15
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian experimental dengan melakukan pengujian aktivitas antibakteri hand sanitizer ekstrak daun binahong menggunakan bakteri Staphylococcus aureus dengan metode sumuran yang diberi perlakuan adanya variasi konsentrasi ekstrak pada setiap hand sanitizer. Penelitian ini dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali setiap konsentrasi dan data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan metode statistika One-Way ANOVA.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian Waktu : Januari 2020
Tempat Penelitian : Laboratorium Fitokimia, Diversivikasi Produk Kosmetik, dan Mikrobiologi Materia Medica.
3.3 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah neraca analitik, gelas kimia (Iwaki), toples, gelas ukur (Pyrex), batang pengaduk, cawan porselen, rotary evaporator (Buchi R- 215 Rotary Evaporator with B-491 Heating Bath and V-855 Vacuum Controller), oven (Memmert UN 30), shaker, spatula/sendok, aluminium foil, erlenmeyer (Pyrex), lemari pendingin, cawan petri, waterbath (Memmert WNB14 RING Waterbath 14 L), jangka sorong (KRISBOW Digital Caliper), alkohol meter, autoklaf, inkubator (Memmert IN55 Incubator), mikropipet (Thermo Scientific), botol spray, dan Bio Safety Cabinet (BIOBASE).
Bahan yang digunakan adalah 1 kg serbuk simplisia daun binahong yang telah dideterminasi oleh Laboratorium UPT Materia Medica dengan nomor batch 190909.BNH.F.006, aquadest steril, etanol 96% teknis, tip mikropipet (OneMed), gliserin nabati, essential oil Bali spa, kultur bakteri Staphylococcus aureus, media MHA (Mueller-Hinton agar) (Merck), cotton swab steril (OneMed), dan antibiotik Gentamicin injeksi ampul 40 mg.
16
3.4 Variabel Penelitian
Sugiyono (1997) menyatakan bahwa didalam penelitian merupakan suatu atribut dari sekelompok objek yang diteliti yang mempunyai variasi antara satu dengan yang lain dalam kelompok tersebut. Variabel adalah objek penelitian atau apa yang menjadi titik perhatian suatu penelitian (Arikunto, A., 2002).
Variabel bebas (independent variable) adalah variabel yang menjadi sebab timbulnya atau berubahnya variabel dependen (variabel terikat) (Sugiyono, 2006).
Yang menjadi variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi konsentrasi ekstrak daun binahong yang akan dimasukkan kedalam hand sanitizer yakni, 5%, 10%, dan 15%.
Variabel terikat (dependent variable) adalah variabel yang dipengaruhi atau yang menjadi akibat karena adanya variabel bebas. Yang menjadi variabel terikat dalam penelitian ini adalah pertumbuhan Staphylococcus aureus (luas zona hambat bakteri).
3.5 Definisi Operasional
Definisi operasional dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
Variabel Definisi Operasional Alat Ukur Hasil Ukur Skala Ukur
Zona hambat Staphylococcus aureus
Zona terang di sekitar sumuran pada media agar Mueller Hinton yang telah ditanami Staphylococcus aureus
Jangka sorong Diameter zona hambat (clear zone) dalam mm
Numerik
Hand sanitizer dengan variasi konsentrasi ekstrak daun binahong
Hand sanitizer ekstrak daun
binahong dengan
konsentrasi 5%, 10%, dan 15%
Mikro pipet Jumlah ekstrak sesuai dengan konsentrasi pada setiap produk hand sanitizer
Kategorik
17
Larutan antibiotik
Larutan ini menggunakan antibiotik gentamicin dengan konsentrasi 0,25%
Mikro pipet Sumuran berisi larutan antibiotik gentamicin
Kategorik
Kontrol positif Kontrol positif berupa campuran etanol 80%
dengan gliserin nabati
Mikro pipet Sumuran berisi campuran etanol 80% dengan gliserin nabati
Kategorik
Kontrol negatif Kontrol positif berupa aquadest steril
Mikro pipet Sumuran berisi aquadest steril
Kategorik
3.6 Prosedur Penelitian
3.6.1 Pembuatan Etanol 70% dan Etanol 80%
Untuk pembuatan entanol ini dibutuhkan etanol 96% yang akan diencerkan menggunakan aquadest. Etanol 96% dituangkan kedalam gelas ukur sebanyak 8750 mL dan dituangkan aquadest sebanyak 3250 mL sehingga didapatkan etanol 70% sebanyak 12 liter.
Untuk membuat etanol 80%, etanol 96% dituangkan kedalam gelas ukur sebanyak 1250 mL kemudian dituangkan aquadest sebanyak 250 mL sehingga didapatkan etanol 80% sebanyak 1,5 liter. Konsentrasi etanol yang dibuat dukur dengan menggunakan alkohol meter sehingga hasil yang didapatkan lebih akurat.
3.6.2 Pembuatan Ekstrak Daun Binahong
Maserasi dilakukan dengan memasukkan serbuk simplisia daun binahong kedalam toples kemudian ditambahkan 6 liter etanol 70% sedikit demi sedikit dengan mengaduknya hingga homogen kemudian dibiarkan selama 3×24 jam dalam suhu kamar sambil diaduk berulang-ulang diatas shaker. Hasil maserat yang diperoleh disaring kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 50ºC sampai kandungan cairan penyari hilang.
Selanjutnya hasil evaporasi diletakkan di waterbath untuk menguapkan sisa cairan penyari dan diperoleh ekstrak kental kemudian disimpan di lemari pendingin.
18
3.6.3 Sterilisasi Alat
Semua alat yang digunakan dalam penelitian disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit dengan cara cawan petri dan tip mikropipet dibungkus dengan aluminium foil.
3.6.4 Pembuatan Media MHA (Mueller-Hinton agar)
Serbuk media MHA ditimbang sebanyak 9,5 gram yang dilarutkan dalam 250 ml aquades lalu dipanaskan hingga larut sempurna. Media MHA yang sudah larut dimasukkan kedalam masing-masing cawan petri (± 15-20 mL) dan ditunggu beberapa waktu untuk memadat. Kemudian dilakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC dan disimpan di lemari pendingin.
3.6.5 Pembuatan Hand Sanitizer
Hand sanitizer dibuat dengan komposisi bahan gliserin nabati sebanyak 2,5 mL, ekstrak daun binahong yang dibuat variasi jumlah ekstrak yang ditambahkan sebanyak 5 mL, 10 mL, dan 15 mL, serta etanol 80%
yang ditambahkan sebagai pelarut sampai volume hand sanitizer keseluruhan sebanyak 100 mL. Terakhir menambahkan essential oil kedalam hand sanitizer sebanyak 2 tetes dan diaduk agar homogen.
Kontrol positif hand sanitizer dibuat dengan cara mencampurkan 2,5 mL gliserin nabati kedalam etanol 80% sampai volume hand sanitizer 100 mL. Hand sanitizer yang sudah jadi kemudian dimasukkan kedalam botol kemasan agar mudah dibawa, digunakan, dan tidak membahayakan pengguna.
3.6.6 Pengujian Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri hand sanitizer daun binahong terhadap Staphylococcus aureus dilakukan dengan metode sumuran. Metode sumuran diawali dengan membagi enam bagian dari media dalam cawan petri untuk setiap masing-masing sampel yang akan diuji. Pengujian dilakukan secara triplo dari masing-masing ekstrak agar didapatkan hasil yang lebih akurat. Setelah media dibagi menjadi enam, kemudian media dioles dengan bakteri Staphylococcus aureus secara merata dan dilubangi di setiap bagian. Setelah dilubangi, memasukkan sampel kedalam lubang
19
sumuran dengan urutan yang dH2O, Gentamicin yang sudah dilarutkan, kontrol positif hand sanitizer, hand sanitizer dengan ekstrak daun binahong konsentrasi 5%, 10%, dan 15%. Cairan sampel maupun kontrol yang dimasukkan kedalam sumuran sebanyak 100 μL. Kemudian diinkubasi selama 24 jam dan diamati daya hambat dari masing- masing sampel uji.
Daya hambat diketahui berdasarkan pengukuran diameter zona inhibisi (zona bening atau daerah jernih tanpa pertumbuhan mikroorganisme) disekitar lubang sumur. Pengukuran menggunakan jangka sorong dan dinyatakan dalam milimeter.
3.7 Pengolahan, Penyajian, dan Analisis Data
Data diperoleh dari hasil pengujian antibakteri di laboratorium. Analisis data yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan melakukan uji normalitas dan homogenitas menggunakan program Statistical Product and Service Solution (SPSS) 21.0 untuk melihat apakah ada efektifitas yang bermakna dari masing-masing sumuran yang mengandung hand sanitizer dengan berbagai konsentrasi ekstrak daun binahong, larutan antibiotik Gentamicin, kontrol positif, kontrol negatif, dan perulangannya terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Jika data yang dihasilkan menghasilkan taraf signifikan >0,05 maka akan dilanjutkan dengan menggunakan analisis One-Way ANOVA (Analysis of Variance). Data pada penelitian ini berupa dua variabel atau lebih kelompok yang tidak berpasangan sehingga dianalisis secara statistik inferensial menggunakan statistik One-Way ANOVA (Analysis of Variance) dengan taraf signifikan <0,05 berarti data berdistribusi normal maka konsentrasi berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus menunjukkan antibakteri yang paling efektif.
