Pendahuluan
Latar Belakang
Sel saraf pusat merupakan bagian yang sangat sensitif terhadap kondisi hipoksia, akibatnya sel otak kehilangan kemampuannya dalam menghasilkan energi, terutama ATP. Gerbang ion kalsium (Ca2+) pada sel prasinaps diaktifkan sehingga ion Ca+ masuk ke dalam sel dan memicu pelepasan glutamat ke ruang ekstraseluler. Aktivasi reseptor AMPA mengakibatkan masuknya ion Na+ primer ke dalam ruang intraseluler, sehingga terjadi depolarisasi membran.
NO mampu bereaksi dengan superoksida menghasilkan peroksinitrit yang sangat reaktif.7 Radikal bebas yang terbentuk akan bereaksi dengan komponen seluler seperti lipid, DNA dan protein. Banyaknya MDA yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid dan biasanya digunakan sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid untuk menilai stres oksidatif.8. Secara seluler terdapat protein globin yang berperan pada kondisi hipoksia, yaitu neuroglobin (Ngb) dan sitoglobin (Cygb).
Bukti menunjukkan bahwa Ngb berperan dalam perlindungan saraf pada kondisi hipoksia dan iskemik. Selain itu, ekspresi Ngb yang berlebihan pada tikus transgenik yang mengalami oklusi serebral dapat mengurangi ukuran infark serebral. 14 Hal ini mendukung gagasan bahwa Ngb dapat melindungi neuron dari hipoksia-iskemia. 19. Selain neuroglobin, terdapat protein globin lain yang berperan pada kondisi hipoksia, yaitu sitoglobin (Cygb). Hal ini terkait dengan kemampuan Cygb untuk mengikat oksigen dan memfasilitasi difusi oksigen ke dalam mitokondria.20,21 Cygb juga bertindak sebagai sensor oksigen, berpartisipasi dalam jalur transduksi sinyal yang memodulasi aktivitas protein pengatur sebagai respons terhadap perubahan oksigen konsentrasi. 20.
Cygb dan Ngb ditemukan di korteks, amigdala, hipotalamus (area preoptik medial, nukleus supra chiasmatic, hipotalamus lateral (LH), hipotalamus ventromedial) Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekspresi Cygb vertebrata pada mRNA dan kadar protein meningkat sebagai respons terhadap hipoksia baik pada vivo25 dan in vitro.26, 27. Oleh karena itu, ekspresi Cygb mRNA dan protein dalam otak dan sel darah pasien stroke hemoragik yang menjalani operasi kraniotomi diselidiki.
Penelitian ini juga membandingkan ekspresi Cygb mRNA dan protein pada penderita stroke hemoragik dengan kontrol yaitu non-penderita normal. Selain itu, untuk mengukur tingkat stres oksidatif akibat stroke, dilakukan pengukuran penanda stres oksidatif yaitu MDA dan aktivitas spesifik katalase. Pemeriksaan kadar MDA dengan sampel yang sama dengan penelitian ini dilakukan oleh Nurhayati yang meneliti ekspresi neuroglobin pada penderita stroke hemoragik.
Pertanyaan Penelitian
Tujuan Penelitian
- Tujuan Umum
- Tujuan Khusus
Manfaat Penelitian
Universitas Indonesia dapat menambah informasi mengenai ekspresi Cygb dan stres oksidatif serta kemungkinan perannya terhadap stroke hemoragik. Hasil penelitian ini khususnya mengenai ekspresi Cygb diharapkan dapat digunakan untuk menegakkan diagnosis (biomarker) dan prognosis pada pasien infark hemoragik, dan kedepannya dapat digunakan sebagai terapi pada kondisi hipoksia.
Tinjauan Pustaka
- Sitoglobin
- Struktur Sitoglobin
- Struktur Hem
- Pengikatan Ligan
- Filogeni Sitoglobin
- Peran Sitoglobin
- Sitoglobin dan Strok…
- Strok Hemoragik
- Reactive Oxygen Species, Stres Oksidatif, Antioksidan
- Kerangka Teori
- Kerangka Konsep
Universitas Indonesia Peran globin heksakoordinat masih belum jelas, namun biasanya dikaitkan dengan peran seluler seperti dalam eliminasi NO dan ROS, sinyal oksigen, katalisis enzimatik, serta transportasi dan penyimpanan oksigen. Secara terminologi, stroke adalah suatu sindrom neurologis fokal yang terjadi secara tiba-tiba pada jenis tertentu akibat adanya penyakit pada pembuluh darah otak. Proses ini dapat berupa tersumbatnya lumen pembuluh darah akibat trombosis atau emboli, pecahnya dinding pembuluh darah otak sehingga menimbulkan perdarahan, perubahan permeabilitas dinding pembuluh darah serta perubahan kekentalan dan kualitas darah.
Pecahnya pembuluh darah dapat disebabkan oleh kerusakan dinding arteri (arteriosklerosis) atau kelainan bawaan seperti malformasi arteriovenosa, infeksi (sifilis) dan trauma.38. Universitas Indonesia. Proses primer yang terjadi mungkin tidak menimbulkan gejala (silent) dan akan bermanifestasi secara klinis jika aliran darah ke otak (cerebral blood flow/CBF) turun hingga melebihi batas toleransi jaringan otak, yang disebut dengan fungsional. ambang aktivitas otak .aktivitas). Universitas Indonesia menjaga keutuhannya sehingga tidak terjadi kematian sel akut yang terjadi melalui proses apoptosis, yaitu penguraian unsur sel secara bertahap disertai kerusakan pada dinding sel yang disebut kematian sel terprogram.
Radikal bebas Universitas Indonesia adalah molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan pada kulit terluar orbitnya. Untuk mencapai stabilitas, radikal bebas mengambil elektron dari molekul/senyawa lain dan mengubah molekul/senyawa tersebut menjadi radikal. Peroksinitrit (OONO-), asam hipoklorit (HOCl), hidrogen peroksida (H2O2), oksigen singlet (1O2), ozon (O3), asam nitrat (HNO2), dinitrogen trioksida (N2O3) dan lipid peroksida (LOOH) bersifat non-radikal molekul atau biasa disebut oksidan, namun bersifat reaktif karena dapat menghasilkan radikal bebas pada makhluk hidup.44.
Setelah masuk ke dalam tubuh, senyawa eksogen tersebut dipecah atau dimetabolisme menjadi radikal bebas.44. Dalam proses fagositosis neutrofil, makrofag, dan monosit, radikal bebas ROS yang berasal dari oksigen dilepaskan, yang dapat menyerang dan menghancurkan mikroba patogen sebagai bagian dari mekanisme pertahanan tubuh terhadap penyakit.45,46 Peran fisiologis ROS mencakup sinyal sel sistem. ROS dalam konsentrasi yang tinggi dapat menimbulkan stres oksidatif, yaitu suatu keadaan dimana terdapat tingginya kadar radikal bebas atau rendahnya mekanisme pertahanan terhadap kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas.
Peroksidasi lipid juga dapat mempengaruhi fungsi protein yang terikat membran seperti enzim dan reseptor.44 Peroksidasi lipid terdiri dari beberapa proses yaitu inisiasi, propagasi, degradasi dan terminasi.49. Peroksidasi lipid diinduksi oleh senyawa radikal bebas yaitu radikal hidroksil (OH•) yang menghilangkan hidrogen dari asam lemak tak jenuh ganda (LH), sehingga terjadi pembentukan radikal lemak (L•) yang setelah melalui berbagai proses terbentuk malondialdehid (MDA). ), 9-hidroksi-nonenal, etana (C2H6) dan pentana (C5H12) merupakan radikal bebas yang merupakan metabolit peroksidasi lipid reaktif, sehingga dapat digunakan sebagai indeks peroksidasi lipid 50 . Tingkat oksidasi lipid dapat ditentukan dengan mengukur: 1) jumlah asam lemak tak jenuh yang hilang, 2) jumlah produk peroksidasi primer, dan 3) jumlah produk peroksidasi sekunder seperti karbonil.51 MDA merupakan salah satu lipid produk oksidasi. produk peroksidasi. Stres oksidatif yang tidak diatur dengan baik dapat menimbulkan berbagai penyakit kronis dan degeneratif, serta proses penuaan dan berbagai kondisi patologis akut seperti trauma, stroke, dan lain-lain.44.
Katalase Universitas Indonesia (CAT), glutathione peroksidase (GPx) dan glutathione reduktase (GRx).44 SOD adalah garis pertahanan pertama melawan radikal bebas, mengkatalisis radikal anion superoksida (O2) menjadi hidrogen peroksida (H2O2) melalui reaksi reduksi. Ekspresi katalase yang berlebihan pada sel dan hewan yang dikultur memberikan perlindungan terhadap efek negatif yang disebabkan oleh stres oksidatif.7 Penelitian lain mengenai aktivitas katalase telah dilakukan oleh Alexandrova dkk.
Metode Penelitian
- Disain Penelitian
- Tempat dan Waktu Penelitian
- Sampel Penelitian
- Ijin Etik
- Alur Penelitian
- Bahan dan Alat Penelitian
- Bahan Penelitian
- Alat Penelitian
- Cara Kerja
- Isolasi RNA Total Darah
- Isolasi RNA Total Jaringan Otak…
- Primer
- Amplifikasi cDNA
- Pembuatan homogenatejaringan otak…
- Pembuatan Plasma Darah
- Penentuan Kadar Protein Cygb dengan Teknik Elisa
- Pengukuran aktivitas Enzim Katalase
Kit RT-PCR Satu Langkah dengan SYBR KAPA (KAPA BIOSYSTEMS, Universal, Boston – AS) untuk sistem RT-PCR waktu nyata. Alur kerjanya dimulai dengan menambahkan 1 mL buffer lisis eritrosit ke dalam tabung mikrosentrifugasi dan menambahkan 300 µL darah utuh. Endapan kemudian diambil dan ditambahkan 100 μL buffer lisis RBC ke dalamnya sambil dipipet.
Kemudian tambahkan 500 µL etanol 70% ke dalam tabung, campur semua komponen dalam tabung dengan cara dipipet. Masukkan 500 ml campuran sampel ke dalam kolom RB dan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 g, suhu 40C, selama 1 menit. Elusi RNA dilakukan dengan menempatkan kolom RB dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml dan menambahkan 50 µL air bebas RNase ke tengah kolom matriks, biarkan selama 3 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 g, suhu 40C, selama 1 menit.
Prosedurnya diawali dengan menimbang 25 mg jaringan otak dan memasukkannya ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL, kemudian menambahkan 400 µL buffer RB dan 4 µL merkaptoetanol. Kemudian homogenat ditempatkan pada kolom filter yang ditempatkan dalam tabung pengumpul 2 mL dan disentrifugasi pada 3000 g, pada suhu 40C, selama 1 menit. Tempatkan kolom RB dalam tabung pengumpul 2 mL dan kemudian sentrifugasi pada 13.000 g, 40C, selama 2 menit.
Supernatan dibuang, kemudian ditambahkan 400 µL buffer W1 ke dalam kolom RB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 g, suhu 40C. Reagen yang digunakan untuk RT-PCR real-time terdiri dari enzim transkriptase balik, primer, templat RNA (digunakan 100 ng) dan nuklease bebas. RT-PCR waktu nyata digunakan untuk menentukan jumlah salinan cDNA yang diamplifikasi yang dapat menggambarkan ekspresi gen Cygb.
Universitas Indonesia disentrifugasi dengan kecepatan 5000 g selama 10 menit, supernatan yang dihasilkan disimpan pada suhu -20°C (jika belum digunakan). Singkatnya, prosedur pengujiannya standar dan sampel dimasukkan ke dalam lubang yang sesuai, dan antibodi terkonjugasi biotin khusus untuk Cygb ditambahkan. Sebanyak 100 μL larutan standar, blanko, dan sampel (plasma darah dan homogenat otak) ditambahkan ke masing-masing sumur dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 °C.
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan dan Saran
Kesimpulan
Saran