Int Aquat Res (2019) 11:85–97 https://
doi.org/10.1007/s40071-019-0221-1
PENELITIAN ASLI
Aktivitas antibakteri dan antibiofilm anemon laut (Stichodactyla haddoni)terhadap bakteri resisten antibiotik dan karakterisasi metabolit bioaktif
Homa Hamayeli. Mehdi Hassanshahian. Majid Askari Hesni
Diterima: 27 November 2018 / Diterima: 8 Maret 2019 / Diterbitkan online: 15 Maret 2019 - Penulis 2019
AbstrakAnemon laut menghasilkan banyak senyawa aktif biologis termasuk neurotoksin, racun pembentuk pori, fosfolipase, dan penghambat proteinase. Teluk Persia adalah lingkungan yang belum dijelajahi dan mungkin kaya akan hasil alam laut. Tujuan dari penelitian ini adalah skrining dan identifikasi metabolit bioaktif dariStichodactyla haddoni (Anemon laut Haddon) dikumpulkan di Teluk Persia. Ekstrak kasar anemon laut (tentakel, cakram dan seluruh tubuh) diperoleh dengan pelarut metanol. Uji antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram. Aktivitas antibiofilm (pembentukan biofilm, penghancuran biofilm dan penurunan aktivitas metabolisme) ekstrak anemon laut dievaluasi dengan metode pelat mikrotiter. Senyawa bioaktif diidentifikasi dengan analisis GC-MS. Data menunjukkan bahwa efek antibakteri terbaik (berhubungan dengan P.aeruginosa)diperoleh dari ekstrak bagian ''total tubuh''. Nilai konsentrasi hambat minimum dan konsentrasi bakterisida minimum menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri maksimum terjadi pada konsentrasi 10–20 mg/
ml. Tiga bagian anemon laut menunjukkan penghambatan yang berbeda terhadap biofilm bakteri, khususnya penghambatan biofilm yang diamati oleh tentakel, cakram, dan seluruh tubuh terhadapP.aeruginosa, K.pneumoniaDanA.baumanii,masing-masing. Biofilm dariP.aeruginosaadalah yang paling sensitif dan biofilm B.cereusadalah struktur yang paling resisten di antara semua bakteri patogen. Pengurangan terbaik dalam aktivitas metabolisme diamati padaP.aeruginosaDanK.pneumoniadi antara bakteri yang diuji. Senyawa alifatik merupakan metabolit bioaktif dominan pada anemon laut ini. Hewan laut dan khususnya anemon laut menghasilkan senyawa bioaktif berguna yang dapat digunakan untuk mencegah biofilm bakteri; penerapan bahan bioaktif, yang dilaporkan dalam penelitian ini, dapat diusulkan untuk penelitian selanjutnya.
Kata kunciAktivitas antimikroba - Biofilm -Stichodactyla haddoni -Metabolit bioaktif - Senyawa alifatik
Perkenalan
Lingkungan laut merupakan reservoir hasil alam yang luar biasa, banyak di antaranya menunjukkan ciri-ciri struktural yang tidak ditemukan pada hasil alam darat. Invertebrata laut, terutama anemon laut yang menetap, berevolusi dengan sumber metabolit bioaktif yang kaya, yang dapat digunakan untuk obat antimikroba baru (Prakash et al.2007;
Mohammadi dkk.2019).
Cnidaria merupakan hewan sederhana dengan simetri radial yang mengandung dua lapisan sel, ektoderm, dan endoderm.
Mesoglea, matriks non-seluler, terdapat di antara dua lapisan. Keberhasilan pemberian makan Cnidaria bergantung pada
H. Hamayeli - M. Hassanshahian (&) - M. Askari Hesni
Departemen Biologi, Fakultas Sains, Universitas Shahid Bahonar Kerman, Kerman, Iran email: mshahi@uk.ac.ir
adanya sel beracun khusus, nematocyst. Organisme ini memiliki organel subseluler khusus yang disebut cnidae dengan beberapa struktur dan fungsi. Cnidae dapat diklasifikasikan menjadi tiga jenis: nematocysts, spirocysts, dan ptychocysts. Nematocyst mengirimkan racun melalui kulit, sedangkan spirocyst bersifat perekat dan ptychocyst terlibat dalam perlindungan (Frazão et al.2012; Masoumipour dkk.2018).
Cnidaria adalah filum yang besar, beragam, dan penting secara ekologis. Ini mencakup sekitar 9400 spesies, dimana 68% adalah anggota kelas Anthozoa. Banyak anthozoa bereproduksi melalui cara aseksual dan seksual (Schlesinger et al.2010). Sama halnya dengan semua hewan, anthozoa perlu melindungi diri mereka dari konsekuensi invasi mikroba atau parasit yang mematikan atau melemahkan (Hutton dan Smith1996).
Mikrobioma invertebrata laut tertentu mungkin mewakili proporsi biomassa holobion yang luar biasa, tidak terkecuali cnidaria anthozoa dan menampung komunitas bakteri yang melimpah dan beragam. Spesies tertentu yang mampu
mengeluarkan lendir dapat mencapai konsentrasi mikroba hingga 1000 kali lipat lebih tinggi dibandingkan yang diamati di air laut. Meskipun komunitas mikroba yang terkait dengan karang pembentuk terumbu tropis sudah mulai terurai, komunitas mikroba yang mengkolonisasi kelompok anthozoa lainnya masih belum diketahui secara pasti (Rocha et al.2014).
Anemon laut, seperti coelenterata lainnya, menghasilkan banyak polipeptida dan protein yang aktif secara biologis, termasuk neurotoksin, racun pembentuk pori (atau sitolisin), fosfolipase, dan penghambat proteinase (Thangaraj dan Bragadeeswaran2012; Sepehri dkk.2016). Oleh karena itu, mereka telah mengembangkan
kemampuan untuk mensintesis senyawa beracun yang diperoleh dari mikroorganisme laut. Senyawa ini membantu mereka menghalangi predator, menjaga jarak dari pesaing, atau melumpuhkan mangsanya (Ghosh et al.2011). Zat menunjukkan beragam aktivitas biologis seperti hemolisis, sitotoksisitas, aktivitas kardiotropik, depolarisasi membran dan blok saluran kalium (Gunasundari et al.2013; Hamayeli dkk.2016).
Anemon laut menunjukkan kemitraan simbiosis yang sangat baik dengan ikan hias laut khususnya dengan badut.
Beberapa spesies ikan ini mempunyai ketahanan yang cukup besar terhadap anemon laut tetapi tampaknya sebagian besar dilindungi oleh lapisan lendir yang mencegah keluarnya nematosista (Mohsenipour dan Hassanshahian 2015).
Sebagai konsekuensi dari meningkatnya permintaan terhadap keanekaragaman hayati dalam program penyaringan untuk mencari obat terapeutik dari produk alami, kini terdapat minat yang lebih besar terhadap organisme laut. Ada banyak sekali penelitian yang berkaitan dengan agen antibakteri dari bakteri laut, mikroalga, rumput laut, spons, moluska dan ascidian (John et al.2015; Masyhadi dkk.2016).
Organisme ini dapat menempel pada permukaan hidup dan benda mati seperti peralatan medis yang meliputi kateter urin, vena, dan arteri, shunt, katup dan saluran jantung (Prasanna dan Doble2008).
Menurut publikasi National Institutes of Health, lebih dari 80% infeksi melibatkan biofilm (Afreenish et al.
2011; Masoumipour dkk.2018).
Adhesi mikroba pada permukaan dan akibat pembentukan biofilm telah didokumentasikan di banyak lingkungan berbeda. Biofilm merupakan mode pertumbuhan terlindungi yang memungkinkan
mikroorganisme bertahan hidup di lingkungan yang tidak bersahabat, karena fisiologi dan perilakunya sangat berbeda dari bakteri planktonik. Mereka sulit diberantas karena fenotipnya yang resisten (Simões et al.2010).
Ada beberapa keuntungan bagi mikroorganisme untuk membentuk biofilm. Mereka menyediakan ruang
permukaan tertutup yang dapat ditempati dan dapat memberikan tingkat stabilitas dalam lingkungan pertumbuhan.
Mereka mungkin memiliki fungsi katalitik melalui sel-sel lokal di dekatnya. Biofilm mikroba telah dikaitkan dengan banyak infeksi persisten yang memberikan respon buruk terhadap terapi antibiotik dan dapat menahan respon imun pejamu (Atray dan Atray2015). Resistensi mikroba merupakan respon biologis alami mikroba terhadap tekanan selektif, seperti kondisi cuaca, ketersediaan makanan, oksigen atau air, atau adanya obat antimikroba (Soares et al.
2012). Mekanisme resistensi antibiotik yang lazim, seperti pompa penghabisan, pengubahan enzim, dan mutasi target, tampaknya tidak bertanggung jawab atas perlindungan bakteri dalam biofilm (Stewart dan Costerton2001).
Oleh karena itu, untuk memperbaiki masalah resistensi memerlukan perbaikan manajemen penggunaan antibiotik dan pemulihan bakteri lingkungan yang rentan terhadap obat-obatan ini (Odonkor dan Addo2011).
Anemon laut berevolusi dengan sumber metabolit bioaktif yang kaya, yang dapat digunakan untuk obat antimikroba baru, banyak di antaranya menunjukkan fitur struktural, yang tidak ditemukan pada produk alami terestrial. Beberapa produk alami diekstraksi dari organisme laut, namun sejauh ini kurang dari 1% yang telah diteliti aktivitas farmakologinya (Subramanian et al.2011). Teluk Persia adalah lingkungan yang belum dijelajahi dan mungkin kaya akan hasil alam laut. Dalam optik ini, hanya ada sedikit laporan tentang bioaktivitas
IranStichodactyla haddoni (anemon laut Haddon). Tujuan dari penyelidikan ini adalah penyaringan dan identifikasi metabolit bioaktif dariS.haddoniyang dikumpulkan di Teluk Persia. Selain itu, aktivitas antibakteri dan antibiofilm ekstrak anemon laut ini terhadap beberapa bakteri patogen juga dievaluasi.
Bahan dan metode
Pengumpulan dan identifikasi anemon laut
Organisme anemon laut dikumpulkan pada November 2015 di Kepulauan Gheshm (N 26.994086, E 56.194300, Teluk Persia, Iran). Semua organisme dikumpulkan dari kedalaman 1–5 m. Organisme telah diangkut hidup-hidup di air laut ke laboratorium dan disimpan pada suhu 4 -C di lemari es sebelum diekstraksi. Karakterisasi contoh anemon laut diidentifikasi berdasarkan protokol Raghunathan et al. (2014). Hasil identifikasi menunjukkan bahwa organisme yang dikumpulkan adalah Stichodactyla haddoni (Anemon laut Haddon), salah satu spesies anemon laut yang termasuk dalam famili Stichodactylidae yang berasal dari kawasan Indo-Pasifik. Gambar makroskopis anemon laut ini ditunjukkan pada Gambar (1).
Ekstraksi metabolit bioaktif dari anemon laut
Dikumpulkan dari S.haddonidipisahkan menjadi dua bagian: tentakel dan cakram. Selain itu, total body (campuran seluruh tubuh hewan laut ini) juga diekstraksi. Untuk ekstraksi biomolekul, bagian terpisah (anemon laut) dikeringkan dengan cara dibekukan. Setiap bagian anemon laut direndam dalam larutan polar dengan metanol (MeOH) selama 48 jam. Kemudian ekstrak yang diperoleh disaring dan dipekatkan. Setiap ekstrak melewati kertas saring Whatman No.
1. Filtrat dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 40±1 -C selama 24 jam untuk menghilangkan sisa pelarut. Ekstrak pekat diaplikasikan untuk aktivitas antimikroba terhadap bakteri patogen (Eash-Loucks dan Fautin2012).
Bakteri
Enam bakteri patogen yang resistan terhadap antibiotik digunakan dalam penelitian ini:Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumanniiATCC 1611,Bacillus cereusATCC 1298,Klebsiella pneumoniaeATCC 700603, Escherichia coliATCC 35218,Stafilokokus aureusATCC 1189. Semua strain bakteri yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari American Type Culture Collection, AS.
Metode difusi disk
Aktivitas antibakteri ekstrak (dari tiga bagian anemon laut) diuji dengan metode difusi cakram standar. Kekeruhan kultur bakteri mencapai 0,5 standar Mac-Farland (10
8CFU mL
-1); lalu, satu
Gambar 1Gambar makroskopis anemon lautS.haddonidipelajari dalam penelitian ini
mililiter inokulum ini dipindahkan ke dalam pelat Mueller-Hinton Agar (MHA) dengan metode pelat sebar menggunakan kapas steril dan didiamkan selama 60 detik. Konsentrasi masing-masing ekstrak (0,15 mg mL-1) ditempatkan dalam cakram kertas saring steril ([, 6 mm); sampel ditempatkan di piring selama 1 jam. Setelah inkubasi, cakram ditempatkan (30 menit) pada suhu kamar dan dipindahkan ke media. Ekstrak cakram bebas pelarut digunakan sebagai kontrol negatif. Zona penghambatan (ZOI) setiap cakram (mengandung ekstrak anemon laut) dihitung dalam milimeter dan pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga (Mohsenipour dan Hassanshahian 2016, 2002; Boyanova dkk.2005).
Penentuan MIC dan MBC ekstrak anemon laut
Konsentrasi Hambat Minimal (MIC) ditentukan dengan metode pengenceran serial menggunakan pelat mikrotiter 96 sumur. Ekstrak anemon laut yang berbeda diambil (1 mg/mL) dan pengenceran serial ekstrak dibuat dengan media kaldu Mueller-Hinton. Pelat mikro diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 -C. Konsentrasi terendah tanpa pertumbuhan yang terlihat pada mikroskop binokular dicatat sebagai MIC. Konsentrasi Bakterisida Minimal (MBC) ditandai dengan penyebaran 50akuL pada pelat MHA dari sampel tidak
menunjukkan pertumbuhan yang terlihat; pelat diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37 -C (Silveira et al.2009;
Jabra-Rizk dkk. 2006; Rosenberg dan Rosenberg1981).
Penghambatan pembentukan biofilm
Pembentukan biofilm pada pelat mikrotiter polistiren diuji seperti yang dijelaskan oleh O'Toole dan Kolter dengan beberapa modifikasi (O'Toole dan Kolter1998). Tiga konsentrasi ekstrak yang berbeda (25, 12,5 dan 6,25 mg/ml) dipipet (100akul) ke dalam lubang pelat mikrotiter. Kemudian, kultur semalaman dari masing-masing spesies bakteri diencerkan 1:100 dengan TSB segar dan 100akul inokulum ini ditambahkan ke masing-masing sumur. Setelah itu, pelat mikrotiter diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 -C. Tiga sumur kontrol dipelihara untuk setiap pengujian. Ini termasuk sumur yang berisi ekstrak dan media pertumbuhan (kontrol ekstrak); sumur yang berisi media
pertumbuhan dan inokulum dan sumur yang hanya berisi media pertumbuhan (Saeidi et al.2015).
Massa biofilm yang menempel diukur menggunakan pewarnaan kristal violet. Setelah inkubasi, media disedot dan sel-sel yang tidak melekat dihilangkan dengan mencuci sumur tiga kali dengan larutan buffer fosfat steril (PBS). Untuk memperbaiki sel yang melekat, 150akul metanol 96% ditambahkan ke setiap sumur selama 15 menit. Pelat mikrotiter kemudian diwarnai dengan 200akul kristal violet 1% (Merck, Jerman) selama 20 menit, sisa noda dibilas dengan air keran mengalir. Pelat dikeringkan di udara dan CV yang terikat pada sel yang melekat dilarutkan dengan 160akul 33%
asam asetat glasial per sumur. Absorbansi masing-masing sumur dipantau dengan pembaca pelat mikrotiter (ELX-800, Biotec, India) pada 630 nm. Persen penghambatan pembentukan biofilm dihitung menggunakan rasio antara nilai OD630 nmsumur dengan dan tanpa ekstrak.
%inhibisi¼ðKontrol negatif OD - Kontrol media ODTH
- DTes OD - kontrol ekstrak OD=ðKontrol negatif OD - Kontrol media ODTH100 Gangguan pada biofilm yang sudah ada
Gangguan pada struktur biofilm yang sudah ada diukur seperti yang dijelaskan oleh Sandasi dengan beberapa modifikasi (Sandasi et al.2008). Biofilm dibentuk pada pelat mikrotiter dengan menumbuhkan 100akul dari kultur bakteri standar (OD600 nm= 0,2) selama 24 jam pada suhu 37 -C. Setelah inkubasi, media disedot dan sel planktonik dihilangkan dengan mencuci biofilm sebanyak tiga kali dengan PBS steril 1x. Setelah itu, tiga konsentrasi berbeda (25, 12,5 dan 6,25 mg mL-1-1) ekstrak ditambahkan ke setiap sumur dan pelat diinkubasi pada suhu 37 -C selama 24 jam. Sumur kendali sama dengan yang dijelaskan di atas. Persentase
pemberantasan biofilm dengan adanya konsentrasi ekstrak yang berbeda dihitung berdasarkan rumus seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Efisiensi ekstrak anemon laut terhadap aktivitas metabolisme biofilm
Biofilm yang telah terbentuk sebelumnya dicuci dua kali dengan PBS 1x. Tiga konsentrasi berbeda (25, 12,5 dan 6,25 mg mL-1) dariS.haddoniekstrak ditambahkan ke lempeng mikro; ini diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 -C. Setelah inkubasi, 50akul larutan Trifenil Tetrazolium Klorida (TTC; Merck, Jerman) ditambahkan pada sampel dalam penelitian.
Pelat mikro yang telah disiapkan diinkubasi (dalam gelap) pada suhu 37 -C selama 3 jam. Pengurangan TTC juga diukur dengan microplate reader pada 490 nm. Persentase penurunan aktivitas metabolisme biofilm dengan adanya konsentrasi ekstrak yang berbeda dihitung menggunakan rumus seperti yang dijelaskan sebelumnya (Lazarova et al.
1994; Sadeghian dkk.2012).
Analisis kromatografi gas – spektrometri massa (GC – MS).S.haddoniekstrak
ItuS.haddoniekstrak dianalisis dengan GC-MS untuk penentuan metabolit bioaktif. Analisis GC – MS dilakukan pada Varian Saturn 2000 GC – MS (Agilent Technology). Spesifikasi detektor adalah Kisaran massa dari 10 hingga 650 sma. Kolom HP-5MS dengan panjang 60 m, diameter 0,25 mm, dan 0,25-akuketebalan film m digunakan. Oven diprogram dari suhu primer 70 -C (tahan selama 2 menit) hingga suhu terminal 300 -C dengan kecepatan 10 (35,0 menit). Waktu penahanan suhu akhir adalah 10 menit. Helium dengan laju 1 ml/
menit digunakan sebagai gas pembawa dalam mode aliran konstan. Suhu masuk dan antarmuka dijaga pada 2800 -C. Sumber EI dioperasikan pada suhu 2300 -C dan suhu empat kali lipat adalah 5000 -C. MS dipindai dari 1 hingga 3000m/z.Satu mikroliter sampel disuntikkan dalam mode split dengan rasio split 40. Pencarian perpustakaan WILEY digunakan untuk identifikasi senyawa (Rani Juneius dan Selvin 2012).
Analisis statistik
Perbedaan parameter individu antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan diuji dengan uji Duncan dengan analisis varians (ANOVA) menggunakan SPSS Versi 16.0 for Windows. Perbedaan dianggap signifikan jika nilai P kurang dari 0,01, 0,05 dan 0,001. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga dan diulang tiga kali.
Hasil
Efek penghambatan tiga ekstrak anemon laut terhadap bakteri bentuk planktonik
Zona hambat (ZOI) ekstrak metabolik tiga bagian (tentakel, cakram dan seluruh tubuh) ekstrak anemon laut ditunjukkan pada Tabel1, juga nilai MIC dan MBC dari ekstrak ini diilustrasikan pada Tabel1.
Menurut tabel ini, efek antibakteri terbaik dari ekstrak anemon laut berkaitan denganP.aeruginosa. Di antara tiga bagian anemon laut, efek penghambatan optimal dimiliki seluruh tubuh. Nilai MIC dan MBC menunjukkan aktivitas antibakteri maksimal terjadi pada konsentrasi 10–20 mg/ml (Tabel1).
Sifat antibiofilm dariS.haddoniekstrak
Aktivitas antibiofilm dariS.haddoniekstrak terhadap enam bakteri patogen diuji dengan dua metode meliputi penghambatan biofilm dan penghancuran biofilm. Hasil penghambatan biofilm disajikan pada Gambar. (2ac).
Gambar ini menunjukkan bahwa tiga bagian anemon laut menunjukkan daya hambat yang berbeda terhadap biofilm bakteri. Misalnya, tiga bagian anemon laut (tentakel, cakram, dan seluruh tubuh) memiliki aktivitas anti-biofilm paling efektif melawanP.aeruginosa, K.pneumoniaeDanA.baumaniimasing-masing.
Hasil penghancuran biofilm ditunjukkan pada Gambar. (3a–c). Untuk penghancuran struktur biofilm, biofilmP.aeruginosaadalah yang paling sensitif dan biofilmB.cereusadalah struktur resisten antara semua bakteri patogen yang diuji.
Tabel 1Efek antimikroba dariS.haddoniekstrak terhadap enam bakteri planktonik S.haddoniStrain bakteri
ekstrak
Pseudomonas Acinetobakter baumanii Basil
cereus
Klebsiella pneumoniae
Escherichia
E.coli
stafilokokus
aureus aeruginosa
Difusi disk
([,mm) Sungut
Cakram
Total Sungut
Cakram
Total Sungut
Cakram
Total
12±0,3SD 11±0,5SD 14±0,2SD 20 20 20 80 80 40
11±0,3SD 9±0,3SD 12±0,4SD 20 10 20 80 40 40
8±0,6SD 10±0,2SD 11±0,5SD 40 20 20 80 40 80
10±0,5SD 11±0,3SD 12±0,2SD
8±0,2SD 10±0,5SD 10±0,3SD
14±0,6SD 0 12±0,2SD
MIC (mg mL-1) 10
20 20 40 80 80
40 20 10 80 40 40
10 40 20 40 80 80 MBC (mg mL-1)
Efisiensi dariS.haddoniekstrak pada aktivitas metabolisme biofilm
Aktivitas metabolisme bakteri dalam struktur biofilm yang diberi perlakuan dengan total cakram dan tentakel S.haddoniekstrak telah jauh menurun. Hasilnya digambarkan pada Gambar. (4). Seperti yang ditunjukkan pada gambar ini, penurunan aktivitas metabolisme terbaik terlihat padaP.aeruginosaDanK.pneumoniadi antara bakteri yang diuji. Namun,S.aureusDanA.baumaniimemiliki penurunan aktivitas metabolisme yang rendah dibandingkan dengan bakteri lain (Gbr. 2).4).
Analisis statistik
Pengaruh genus bakteri dan perbedaan konsentrasi ekstrak anemon laut terhadap pembentukan dan penghancuran biofilm dianalisis secara statistik dengan uji Duncan. Hasilnya disajikan pada Tabel2. Tabel ini menegaskan bahwa untuk penghambatan dan penghancuran biofilm,S.haddonniekstrak signifikan pada (P\0,05 dan P\0,01, masing- masing).
Komposisi kimia dariS.haddoniekstrak
Senyawa bioaktif yang ada pada ekstrak kasarS.haddoniditentukan oleh GC-MS. Hasilnya disajikan pada Tabel3. Meja3menegaskan bahwa senyawa utama dalamS.haddoniekstrak dapat diklasifikasikan menjadi tiga kelompok: alifatik, alisiklik dan aromatik. Senyawa alifatik mendominasi diantara bahan-bahan tersebut (Tabel3).
Diskusi
Sejumlah kecil mikroba laut, tumbuhan dan hewan telah menghasilkan lebih dari 16.000 senyawa baru dan ratusan senyawa baru masih ditemukan setiap tahunnya (Raghunathan et al.2014; Ghosh dkk.2011). Semua anemon laut menghasilkan racun yang dihasilkan melalui sengatan khusus pada organel, yang dikenal sebagai nematosista, yang terletak di permukaan tubuh dan dalam konsentrasi tinggi pada tentakel (Bragadeeswaran et al. 2011; Khoddami dkk.
2018).
Aktivitas antimikroba anemon laut telah dipelajari oleh beberapa peneliti di dunia; Williams dkk. (2007)
mengevaluasi aktivitas antimikroba dan bakteri terkait dari anemon laut bentikS.haddoniterhadap beberapa patogen.
Mereka menyimpulkan bahwa ekstrak jaringan heksana anemon laut menunjukkan sensitivitas optimal (24 mm) terhadap bakteri patogen ikan.Aeromonas hidrofildibandingkan patogen terpilih lainnya. Sebagai perbandingan, ekstrak jaringan menunjukkan sensitivitas antimikroba yang menjanjikan dibandingkan ekstrak bebas sel dari bakteri terkait, dan karenanya, sampel jaringan dari anemon lautS.haddonidirekomendasikan untuk eksplorasi lebih lanjut obat antimikroba baru dibandingkan bakteri terkait (Prakash et al.2007).
Gambar 2Persentase pengurangan pembentukan biofilm untuk bakteri uji yang diberi perlakuan dengan konsentrasi berbedaS.haddoniekstrak dari tentakel (A),cakram (B)dan jumlah (C)selama 24 jam
Thangaraj dkk. (2011) mengumpulkan dua spesies anemon laut dari pantai India dan mempelajari aktivitas antimikrobanya. Hasil penelitian mereka menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri dan antijamur lebih dominan pada ekstrak kasarnyaStichodactyla mertensiiDanStichodactyla raksasa.Ekstrak butanol dan aseton dariS.mertensiimenunjukkan sekitar 8 mm zona penghambatan terhadapE.coliDanProteus mirabilis dalam ekstrak metanol (Thangaraj et al.2011).
Gambar 3Persentase gangguan biofilm untuk bakteri uji yang diberi perlakuan dengan konsentrasi berbedaS.haddonimengekstrak tentakel (A), cakram (B) dan jumlah (C)selama 24 jam
Gunasundari dkk. (2013) menyaring dan mengisolasi senyawa antibiotik dari lendir anemon laut Heteractis magnifica.Mereka juga mengevaluasi aktivitas antimikroba antibiotik ini terhadap patogen ikan.
Gambar 4Efisiensi dariS.haddoniekstrak pada aktivitas metabolisme biofilm (penghambatan enzim dehidrogenase)
Meja 2Analisis statistik hasil dengan uji Duncan
S.haddoniekstrak Variabel Pembentukan biofilm
Df MS
Penghancuran biofilm
Df MS
tanda tangan. tanda tangan.
Sungut Bakteri
Konsentrasi (mg mL-1) Jumlah
Bakteri
Konsentrasi (mg mL-1) Jumlah
Bakteri
Konsentrasi (mg mL-1) Jumlah
5 2 7 5 2 7 5 2 7
0,035 0,028
–
* 7 – – 7 –
* 7
5 2
0,114 0,008
–
* *
Cakram 0,025
0,091
5 2
0,051 0,101
– –
Total 0,055
0,010
5 2
0,035 0,090
–
* *
Parameter variabel dalam analisis ini adalah jenis bakteri dan konsentrasi masing-masing ekstrak. Analisis statistik ini dilakukan dalam tiga tingkat signifikansi
MSberarti persegi,Dfderajat kebebasan,tanda tangan.penting
* P\0,05, **P\0,01, ***P\0,001, – tidak ada tingkat signifikan
Hasil penelitian mereka menegaskan bahwa senyawa dari anemon laut ini memiliki aktivitas antibakteri yang cukup dan memiliki daya hambat terbaikA. hidrofil (Gunasundari dkk.2013).
Kebaruan dari penelitian ini adalah bahwa penelitian ini merupakan laporan pertama tentang aktivitas antimikroba anemon laut di Teluk Persia; Hingga saat ini, kami belum melihat adanya artikel yang mempelajari aktivitas antimikroba pada hewan laut ini. Selain itu, aktivitas antibiofilm pada hewan laut belum dijelaskan hingga saat ini dan hal ini dianggap sebagai hal baru dalam penelitian saat ini.
Namun, beberapa penelitian juga dilakukan mengenai aktivitas antimikroba dari racun yang dihasilkan oleh anemon laut. Ghosh dkk. (2011) mempelajari aktivitas antimikroba dari toksin yang dihasilkan olehH. magnificaDan S.meritensisdan mengidentifikasi bahwa beberapa ekstrak menunjukkan penghambatan tertinggiS.aureus (69,23%) danS.Typhi (63,16%) (Ghosh dkk.2011).
Tabel 3Komposisi kimia dariStichodactyla haddoni (Anemon laut Haddon) ekstrak diperoleh dengan GC – MS
Tidak. Senyawa Rumus Membasahi.
waktu
Daerah %, dari
total
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Propana, 2,2-dimetoksi- Metil isobutil keton
3-Benzilsulfanil-3-fluoro-2-trifluorometil-akrilonitril 2- Pentanon, 4-hidroksi-4-metil-
P-xilena
Sikloheksana, 1,3,5-trimetil-2-oktadesil 1- Heptadecyne
1-Heksadekanol
Asam heksadekanoat, metil ester Asam 9,12-Oktadekadienoat (Z,Z) Metil stearidonat
Metil 16-metil-heptadekanoat Metil 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate
cis-7,10,13,16-Asam docosatetraenoic, metil ester Metil 7,10,13,16,19-docosapentaenoate
C5H12HAI2
C6H12HAI
2.995 3.598 3.900 4.722 5.477 16.327 18.352 18.545 18.998 20.334 20.577 20.919 22.253 23.845 23.941 31.056
2.048e?4 3.099e?4 2.038e?4 9.636e?4 2.071e?4 1.811e?4 1.308e?5 2.525e?5 3.180e?5 4.633e?4 3.171e?5 1.319e?5 3.277e?5 1.874e?5 2.261e?5 2.922e?6
0,063 0,095 0,062 0,295 0,063 0,055 0,400 0,772 0,972 0,142 0,969 0,403 1.002 0,573 0,691 8.933 C11H7F4NS
C6H12HAI2
C8H10
C27H54
C17H32 C16H34HAI C17H34HAI2
C18H32HAI2
C19H30HAI2
C19H38HAI2
C21H32HAI2
C23H38HAI2
C23H36HAI2
C27H46HAI 17-(1,5-Dimetilheksil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-
tetradecahydro-1H-siklopenta[
17 Kampesterol C28H48HAI 32.958 1.792e?6 5.480
John dkk. (2015) mengevaluasi efek penghambatanS.haddoniDanAnthopleura eleganissimaekstrak (dietil eter) terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif.
Dalam penelitian saat ini, kami mengevaluasi aktivitas antibakteri dan antibiofilm dari satu spesies anemon laut terhadap enam bakteri yang resisten terhadap antibiotik. Penelitian ini merupakan laporan pertama mengenai aktivitas antimikroba anemon laut (lingkungan Teluk Persia). Teluk Persia merupakan ekosistem laut penyelam terbesar di dunia, namun hanya sedikit penelitian yang dilakukan mengenai ekstraksi senyawa bioaktif dari ekosistem laut ini. Hasil kami pada aktivitas antibakteri dari tiga bagianS.haddoniekstrak terhadap bentuk planktonik dari enam bakteri menegaskan bahwa ekstrak ini memiliki penghambatan yang cukup. Namun, tingkat penghambatan terhadap bakteri yang berbeda bervariasi. Selain itu, efek yang diperoleh dengan metode agar well plate untuk uji antimikroba lebih kuat dibandingkan dengan metode difusi.
Hasil ini diharapkan karena difusi ekstrak anemon laut ke dalam sumur agar lebih baik dibandingkan kertas cakram; dengan demikian, zona hambatnya akan lebih besar dari pada cakram.
Nilai yang dicatat dalam penelitian ini untuk aktivitas antibakteri ekstrak sesuai dengan nilai yang dilaporkan oleh peneliti yang disebutkan (Bragadeeswaran et al.2011; Bhosale dkk.2002). Meskipun metode ekstraksi senyawa bioaktif dalam penelitian ini berbeda dengan peneliti lainnya, terdapat sedikit perbedaan hasil yang diamati dalam penelitian ini dibandingkan dengan penelitian yang dipublikasikan. MIC dan MBC yang dicatat dalam penelitian ini rendah, dan hasil ini menegaskan bahwa ekstraksi tersebut dapat aktif pada konsentrasi yang lebih rendah.
Aktivitas antibiofilm senyawa bioaktif dari hewan laut masih rendah diselidiki. Bragadeeswaran dkk. ( 2011) mempelajari aktivitas antifouling dari dua ekstrak anemon laut (termasuk Aurora heteroaksisDan H. magnifica)terhadap tujuh biofilm bakteri. Mereka menyimpulkan bahwa ekstrak kasar
H. magnificamenunjukkan zona hambat maksimum (18 mm) terhadapPseudomonas sp.DanE.coli.Zona hambat minimum (3 mm) diamatiP. aeruginosa, Mikrokokus sp.,DanB.cereusuntuk ekstrak metanol, aseton, dan diklorometana, masing-masing (Bragadeeswaran et al.2011). Juga, Bhosale dkk. (2002) telah melaporkan sifat antimikroba organisme laut terhadap bakteri yang diisolasi dari panel uji biofilm (Bhosale et al.2002).
Dalam penelitian ini, aktivitas antibiofilm anemon laut diselidiki. Tiga bagian dariS.haddoni dipilih untuk analisis ini yang meliputi tentakel, cakram, dan campuran cakram dan tentakel. Hasil penelitian menegaskan bahwa
penghambatan struktur biofilm enam bakteri patogen oleh ekstrak tersebut lebih tinggi dibandingkan penghancuran biofilm bakteri tersebut. Di sisi lain, ketika biofilm bakteri terbentuk, ekstrak mempunyai efek penghambatan yang lebih baik dibandingkan biofilm yang terbentuk. Hasil ini menunjukkan bahwa antimikroba
senyawa dariS.haddoniefektif terhadap perlekatan bakteri. Namun, ketika bakteri sudah berada di permukaan, efek penghambatan ini menurun drastis.
Data diperoleh dari aktivitas antibiofilm dan penghambatan aktivitas metabolisme bakteri olehS.haddoniekstrak mengkonfirmasi bahwa bakteri Gram-positif (B.cereus, S.aureus)lebih resisten dibandingkan bakteri Gram negatif (E. coli, A.
baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa).Karena bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang lebih tebal dibandingkan bakteri Gram negatif, maka agen antimikroba memiliki efek membunuh yang rendah terhadap bakteri Gram positif.
Penelitian ini merupakan laporan pertama mengenai aktivitas antibiofilm S. haddoni dan hingga saat ini belum ada publikasi di bidang tersebut.
Antimikroba terdiri dariS.haddoniditentukan oleh GC-MS. Hasilnya menegaskan bahwa senyawa utama dari S.haddoniekstrak merupakan senyawa alifatik. Senyawa tersebut dijelaskan juga oleh peneliti lain sebagai agen antimikroba, beberapa contoh dijelaskan sebagai berikut: Tamokou et al. (2011) menganalisis struktur kimiaLamium Brillantaisia.Mereka menemukan bahwa tanaman ini memiliki empat senyawa antara lain:
Aurantiamide acetate, Lupeol, Lespedin, Sitosterol 3-O-B-D-glucopyranoside dan campuran sterol:
Campesterol, Stigmasterol, danB-sitosterol. Senyawa ini menunjukkan aktivitas antibakteri dan antijamur yang bervariasi menurut mikroorganisme (MIC = 6,25–1000akug/ml) (Tamokou dkk.2011).
Dalam penelitian ini, kami mendeteksi Campesterol pada anemon laut; bahan ini dilaporkan oleh Takoma et al sebagai agen antibakteri.
Kumar dkk. (2011) mempelajari aktivitas antibakteri algaSpirulina,mereka juga menentukan komposisi kimia alga ini. Hasilnya menunjukkan bahwa senyawa antibakteri utama pada alga ini adalah 1-Octadecene dan 1-Heptadecane.
Dalam penelitian kami, kami mengidentifikasi bahan-bahan ini sebagai agen antimikroba pada anemon laut (Kumar et al.2011).
Kesimpulan
Data yang diperoleh (menurut penelitian kelompok penelitian lain) mengungkapkan bahwa organisme laut dan khususnya anemon laut merupakan sumber penting senyawa bioaktif yang dapat digunakan untuk mencegah biofilm bakteri. Hasil studi pendahuluan ini menegaskan hal ituS.haddoni'Ekstraknya memiliki efek penghambatan yang cukup terhadap bakteri patogen utama (misalnya,Pseudomonas).Kemungkinan penerapan bahan bioaktif yang berasal dari anemon laut ini dapat diusulkan untuk penelitian masa depan (ekologi mikroba dan aplikasi biomedis).
Akses terbukaArtikel ini didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Internasional Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/
licenses/by/4.0/), yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun, asalkan Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli dan sumbernya, memberikan tautan ke lisensi Creative Commons, dan menunjukkan jika ada perubahan.
Referensi
Afreenish H, Javaid U, Kaleem F, Omair M, Khalid A, Iqbal M (2011) Evaluasi berbagai metode deteksi biofilm pembentukan dalam isolat klinis. Braz J Menginfeksi Dis 15(4):305–311.https://doi.org/10.1016/S1413-8670(11)70197-0 Atray D, Atray M (2015) Korelasi antara produksi biofilm dan pola resistensi antibiotik pada uropatogenikEscherichia
E.colidi rumah sakit perawatan tersier di Rajasthan Selatan, India. Aplikasi Mikrobiol Int J Curr Sci 4(7):640–646
Bhosale SH, Nagle VL, Jagtap TG (2002) Potensi antifouling beberapa organisme laut dari India terhadap spesiesBasil DanPseudomonas.Maret Bioteknologi 4:111–118.https://doi.org/10.1007/s10126-001-0087-1
Boyanova L, Gergova G, Nikolov R, Derejian S, Lazarova E, Katsarov N (2005) Aktivitas propolis Bulgaria melawan 94 Helicobacter pyloristrain in vitro dengan difusi agar-sumur, pengenceran agar dan metode difusi cakram. J Med Mikrobiol 54(5):481–483.https://doi.org/10.1099/jmm.0.45880-0
Bragadeeswaran S, Thangaraj S, Prabhu K, Rani SRS (2011) Aktivitas antifouling oleh ekstrak anemon laut terhadap biofilm laut bakteri. Lat Am J Aquat Res 39(2):385–389.https://doi.org/10.3856/vol39-issue2-fulltext-19
Eash-Loucks WE, Fautin DG (2012) Taksonomi dan Sebaran Anemon Laut (Cnidaria:Actiniaria dan Corallimorpharia) dari perairan dalam di timur laut Pasifik. ZooTaxa 3375:1–80
Frazão B, Vasconcelos V, Antunes A (2012) Anemon Laut (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria)Racun. Obat Kelautan 10(8):1812–1851
Ghosh S, Ajithh Kumar TT, Balasubramanian T (2011) Karakterisasi dan sifat antimikroba dari anemon laut
[Heteractics luar biasaDanStichodactyla mertensii]racun. Aplikasi Lengkungan Sci Res 3(4):109–117
Gunasundari V, Ajith Kumar TT, Kumaresan S, Balagurunathan R, Balasubramanian T (2013) Isolasi antibiotik alifatik senyawa dari invertebrata laut,Heteractis magnifica ''Quoy & Gaimard 1833'' melawan patogen ikan hias laut penangkaran. J Geomar Sci India 42:807–811
Hamayeli H, Shoshtari A, Hassanshahian M, Askari M (2016) Mempelajari aktivitas antimikroba dari enam spons laut dan tiga bagian anemon laut pada Candida Albicans. J Pantai Kehidupan Med 4(8):122–129.https://doi.org/10.12980/jclm.4.2016j6-76 Hutton DMC, Smith VJ (1996) Sifat antibakteri amoebosit yang diisolasi dari anemon lautKuda Actinia.Biol Banteng
191(3):441–451
Jabra-Rizk MA, Meiller TF, James CE, Shirtliff ME (2006) Pengaruh farnesol padaStafilokokus aureuspembentukan biofilm dan kerentanan antimikroba. Agen Antimikroba Kemoterapi 50(4):1463–1469.https://doi.org/10.1128/AAC.50.4.1463-1469.
2006
John ST, Velmurugan S, Nagaraj DS, Kumaran S, Pugazhvendan SR (2015) Aktivitas antimikroba anemon lautStichyodaktila hadoniiDanAnthopleura eleganissimaekstrak melawan patogen manusia. Int J Adv Res Biol Sci 2(6):27–35 Khoddami M, Sheikh Hosseini M, Hassanshahian M (2018) Aktivitas antibakteri Semenovia suffruticosa (minyak atsiri) terhadap
bakteri patogen dan penentuan komposisi kimia minyak atsiri dengan analisis kromatografi gas-spektrometri massa di empat wilayah Kerman. J Diet Suppl 29:1–11.https://doi.org/10.1080/19390211.2018.147216
Kumar V, Bhatnagar AK, Srivastava JN (2011) Aktivitas antibakteri ekstrak kasarSpirulina platensisdan strukturalnya penjelasan senyawa bioaktif. Pabrik J Med Res 5(32):7043–7048.https://doi.org/10.5897/jmpr11.1175
Lazarova V, Pierzo V, Fontvielle D, Manem J (1994) Pendekatan terpadu untuk karakterisasi biofilm dan aktivitas biomassa kontrol. Teknologi Sains Air 29:345–354.https://doi.org/10.2166/wst.1994.0361
Mashhadi M, Fakhri J, Saeedi S, Hassanshahian M, Abkhoo A (2016) Efek antimikroba dari tanaman obat yang dikumpulkan di zabol, Iran, pada makanan patogen patogen. J Med Bakteriol 5(3):18–28
Masoumipour F, Hassanshahian M, Jafarinasab T (2018) Aktivitas antimikroba dari ekstrak gabungan trachyspermum, timus dan pistachio melawan beberapa bakteri patogen. Universitas Kedokteran J Kern 25(2):153–163
Mohammadi M, Masoumipour F, Hassanshahian M, Jafarinasab T (2019) Mempelajari aktivitas antibakteri dan antibiofilm Carum copticumterhadap bakteri resisten antibiotik dalam bentuk planktonik dan biofilm. Mikroba Pathog 129:99–105.https://doi. org/
10.1016/j.micpath.2019.02.002
Mohsenipour Z, Hassanshahian M (2015) Efek penghambatanTimus vulgarisekstrak pada bentuk planktonik dan biofilm struktur enam bakteri patogen manusia. Avicen J Fitomed 5(4):309–317
Mohsenipour Z, Hassanshahian M (2016) Aktivitas antibakteri ekstrak alkohol Euphorbia hebecarpa terhadap enam manusia
bakteri patogen dalam bentuk planktonik dan biofilm. Mikrobiol Jundishapur J.https://doi.org/10.5812/jjm.34701e34701 Odonkor ST, Addo KK (2011) Resistensi bakteri terhadap antibiotik: tren dan tantangan terkini. Int J Biol Med Res 2(4):1204–1210 O'Toole GA, Kolter R (1998) Inisiasi pembentukan biofilm diPseudomonas fluorescens WCS365 hasil melalui beberapa,
jalur pensinyalan konvergen: analisis genetik. Mol Mikrobiol 28(3):449–461.https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.1998.
00797.x
Prakash WG, Babu S, Ravikumar S, Kathiresan K, Arul Prathap S, Chinnapparaj S, Marian MP, Liakath Alikhan S (2007) Aktivitas antimikroba jaringan dan bakteri terkait dari anemon laut bentikStichodactyla haddonimelawan mikroba patogen. J Lingkungan Biol 28(4):789–793
Prasanna SS, Doble M (2008) Biofilm medis: pembentukan dan pencegahannya menggunakan molekul organik. J Inst Sci India 88(1):27–35
Raghunathan C, Raghuraman R, Choudhury S, Venkataraman K (2014) Keanekaragaman dan sebaran anemon laut di India dengan referensi khusus ke Kepulauan Andaman dan Nikobar. Rec Zool Surv India 114(2):269–294
Rani Juneius CE, Selvin J (2012)Axinella donani:spons laut, sebagai sumber senyawa terapeutik yang potensial. J Mikrobiol Bioteknologi Res 2(1):223–234
Rocha J, Francisco JRCC, Peixe L, Gomes NCM, Calado R (2014) Optimalisasi pengawetan dan pengolahan anemon laut untuk analisis komunitas mikroba menggunakan alat molekuler. Rep Sains 4:6986.https://doi.org/10.1038/srep06986 Rosenberg M, Rosenberg E (1981) Peran kepatuhan dalam pertumbuhanAcinetobacter calcoaceticusRAG-1 menjadi heksadekana. J Bakteriol
148:51–57
Sadeghian I, Hassanshahian M, Sadeghian S, Jamali S (2012) Efek antimikroba dariQuercus brantiibuah-buahan pada bakteri patogen. Mikrobiol Jundishapur J 5(3):465–469.https://doi.org/10.5812/jjm.3376
Saeidi S, Amini Boroujeni N, Ahmadi H, Hassanshahian M (2015) Aktivitas antibakteri dari beberapa ekstrak tumbuhan terhadap penyakit jangka panjang memproduksi spektrum beta-laktamaseEscherichia coliterisolasi. Mikrobiol Jundishapur J.https://doi.org/10.5812/jjm.
15434e15434
Sandasi M, Leonard CM, Viljoen AM (2008) pengaruh lima komponen minyak atsiri umum padaListeria monocytogenes biofilm. Pengendalian Makanan 19:1070–1075.https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2007.11.006
Schlesinger A, Kramarsky-Winter E, Rosenfeld H, Armoza-Zvoloni R, Loy Y (2010) Plastisitas seksual dan pembuahan diri di anemon lautAiptasia diafana.PLoS SATU 5(7):e11874.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011874
Sepehri Z, Javadian F, Khammari D, Hassanshahian M (2016) Efek antijamur dari ekstrak daun berair dan etanol Echinopora platylobaDanRosmarinus officinalis.Curr Med Mycol 2(1):16–25.https://doi.org/10.18869/acadpub.cmm.2.1. 30 Silveira CP, Torres-Rodrı́guez JM, Alvarado-Ramı́rez E, Murciano- Gonzalo F, Dolande M, Panizo M (2009) MIC dan minimum
konsentrasi fungisida amfoterisin B, itraconazole, posaconazole dan terbinafine inSporothrix schenckii.J Med Mikrobiol 58(12):1607–1610.https://doi.org/10.1099/jmm.0.007609-0
Simões M, Simões L, Vieira MJ (2010) Tinjauan strategi pengendalian biofilm saat ini dan yang akan muncul. Teknologi Sains Pangan LWT 43:573–583.https://doi.org/10.1016/j.lwt.2009.12.008
Soares GMS, Figueiredo LC, Faveri M, Cortelli SC, Duarte PM, Feres M (2012) Mekanisme kerja antibiotik sistemik
digunakan dalam perawatan periodontal dan mekanisme resistensi bakteri terhadap obat ini. J Menerapkan Ilmu Lisan 20(3):295–309.
https://doi.org/10.1590/S1678-77572012000300002
Stewart PS, Costerton JW (2001) Resistensi antibiotik bakteri dalam biofilm. Lancet 358(9276):135–138.https://doi.org/10.1016/
S0140-6736(01)05321-1
Subramanian B, Sangappellai T, Chandra Rajak R, Diraviam B (2011) Sifat farmakologi dan biomedis laut
anemonParacondactylis indicus, Paracondactylis sinensis, Heteractis magnificaDanStichodactyla haddonidari pantai timur India. Trop Pac J Asia Dis 4:722–726.https://doi.org/10.1016/S1995-7645(11)60181-8
Tamokou JDD, Kuiate JR, Tene M, Nwemeguela TJK, Tane P (2011) Aktivitas antimikroba dari ekstrak dan senyawa terisolasi dariLamium Brillantaisia.Iran J Med Sci 36(1):24–31
Thangaraj S, Bragadeeswaran S (2012) Penilaian aktivitas biomedis dan farmakologi anemon lautStichodactyla mertensiiDanStichodactyla giganteadari Cagar Biosfer Teluk Mannar, pantai tenggara India. Racun J Venom Anim Termasuk Trop Dis 18(10):53–61.https://doi.org/10.1590/S1678-91992012000100007
Thangaraj S, Bragadeeswaran S, Suganthi K, Sri Kumaran N (2011) Sifat antimikroba anemon lautStichodactyla mertensiiDanStichodactyla giganteadari pantai Mandapam di India. Biomed Pasukan Pac J Asia 1(1):43–46.https://doi.org/
10.1016/S2221-1691(11)60120-2
Williams JM, Barnhofer T, Crane C, Herman D, Raes F, Watkins E, Dalgleish T (2007) Kekhususan memori otobiografi dan gangguan emosi. Psikol Banteng 133(1):122–48
Catatan Penerbit
Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang dipublikasikan dan afiliasi kelembagaan.