Lampiran A. Isolat Virus Metode Malole et al. (2006): Ikan kerapu macan positif VNN

(1)

Lampiran A. Isolat Virus Metode Malole et al. (2006):

Diambil organ mata dan otaknya. Digerus dengan mortal.

Ditambahkan NaCl fisiologis.

Disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit dengan temperatur 5 °C.

Diambil supernatant.

Disaring dengan kertas saring miliphore 0,45 µm.

Ditambahkan antibiotik Penicilin 10.000 IU dan Streptomicin 10.000 µg tiap mililiter suspensi.

Disimpan dalam deep freezer suhu -40 ºC.

Hasil

Inokulan baku virus Virus konsentrasi 10%

(2)

Lampiran B. Uji FID50

Metode Reed & Muench (1938) dalam Amrullah (2004):

Diinfeksi virus VNN dengan konsentrasi masing-masing 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 sebanyak 0,1 ml/ekor.

Diamati gejala klinis dan dicatat Kesakitan.

Hasil

(3)

Lampiran C. Uji Hematologi Metode Benjamin (1978): 1. Penentuan Hemoglobin

Dimasukkan ke dalam 2 cuvet sebanyak 2,5 ml. Dimasukkan sampel 10 µl ke dalam cuvet pertama

Dimasukkan akuades 10 µl ke dalam cuvet ke dua sebagai blank

Dihomogenkan masing-masing campuran dan biarkan selama tiga menit di temperatur kamar

Dinolkan spektrofotometer dengan blank Dimasukkan nilai faktor hemoglobin

Dimasukkan sampel dan baca hasilnya pada panjang gelombang 540 nm.

2. Pemeriksaan Hematokrit (PCV)

Dimasukkan ke dalam tabung Hematoktrit sebanyak 2/3 atau 3/4 tabung dan tutup ujungnya dengan lilin.

Disentrifugasi pada 11.000 rpm selama 4-5 menit.

Dilakukan penghitungan nilai pada microhematocrit reader.

Working Reagent

Hasil

Darah

(4)

3. Pemeriksaan Eritrosit

Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue

Dihisap larutan Hayem sampai tanda 101 tanpa menimbulkan gelembung udara

Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan

Dibuang cairan di ujung pipet yang tidak ikut terkocok Disiapkan kamar hitung dan mikroskop

Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung, dimana tetes 1-2 dibuang terlebih dahulu

Diamati di bawah mikroskop

Dihitung jumlah sel darah merah pada kotak menengah di bagian tengah kamar hitung

Dihitung jumlah eritrosit dengan menggunakan rumus: HPA= n x 10.000

Darah

(5)

4. Pemeriksaan Leukosit

Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue

Dihisap larutan Turk sampai tanda 11 tanpa menimbulkan gelembung udara

Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan

Dibuang cairan di ujung pipet yang tidak ikut terkocok Disiapkan kamar hitung dan mikroskop

Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung

Dimana tetes 1-2 dibuang terlebih dahulu Diamati di bawah mikroskop

Dihitung jumlah sel darah putih pada kotak menengah di bagian pinggir kamar hitung

Dihitung jumlah leukosit dengan menggunakan rumus: HPA= n x 40

Darah

(6)

Lampiran D. Uji Histopatologi Menurut Suntoro (1983):

Dicuci dengan NaCl 0,95%.

Difiksasi (dimasukkan ke dalam fiksatif BNF selama 1 malam). Washing, (dengan menggunakan alkohol 70% dilakukan secara berkali-kali) direndam 1 malam.

Dehidrasi dilakukan dengan merendam otak dan mata ke dalam alkohol bertingkat yaitu 70%, 80%, 96% dan 100% masing-masing 2 kali pengulangan selama 1 jam.

Clearing dilakukan dengan merendam otak dan mata ke dalam xylol selama 1 malam.

Infiltrasi dilakukan dengan merendam otak dan mata ke dalam xylol yang telah dipanaskan terlebih dahulu di dalam oven pada temperatur 56 0C, selama 1 jam. Dilanjutkan dengan merendam otak dan mata ke dalam parafin murni I, II, III masing-masing selama 1 jam pada suhu 56 0C.

Embedding dilakukan dengan meletakkan otak dan mata pada kotak berbentuk segi empat yang telah dipersiapkan sebelumnya sebagai cetakan. Setelah itu, menuang parafin yang telah cair kedalam kotak tersebut, dan diberi label. Dibiarkan sampai dingin sehingga membentuk blok parafin dan dimasukkan ke dalam kulkas. Kemudian dilakukan penempelan blok-blok parafin pada holder yang terbuat dari kayu yang berbentuk persegi.

Otak dan mata

(7)

Cutting dilakukan dengan memotong blok-blok parafin yang telah di holder pada mikrotum sehingga membentuk pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6-10 µm.

Attaching dilakukan dengan mengambil beberapa pita parafin dengan skapel, kemudian diletakkan pada objek glass, dan, dicelupkan pada air dingin dan air hangat. Kemudian diletakkan diatas hotplate beberapa detik untuk melekatkan pita parafin pada objek glass.

Deparafinasi, dilakukan dengan cara mencelupkan objek pada xylol sampai parafin habis kira-kira selama ± 15 menit.

Dealkoholisasi, dilakukan dengan mencelupkan objek glass ke dalam alkohol absolut, alkohol 96%, alkohol 80% dan alkohol 70%.

Pewarnaan sediaan otak dan mata diwarnai dengan menggunakan Hematoxilin Eosin. Pewarnaan dilakukan dengan cara objek glass dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxilin Erlich selama 3-7 menit, dicuci dengan dengan air mengalir ± 10 menit, dimasukkan ke dalam alkohol 70%, dimasukkan ke dalam larutan pewarna Eosin 0,5% kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 70% selama 1-3 menit, preparat dimasukkkan berturut-turut ke dalam alkohol 70%, 80%, 96%, dan alkohol absolut, dikeringkan dengan kertas pengisap selanjutnya, preparat dimasukkan ke xylol.

Mounting dilakukan dengan menutup preparat dengan canada balsam. Diusahakan supaya tidak terdapat gelembung udara. Diberi label.

Diamati di bawah mikroskop.

Blok Parafin

Pita Parafin

(8)

Lampiran E. Uji RT-PCR

Menurut panduan IQ 2000 (2003): a.

Dimasukkan sampel ikan (20 mg sampel otak, atau 20 mg sampel mata) ke dalam tabung mikro 1,5 ml kemudian dilarutkan dengan 500 µl RNA Extraction Solution.

Digerus sampai hancur, diamkan pada suhu kamar selama 5 menit.

Ditambahkan 100 µl CHCl3, kemudian vortex 20 detik. Biarkan

pada suhu kamar selama 2 sampai 3 menit, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit.

Dipipet 200 µl dari fase atas (bagian jernih) ke dalam tabung mikro 0,5 ml dengan 200 µl 2-propanol (isopropanol, IPA). Divortex sebentar, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit, lalu dibuang isopropanol tersebut.

Dicuci pelet dengan 0,5 ml etanol 75%, kemudian di spin down 9.000 rpm selama 5 menit untuk mendapatkan pelet RNA, kemudian tuang etanol dan dikeringkan pelet.

Dilarutkan pelet dengan 200 µl air DEPC (dd H2O).

Sampel Ikan

(9)

Disiapkan RT-PCR dan Nested PCR campuran dibutuhkan sesuai jumlah sampel. Untuk setiap campuran reaksi, perlu mempertimbangkan 3 standar positif (103, 102 dan 101) dan 1 kontrol negatif (ddH2O atau ragi tRNA).

Dipipet 8 µl campuran reaksi reagen RT-PCR ke masing-masing 0,2 ml tabung reaksi dengan label yang tepat.

Ditambahkan 2 µl ekstrak sampel RNA atau standar ke masing-masing campuran reaksi.

Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses amplikasi tahap 1 (RT-PCR reaction).

Ditambahkan 15 µl campuran reaksi reagen Nested PCR untuk setiap tabung setelah RT-PCR reaksi selesai.

Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses amplikasi tahap 2 (Nested PCR reaction).

Setelah selesai, Nested PCR reaction ditambahkan 5 µl 6X loading dye untuk masing-masing tabung reaksi dan aduk rata. sampel siap untuk elektroforesis.

Dimasukkan Gel agarose 2% (2 gram agarose dilarutkan dengan 100 ml TAE 1x) ke dalam erlenmeyer.

Dipanaskan larutan menggunakan microwave, sampai mendidih dan berubah menjadi bening.

Didinginkan gel agarose pada temperatur kamar sampai temperatur sekitar 50 oC dan perlahan-lahan tuangkan gel ke dalam kotak gel dengan ketinggian gel agarose sekitar 0,5 - 0,3 cm, dan total ketebalan disarankan untuk tidak lebih besar dari 0,8 cm.

Dimasukkan sisir plastik (comb) ke dalam gel agarose.

Diangkat blocker pada kedua sisi kotak gel saat gel agarose di dalam benar-benar memadat.

Dilakukan proses elektroforesis. Hasil

Pelet

(10)

Ditambahkan buffer elektroforesis 1X ke dalam kotak gel sampai tuas penyangga hanya menutupi gel.

Ditambahkan 8 µl sampel ke dalam sumur satu per satu.

Dimasukkan marker ke sumur pertama sebanyak 5 µl, dan kontrol negatif ke sumur kedua, diikuti dengan sampel dan terakhir kontrol positif.

Running pada tegangan 100 - 150 Volt. Elektroforesis dihentikan bila warna biru gelap mendekati 1/2 untuk 2/3 dari gel.

Dikeluarkan gel dari kotak gel.

Dimasukkan 10 µl Ethidium Bromida (EtBr) ke dalam 100 ml akuades.

Direndam agarose hasil elektroforesis dengan larutaan EtBr ke dalam wadah plastik selama 10 menit dan sesekali digoyang. Dikelurkan agarose dan dicuci dengan akuades steril ke dalam wadah plastik selama 10 menit.

Diletakkan gel pada pertengahan transilluminator UV gelombang untuk membaca akhir hasil.

Dilakukan analisis kerja. Elektroforesis

(11)

Lampiran F. Amplikasi Protokol PCR

1. Kondisi Reaksi dalam mesin PCR (RT-PCR) a. Profil suhu Reaksi PCR tahap l:

42 oC 30 menit; 94 oC 2 menit, kemudian 94 oC 30 detik; 62 oC 30 detik; 72 oC 30 detik, ulangi 20 siklus, kemudian tambahkan 72 oC 30 detik; 20 oC 30 detik pada akhir siklus akhir.

b. Profil suhu reaksi PCR tahap 2 (Nested PCR):

94 oC 20 detik; 62 oC 20 detik; 72 oC 30 detik, ulangi 30 siklus, kemudian tambahkan 72 oC 30 detik; 20 oC 30 detik pada akhir siklus akhir.

2. Persiapan Reagent

a. RT-PCR Reaction: 8 µl/reaksi

RT-PCR Pre-Mixed Reagent 7,0 µl IQzymeTM, 2 unit/µl 0,5 µl Reverse Transcription (RT) Mix Enzim 0,5 µl b. Nested PCR Reaction: 15 µl/reaksi

Nested PCR Pre-Mixed Reagent 14 µl IQzymeTM, 2 unit/µl 1 µl

(12)

Lampiran G. Diagnosis RT-PCR

1. Sampel positif dan standar akan menunjukkan pola-pola berikut pada gel:

Lane 1: standar 1, 2000 copy / reaksi Lane 2: standar 2, 200 copy / reaksi Lane 3: standar 3, 20 copy / reaksi Lane 4: ddH2O

Lane 5: sampel dengan infeksi VNN berat Lane 6: sampel dengan infeksi VNN ringan Lane 7: sampel negatif VNN

Lane M: penanda berat molekul, 848 bp, 630 bp, 333 bp 2. Prosedur Diagnosis:

a. pita terbentuk hanya pada 289 bp saja: ringan P (+) b. pita terbentuk pada 289 dan 479 bp: sedang P (+) c. pita terbentuk pada 289, 479, dan 1160 bp: berat P (+) d. hanya satu pita terbentuk pada 665 bp: VNN negatif (-)

3. Setiap eksperimen memerlukan kontrol positif dan negatif, jika standar 102 positif tidak menimbulkan sebuah pita di 289 bp, yang berarti reaksi RT-PCR gagal. Di sisi lain, jika kontrol negatif menghasilkan sebuah pita di 289 bp, yang berarti terjadi kontaminasi.

(13)

Lampiran H. Pengamatan Harian Ikan Kerapu Macan Diinfeksi VNN a. Data Pengamatan Perlakuan Ikan Kerapu Macan Diinfeksi VNN

Keterangan:

1-7 Waktu pengamatan hari ke-

A Jumlah ikan yang mati hingga akhir percobaan

B Jumlah ikan pada awal percobaan

C Tingkat kesakitan ikan hingga akhir percobaan (%)

D Rataan tingkat kesakitan ikan pada masing-masing perlakuan (%)

b. Analisis Statistik Tests of Normalityb

Perlakuan

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Kesakitan S20 0,385 3 . 0,750 3 0,000

S25 0,385 3 . 0,750 3 0,000

S30 0,385 3 . 0,750 3 0,000

S35 0,385 3 . 0,750 3 0,000

S40 0,385 3 . 0,750 3 0,000

a. Lilliefors Significance Correction

(14)

Npar Tests

Kruskal-Wallis Test Ranks

Perlakuan N Mean Rank

Kesakitan K30 3 2,00 S20 3 10,00 S25 3 6,67 S30 3 16,33 S35 3 10,00 S40 3 12,00 Total 18

Test Statisticsa,b

Kesakitan

Chi-Square 13,522

Df 5

Asymp. Sig. 0,019 a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable: Perlakuan

Npar Tests

Mann-Whitney Test Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Kesakitan K30 3 2,00 6,00 S20 3 5,00 15,00 Total 6 Test Statisticsb Kesakitan Mann-Whitney U 0,000 Wilcoxon W 6,000 Z -2,121

Asymp. Sig. (2-tailed) 0,034 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,100a a. Not corrected for ties.

(15)

Npar Tests

b. Grouping Variable: Perlakuan Npar Tests

(16)

Npar Tests

(17)

Npar Tests

Kesakitan S20 3 4,33 13,00 S25 3 2,67 8,00 Total 6 Test Statisticsb Kesakitan Mann-Whitney U 2,000 Wilcoxon W 8,000 Z -1,291

(18)

Npar Tests

Kesakitan S20 3 3,50 10,50 S35 3 3,50 10,50 Total 6 Test Statisticsb Kesakitan Mann-Whitney U 4,500 Wilcoxon W 10,500 Z 0,000

(19)

Npar Tests

(20)

Npar Tests

(21)

Npar Tests

(22)

Lampiran I. Dokumentasi Penelitian

Tempat Penelitian Lab. BKI Kelas I Polonia

Pembuatan Ekstraksi RNA Elektroforesis

Pembuatan Isolat VNN Penyuntikan isolat VNN pada ikan