Atas segala kehebatannya, skripsi ini saya persembahkan sebagai ungkapan terima kasih kepada orang-orang yang sangat berarti dalam hidup saya. CDAST Universitas Jember untuk biaya penelitian melalui Program Penelitian Penguatan Divisi Biomaterial dan Bioproses Tahun 2014/2015; Rekan peneliti Ika Fitriyah, rekan-rekan CDAST atas bantuan dan kerjasamanya dalam menyelesaikan skripsi ini.
Tahap karakterisasi fisiologis dilakukan dengan pengujian suhu pertumbuhan optimal dan pH pertumbuhan optimal pada media MEB, pengujian kemampuan tumbuh pada molase yang mengandung alkohol 8% v/v, 16% v/v, 24% v/v, pengujian kemampuan memproduksi alkohol, dan mengidentifikasi pola fermentasi ragi menggunakan kit API 20C. Isolat Y mampu tumbuh pada molase dengan alkohol 8% dengan populasi ragi 2,74x107cfu/ml dan pada molase dengan alkohol 16% dengan populasi ragi 2,78x107cfu/ml dengan waktu inkubasi 48 jam dan mampu tumbuh 7%. alkohol. Isolat Z mampu tumbuh pada molase yang mengandung alkohol 24% dengan populasi ragi sebesar 1,22x108cfu/ml dengan waktu inkubasi 24 jam dan mampu menghasilkan alkohol 7% pada molase yang mengandung alkohol 8%.
Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat penyelesaian gelar Sarjana (S1) pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember. Rekan peneliti Ika Fitriyah dan rekan-rekan dari CDAST atas bantuan dan kerjasamanya dalam menyelesaikan disertasi ini. CDAST Universitas Jember untuk biaya penelitian melalui Program Penelitian Penguatan Departemen Teknik Biomaterial dan Bioproses.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pengembangan strain ragi yang toleran terhadap alkohol akan membawa nilai ekonomi yang besar bagi industri, termasuk fermentasi, filtrasi dan distilasi etanol. Oleh karena itu, fokus penelitian ini adalah mengisolasi khamir toleran alkohol yang berasal dari substrat molase dan melakukan uji identifikasi morfologi, fisiologi, dan molekuler untuk mendapatkan identitas isolat khamir toleran alkohol yang berasal dari molase, sehingga kedepannya diharapkan dapat sehingga akan meningkatkan produktivitas etanol dan hasil produksi akan dapat meningkat. Karakterisasi morfologi khamir toleran alkohol meliputi ciri makroskopis pada media MEA dan ciri mikroskopis.
Karakterisasi fisiologis khamir tahan alkohol meliputi uji suhu tumbuh optimal pada media MEB, uji pH optimal pada media MEB, uji ketahanan alkohol, uji kemampuan produksi alkohol, dan uji sampel fermentasi pada kit API 20C. Identifikasi molekuler khamir toleran alkohol dilakukan dengan ekstraksi DNA, analisis PCR dan sekuensing wilayah ITS, serta analisis filogenetik. Karakterisasi fisiologis isolat khamir toleran alkohol dari molase dilakukan dengan uji suhu tumbuh optimum, uji pH medium optimum, uji ketahanan alkohol, uji kemampuan produksi alkohol, dan uji pola fermentasi menggunakan kit API 20C.
Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini adalah pengetahuan mengenai strain ragi molase yang toleran terhadap alkohol sehingga dapat meningkatkan produktivitas fermentasi etanol dalam skala industri dengan menggunakan isolat awal yang diharapkan mampu bertahan pada konsentrasi alkohol yang tinggi.
TINJAUAN PUSTAKA
Pemanfaatan molasses sebagai substrat fermentasi bioetanol
Langkah ini berlangsung melalui jalur glikolisis dan fermentasi alkohol, yang disatukan oleh Embden, Meyerhof dan Parnas dan dikenal sebagai EMP (Rahayu & Kuswanto, 1988). Fermentasi etanol dibatasi oleh kemampuan ragi untuk mentoleransi konsentrasi etanol, karena akumulasi etanol menghambat fermentasi alkohol, sehingga membatasi tingkat etanol yang dihasilkan oleh strain ragi tertentu. Penyebab lainnya juga berkaitan dengan faktor lingkungan, seperti konsentrasi gula yang tinggi dan suhu yang tinggi sehingga menghambat fermentasi etanol (Wayman & Parekh, 1990).
Produk etanol yang terakumulasi dalam fermentor akan mempengaruhi pertumbuhan ragi, etanol akan merusak membran plasma, terjadi denaturasi protein, dan terjadi perubahan profil suhu pertumbuhan yang dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroba, sehingga menurunkan produktivitas. Membran menjadi tidak stabil dan akibatnya dapat mengurangi permeabilitas membran sehingga mengganggu homeostatis sel (Lloyd et al., 1993). Suhu yang baik untuk fermentasi maksimal adalah 30o C. Sebelum menggunakan molase sebagai media fermentasi etanol harus diencerkan terlebih dahulu hingga 14% brix (Jayus et al., 2014).
Morfologi Khamir
- ITS Region
Askospora terdapat dalam berbagai bentuk, yaitu bulat, berbentuk gada, berbentuk topi, berbentuk helm, dan berbentuk jarum. Kelas Archiascomycetes terdiri dari ordo Pneumocystidales, Neolectales, Schizosaccharomycetales, Protomycetales, Taphrinales dan ragi anamorphic anggota genus Saitoella. Kelas ragi Hemiascomycetes terdiri dari ordo Saccharomycetales yang memiliki 11 famili antara lain Candidaceae, Metschnikowiaceae dan Saccharomycetaceae (Kurtzman & Fell, 1998).
Menurut Choudhary dan Johri (2009), filum ragi Basidiomycota mempunyai tiga kelas yang terdiri dari Hymenomycetes, Urediniomycetes dan Ustilaginomycetes (Fellet al., 2001). Kelas Hymenomycetes terdiri dari empat ordo yaitu Tremellales, Trichosporonales, Filobasdiales dan Cystofilobasidiales. Khamir kelas Ustilaginomycetes terdiri dari tiga ordo yaitu ordo Exobasidiomycetidae, ordo Ustilaginomycetidae, dan ordo Malsseziales. Ragi kelas Urediniomycetes terdiri dari empat ordo yaitu Agaricostilbum, Microbotryum, Sporidiobolous dan Erythrobasidium (Fell et al., 2000).
Teliospora merupakan spora seksual dari kelompok khamir Basidiomycetes yang mempunyai dinding tebal tempat terjadinya karyogami yang menghasilkan basidiospora (Alexopoulus et al., 1996) pada kelompok khamir Uredinales dan Ustiliginales (Gandjar et al., 2006). Sel ragi telah mengembangkan mekanisme untuk mengatasi berbagai jenis kerusakan yang disebabkan oleh peningkatan konsentrasi etanol, termasuk: ketidakstabilan membran plasma dan kerusakan sebagai respons terhadap peningkatan ergosterol (Daum et al., 1998) serta produksi asam amino (Hu et. al., 2005) dan inositol (Kelley et al., 1988) yang meningkatkan stabilitas membran; Kit API 20C merupakan alat identifikasi ujung yang terdiri dari strip plastik dengan 20 miniatur tabung atau sumur (Carson, 2001).
API 20C berisi 20 sumur berisi reagen kering yang terdiri dari: 1 sumur pertama berisi kontrol negatif, 1 sumur berisi glukosa sebagai kontrol positif dan sisanya 18 sumur berisi substrat gula untuk 18 pengujian biokimia. DNA yang dihasilkan akan dipisahkan berdasarkan ukurannya melalui kapiler, kemudian detektor laser akan membaca label fluoresen dari setiap fragmen (Moat et al., 2002). Wilayah non-coding terdiri dari Internal Transcribed Spacer (ITS1 dan ITS2) dan Intergenic Spacer (IGS) (James dan Stratford, 2003).
Namun menurut Fell dkk. 2000) analisis area LSU D1/D2 tidak dapat digunakan untuk membedakan jenis khamir. Wilayah ITS mempunyai variasi sequence yang lebih tinggi dibandingkan wilayah LSU D1/D2 karena ITS merupakan wilayah non-coding yang memiliki tingkat mutasi lebih tinggi dibandingkan wilayah pengkodean (SSU dan LSU) (James et al., 1996) sehingga variasi urutan nukleotida antar spesies sangat tinggi (Ciardo et al., 2006).
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Tahapan Penelitian
- Karakterisasi Fisiologi Khamir KTA
Isolasi ragi AKT dengan 0,1 ml molase dilarutkan dalam media MEA yang telah dipadatkan kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 48 jam. Pengamatan mikroskopis dilakukan dengan pewarnaan sel ragi yang difiksasi pada kaca objek menggunakan pewarna kristal violet. Pengamatan bentuk sel dan pertunasan sel khamir dilakukan pada isolat khamir umur kultur muda (± 24 jam), umur kultur dewasa (± 48 jam).
Uji suhu pertumbuhan isolat khamir dilakukan dengan cara mengambil dua dosis isolat khamir kemudian dihomogenisasi dengan 1 ml kaldu (kultur kerja) kemudian dipipet sebanyak 10 µl dan dimasukkan ke dalam 1 ml media MEB steril, kemudian masing-masing diinkubasi pada suhu 10oC, 20oC, 30oC, 37oC, 40oC yang masing-masing diinkubasi selama 48 jam. Uji pH pertumbuhan isolat khamir dilakukan dengan cara mengambil dua dosis isolat khamir, kemudian dihomogenisasi dengan 1 ml kaldu (kultur kerja) kemudian dipipet sebanyak 10 μl dan ditempatkan masing-masing dalam media MEB steril sebanyak 1 ml. dengan perubahan pH media yaitu pH 3, pH 4, pH 5 dan pH 6 kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 48 jam. Kemampuan pertumbuhan ragi AKT terhadap konsentrasi alkohol diuji menggunakan 3 ml media molase 14obrix yang telah disterilkan ditambah alkohol pada konsentrasi masing-masing 8%, 16% dan 24% v/v.
Molase kemudian diinokulasi dengan 0,3 ml kultur kerja dan kemudian diinkubasi pada suhu 30°C dengan masa inkubasi 24 jam dan 48 jam. Pengujian kapasitas produksi alkohol isolat khamir dilakukan dengan cara mengukur kadar alkohol yang dihasilkan isolat khamir yang diinokulasikan pada media molase dengan konsentrasi alkohol 8% v/v, 16% v/v, 24% v/v dengan menggunakan alat berupa cetakan cangkir Conway (Conway, 1939). Metode gelas kimia Conway dilakukan dengan mereaksikan 1 ml sampel (yang telah diinkubasi selama 24 dan 48 jam) dengan 1 ml Na2CO3 jenuh dalam gelas kimia Conway dan didiamkan selama ± 2 jam pada suhu kamar (± 30oC).
Uji kit API 20C dilakukan dengan mengambil isolat (dari hasil budidaya) menggunakan tabung plastik steril kemudian diinokulasikan ke dalam media suspensi. Untuk tahap penghilangan RNA, setelah diinkubasi pada suhu 600C, ditambahkan 5 μl RNAse (50 mg/ml) untuk membersihkan sampel, kemudian dihomogenisasi menggunakan pusaran dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. 3) Tahap protein stripping dilakukan dengan menambahkan 100 µl protein stripping buffer ke dalam sampel kemudian segera divortex selama 10 detik. Sampel disentrifugasi kembali pada kecepatan x g selama 3 menit, kemudian supernatan dibuang dan pelet dikering udarakan selama 10 menit (catatan: jangan mengeringkan pelet DNA menggunakan centrifuge vakum dan hindari mengeringkan pelet DNA dalam waktu lama) . 5) Tahap rehidrasi DNA dilakukan dengan menambahkan 50-100 µl buffer hidrasi DNA (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH8.0) atau ddH2O kemudian diinkubasi pada suhu 600C selama 10 menit untuk mencerna pelet DNA.
Amplifikasi dilakukan pada tahap predenaturasi pada suhu 95oC selama 3 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus yang masing-masing terdiri dari 3 tahap yaitu tahap denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, tahap annealing pada suhu 55oC selama 30 detik. , langkah ekstensi pada suhu 72oC selama 2 menit. Penentuan panjang fragmen wilayah ITS dilakukan dengan menggunakan 1 µl penanda DNA 100 bp (DNA ladder) yang dicampur dengan 1 µl loading dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur pertama.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran
A comprehensive overview of the classification, ecology, cytology, genetics, chemical composition and physiology of yeast. Ukraine : Department of Molecular Genetics and Biotechnology, Institute of Cell Biology, National Academy of Sciences (NAS). Multiplex PCR using Internal Transcribed Spacer 1 and 2 regions for rapid detection and identification of yeast strains.
The protein amino acid composition of plasma membranes influences membrane fluidity and thus ethanol tolerance in a self-flocculating fusant of Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae. Influence of the rate of ethanol production and accumulation on the viability of Saccharomyces cerevisiae in “fast fermentation”. The heat shock and ethanol stress responses of yeast show extensive similarity and functional overlap.
Identifikasi spesies Trichosporon yang penting secara medis berdasarkan urutan spacer transkripsi internal dan pembuatan database identifikasi Trichosporon. Persentase populasi khamir isolat X dengan cara inkubasi pada suhu 30oC pada medium MEB pH 4 dengan waktu inkubasi 8 jam. Pertumbuhan populasi khamir (cfu/ml) dan persentase kemampuan pertumbuhan khamir (%) dengan perlakuan dengan penambahan alkohol pada konsentrasi 8% v/v, 16% v/v, 24% v/v dalam medium pertumbuhan (molasses 14obrix).
Nilai serapan larutan K2Cr2O7 + alkohol bebas yang dikeluarkan isolat khamir pada media molase pada waktu inkubasi 24 jam dan 48 jam.
Kadar Alkohol Isolat Khamir X,Y,Z Selama Waktu Inkubasi 24 jam dan 48 jam
Nilai Kadar Alkohol (%)
Hasil blast Isolat X (Candida parapsilosis strain AUMC 10714)