyer pertama saring sebagian larutan dalam labu ukur 250 ml. Pindahkan corong pada Erlenmeyer kedua, saring sisa larutan dalam labu ukur 250 ml. Filtrat yang digunakan adalah filtrat dari Erlenmeyer kedua, karena dikhawatirkan adanya pengenceran dari penjenuhan kerts saring menggunakan air bebas nitrit.

7. Penetapan Kadar Nitrat dalam Sampel

a. Proses Pembuatan dan Penggunaan Kolom Cadmium

Granul cadmium yang tersedia dicuci menggunakan 2N HCl dalam tabung Erlenmeyer dan dibilas dengan aquabidest. Cek pH dengan pH meter, pH yang diharapkan netral. Lapisi granul menggunakan tembaga dengan menambahkan 5% w_{/w CuSO4, aduk dengan kuat} sampai warna birunya menghilang. Ulangi langkah tersebut hingga larutan CuSO4 tidak lagi kehilangan warna ketika ditambahkan ke Cd. Jaga granul cadmium tidak kontak dengan udara. Sambil terus diaduk dengan pengaduk, bilas granul dengan aquabidest, dan ulangi hingga air terbebas dari partikel kecil atau warna hitam sehingga granul tampak bersinar. Kondisikan kolom dan granul cadmium terendam aquabidest, masukkan granul dalam kolom gelas, dan isi bagian ujung gelas dengan benang wool. Simpan kolom dengan ujung mulutnya terendam aquabidest. Penggunaan kolom terlebih dulu diuji dengan melewatkan Larutan II sebanyak 500 ml ditambah 10 μM nitrat untuk mengaktifkan proses reduksi.

b. Penetepan Kadar Nitrat

Siapkan 5 sampel dan ambil masing-masing 50,0 ml sampel tambahkan standar NaNO2 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ml ditambah dengan 1 ml Larutan II. Lewatkan atau alirkan larutan ke dalam kolom cadmium. Buang 15 ml larutan yang keluar pertama, dan tampung 25 ml larutan selanjutnya dengan Erlenmeyer. Larutan hasil penyaringan dari kolom ini dipipet 5,0 ml, masukkan ke dalam labu ukur 25 ml tambahkan 2,5 ml pereaksi Griess dan encerkan sampai tanda batas menggunakan air bebas nitrit. Diamkan sesuai OT yang didapat supaya terbentuk warna. Ukur larutan dengan spektrofotometer dan tetapkan serapannya pada panjang gelombang maksimal.

Analisis hasil yang digunakan dalam penelitian ini meliputi analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dilakukan untuk mengukur kadar natrium nitrit dalam sosis dan validasi metode yang digunakan dalam penelitian dengan menguji parameter akurasi , presisisi, rentang, detection limit dan quantitation limit

 Akurasi

Akurasi ini dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (

recovery) analit yang ditambahkan. Persen perolehan kembali dapat

dihitung dengan cara :

CF = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran CA = konsentrasi sampel sebenarnya

Ca_{A = konsentrasi analit yang ditambahkan}

Menurut Harmita metode memiliki akurasi yang baik bila nilai

recovery berada dalam rentang 90 -107 %

5,0 mL larutan filtrat sampel yang telah dipreparasi di pipet ke dalam 5 buah labu takar 25mL

↓

Ditambahkan larutan adisi ke dalam labu takar berturut-turut 0mL, 1,0mL; 2,0mL; 3,0mL; 4,0mL (larutan adisi adalah larutan standar NaNO2 0,05mg/mL)

↓

Dihitung konsentrasi tiap adisi yang ditambahkan ke dalam tiap sampel (C’a) ↓

Ditambahkan 2,5 ml pereaksi Griess, dibiarkan selama operating time ↓

Diencerkan hingga batas ↓

Dicari konsentrasinya berdasarkan persamaan linear yang sudah didapat dari pengukuran seri larutan baku (Cf)

↓

Dihitung % recovery dengan rumus [(Cf-Ca)/C’a] × 100%

Dengan Ca adalah konsentrasi terukur sampel yang ditambah 0 mL adisi/tanpa penambahan standar adisi.

 Presisi

Presisi dapat dinyatakan dengan koefisien variasi (KV). Koefisien variasi dapat dihitung dengan cara sebagai berikut :

Pengukuran Nitrit

Ambil 5,0 mL dari filtrat sampel ke dalam labu takar 25 mL ↓

Ditambahkan 2,5 ml pereaksi Griess, Diencerkan hingga batas ukur dibiarkan selama operating time

↓

Diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum menggunakan spektrofotometri visible (x)

↓

Diukur absorbansi sampel yang telah direplikasi 3 kali dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum (´x)

↓

Hasil pengukuran dirata-rata lalu dihitung standar deviasinya (SD) dengan rumus √(〖∑▒〖(x- ´x 〗)〗^2/((N-1)))

↓

Ditentukan presisinya dengan menghitung persen standar deviasi relatif dengan

rumus RSD= 100x SD ´

x Pengukuran Nitrit Total

Ambil 50,0 mL dari filtrat sampel + 1ml larutan II ↓

Lewatkan ke dalam kolom cadmium ↓

Buang 15 ml larutan yang pertama, tampung 25 ml selanjutnya di erlenmeyer ↓

Ambil 5,0 ml ditambah 2,5 ml pereaksi Griess, diamkan sesuai OT ↓

Ukur absorbansi dengan spektrofotometer visible dengan panjang gelombag maksimal (x)

↓

Diukur absorbansi sampel yang telah direplikasi 3 kali dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum ( ´x )

↓

Hasil pengukuran dirata-rata lalu dihitung standar deviasinya (SD) dengan rumus √(〖∑▒〖(x- ´x 〗)〗^2/((N-1)))

x = nilai dari masing-masing pengukuran,; ´x = rata-rata (mean) pengukuran, dan N=frekuensi penetapan

↓

Ditentukan presisinya dengan menghitung persen standar deviasi relatif dengan

rumus RSD= 100x SD ´

x

 Linearitas

Ukur absorbansi keenam larutan seri konsentrasi baku dengan spektrofotometer visible pada panjang gelombang maksimum

↓

Dibuat kurva kalibrasi dengan menghitung hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi menggunakan regresi linear. Apabila nilai R yang didapatkan R>

0,99 atau R2 _{≥ 0,997 menunjukkan kelinearan yang baik.}

 Spesifisitas

Spesifisitas dapat dilihat dengan cara membandingkan larutan baku dengan sampel. Metode ini memiliki spesifisitas yang baik jika memiliki bentuk spektra yang mirip antara larutan baku dan sampel

 Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi ( LOQ)

Batas Deteksi (LOD) dan Batas kuantitasi (LOQ) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut

Dimana SD merupakan simpang baku residual dan b merupakan slope dari persamaan kurva baku

Diukur absorbansi keenam seri larutan baku yang telah dipreparasi pada panjang gelombang maksimum menggunakan spektrofotometri visibel

↓

Dibuat kurva kalibrasi baku eksternal dan ditentukan persamaan kurva bakunya dengan menggunakan regresi linier.

Dihitung LOD= 3SD

S dan LOQ=

10SD S

DAFTAR PUSTAKA

Cahyadi , W., 2008. Analisis dan Aspek Kesehatan Bahan Tambahan Pangan edisi II.. Bumi Aksara. Jakarta. hal 7-36.

Ditjen Pengawasan Obat dan Pangan Departemen Kesehatan R.I. 1988. Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 722/Menkes/Per/IX/88 tentang

Bahan Tambahan Pangan. Jakarta.

Dewan Standarisasi Nasional. 1995. Sosis Daging. Jakarta.

Elsevier, 2001, Global Seagrass Research Methods, Elvisier Science B.V, Netherlands, pp. 397-399.

FAO Food And Nutrition Paper. 1980. Additives Contaminates Tehniques. Food and Agriculture Organization of The United nations, Rome.

Furia, E. Thomas. 1983. Handbook of Food Additives. 2 nd edition, Vol. 1 & Vol. 2, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA.

Henrickson, R.L. 1978. Meat, poultry and Seafoood Products. The AVI Publishing Company Inc. Westport, Connecticut.

Herlich K. 2007. Official Method of Analysis of AOAC. 18th _{Ed., Publ. By The AOAC} Inc. Arlington. Virginia. USA. 9.

http://www.erowid.org/archive/rhodium/chemistry/mercurychloride.html diakses tgl 18-9-2013 jam 21.00

Kramlich, W. E. 1971. Sausage product. In: J.F Price and B. S. Schweigert (Eds.).

The Science of Meat and Meat Product. 2 nd Edit W.H Freeman and Company,

San Fransisco.

Lawrie, R.A. 1995. Ilmu Daging. Terjemahan: A. Praktisi. Universitas Indonesia Press. Jakarta.

Merck & Co. 1989. The Merck Index. Edisi 11. Merck & Co. Inc. USA. pp. 6318.8893.

Mulya, M dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Cetakan Pertama. Airlangga University Press.Surabaya.pp 6-9.

Purnomo, H. 2009. Ilmu Pangan. Universitas Indonesia Press. Jakarta.

Sudarmaji, S. Haryono, B.Suhardi, 1989, Analisa untuk Bahan Makanan dan Pertanian, Penerbit Liberty, Yogyakarta, pp.14-19.

Trojanowics, Marek, Advances in Flow Analysisis, Wiley, Germany, pp. 578-580 Volk A. W., Wheeler. F. M., 1990. Mikrobiologi Dasar, jilid II. Editor Soenartono.

Erlangga, Jakarta, pp 183-185.

Wilson, N.R.P. 1981. Meat and Meat Product: Factor Affecting Quality Control

Applied Science Publishers. London.