Pada penelitian ini isolat Actinomycetes diperoleh dari deposit UPT-LTSIT Universitas Lampung yang diisolasi dari flora laut di perairan Bali dan Gorontala. Pada tahun 2013, penulis melanjutkan pendidikannya di Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung hingga memperoleh gelar Sarjana Sains pada tahun 2018. Sejak tahun 2019, penulis melanjutkan pendidikan magister kimia. Program Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung bidang kimia organik.
Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Organik 1 mahasiswa Kimia angkatan 2019 (Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam), Universitas Lampung. Bapak dan Ibu dosen Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung atas segala ilmu dan bimbingan yang diberikan selama penulis menempuh studi. Bapak dan Ibu Staf Unit Pelaksana Teknis Laboratorium Terpadu dan Pusat Inovasi Teknologi (UPT-LTSIT) Universitas Lampung.
Setiawan dan Ny. Laila, atas segala bantuan, bimbingan, nasehat dan motivasinya yang sangat membangun dalam menyelesaikan skripsi ini. Nafila, Violita Panca, Mega Muryani dan Kak Arif Nurhidayat yang selalu setia, terima kasih atas segala doa, dukungan, motivasi, saran, kritik, nasehat dan bantuannya dengan penuh kesabaran hingga penulis menyelesaikan skripsi ini. Keluarga Prodi Magister Kimia Universitas Lampung 2019, Kak Arik, Kak Arif, Elin, Mahliani, Tika, Desria dan Pina, terima kasih atas.
Nita Yuliyan, Dona Mailani P., Siti Mudmainah dan Dewi Citra sebagai tempat kepercayaan dalam berbagai permasalahan, terima kasih atas segala doa, dukungan, saran dan nasihatnya kepada penulis.
PENDAHULUAN
Latar Belakang dan Masalah
Actinomycetes merupakan bakteri gram positif (Li et al., 2016) yang berpotensi menjadi sumber produksi senyawa metabolit sekunder (Subramani dan Sipkema, 2019). Actinomycetes mampu menghasilkan metabolit sekunder seperti terpenoid, sterol, peptida, alkaloid dan asam lemak (Abdelmohsen et al., 2014). Sebagian besar metabolit sekunder Actinomycetes memiliki aktivitas berbeda seperti sebagai agen antibakteri, antijamur, antikanker atau antimalaria (Subramani dan Sipkema, 2019), dan antibiofilm (Balasubramanian et al., 2017).
Actinomycetes juga dapat hidup di jaringan atau organ tumbuhan (Janardhan et al., 2014), serta di biota laut seperti spons (El-Hawary et al., 2018) dan tunikata (Shaala et al., 2016). Subramani dan Sipkema (2019) melaporkan bahwa 97 spesies Actinomycetes diisolasi dari lingkungan laut selama tahun 2013–2017. Namun dibandingkan dengan keanekaragaman actinomycetes di alam, belum banyak bioaktivitas actinomycetes yang diuji. Hal ini memberikan peluang untuk memperoleh actinomycetes yang dapat menghasilkan berbagai metabolit sekunder (Subramani dan Aalbersberg, 2013; dan Dhakal et al., 2017).
Berdasarkan uraian di atas, penelitian terhadap senyawa bioaktif dari Actinomycetes yang berasosiasi dengan biota laut menunjukkan aktivitas yang beragam, namun informasi mengenai metabolit sekunder yang berpotensi berperan sebagai senyawa anti biofilm masih kurang. Oleh karena itu pada penelitian ini dilakukan isolasi senyawa anti biofilm dari Actinomycetes yang berasosiasi dengan biota laut terhadap S.
Tujuan dan Manfaat Penelitian
Kerangka Pemikiran
TINJAUAN PUSTAKA
- Actinomycetes
- Kultivasi Actinomycetes
- Senyawa Metabolit Sekunder Actinomycetes Asosiasi Biota Laut
- Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder
- Ekstraksi
- Kromatografi
- Karakterisasi Fraksi Aktif
- Bakteri
- Antibakteri
- Biofilm
- Antibiofilm
Ada berbagai jenis pembentukan spora pada Actinomycetes, seperti monospora, di- atau bispore (dua spora), oligospora (sedikit spora), dan polispora (banyak spora) (Li et al., 2016). Actinomycetes yang tergabung dalam oligospora antara lain Nocardia brevicatena yang membentuk rantai pendek sebanyak 2–7 spora dan rantai sporanya dapat bercabang (Li et al., 2016). Apabila timbul kondisi yang tidak menguntungkan maka spora akan terpisah dari hifa vegetatif dan hidup bebas di lingkungan (Barka et al., 2016).
Enzim kitinase Actinomycetes yang masih ada dapat memperoleh sumber karbon dari kitin (Asif et al., 2019; Pramesti dan Puspita, 2020). Produksi senyawa metabolit sekunder pada Actinomycetes terjadi pada fase lapisan, fase diam, fase kematian (Harir et al., 2018). Dengan bertambahnya jumlah media kultur yang digunakan maka produksi senyawa metabolit sekunder akan menurun, hal ini menunjukkan bahwa suplai oksigen merupakan faktor yang signifikan dan penting (Hu et al., 2018).
Metabolit sekunder aktinomycete mempunyai aktivitas yang berbeda-beda seperti antibakteri, antijamur, antikanker atau antimalaria (Subramani dan Sipkema, 2019), dan antibiofilm (Balasubramanian et al., 2017). Berdasarkan sifat sejenis zat terlarut, maka pelarut dengan karakteristik polaritas yang mendekati polaritas zat terlarut cenderung menjadi pilihan untuk mendapatkan hasil ekstraksi yang lebih baik dan sebaliknya (Zhang et al., 2016). Proses pemisahan pada teknik KLT menggerakkan eluen diatas permukaan fasa diam, dimana senyawa yang teradsorpsi lebih kuat pada fasa diam, sehingga perpindahan yang terjadi tidak akan jauh (Rf rendah), sebaliknya jika senyawa yang teradsorpsi semakin lemah maka perpindahan yang terjadi akan semakin besar dengan cepat mengikuti pergerakan eluen (Rf tinggi) (Kumar et al., 2013).
Proses KLT menggunakan pelat silika yang bersifat polar, yang menyebabkan senyawa polar mempunyai afinitas yang tinggi dan bergerak lambat karena adanya interaksi antara senyawa tersebut dengan gugus –OH pada silika (nilai Rf kecil) sedangkan eluen akan naik dengan cepat. membawa senyawa non polar yang tidak berinteraksi dengan fasa diam (silika) (Kumar et al., 2013). Fenomena terbentuknya biofilm oleh bakteri patogen menjadi salah satu faktor penyebab meningkatnya resistensi bakteri patogen terhadap berbagai jenis antibiotik (Penesyan et al., 2020). Mekanisme kerja senyawa antibakteri umumnya dengan merusak dinding sel bakteri, menghambat kerja enzim dan menghambat sintesis asam nukleat dan protein (Brooks et al., 2013).
Area yang terlihat jelas menunjukkan terhambatnya pertumbuhan bakteri, hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut mempunyai potensi sebagai antibakteri (Brooks et al., 2013). Keunggulan metode pengenceran adalah dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi minimum suatu sampel yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri (Madigan et al., 2015). Biofilm mengandung zat polisakarida ekstraseluler (EPS) yang berfungsi menempel dan melindungi sel bakteri (Gowrishankar et al., 2012).
MALDI adalah teknik ionisasi untuk molekul besar dan/atau labil seperti peptida, protein, polimer (Calderaro et al., 2014). Ion yang dipercepat akan dideteksi oleh detektor mode linier atau mode refleksi (Chernushevich et al., 2001).
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Alat dan Bahan
Metode
- Biomaterial
- Persiapan Limbah Kulit Udang dan Koloid Kitin
- Analisis Makroskopis Actinomycetes
- Analisis Mikroskopis Actinomycetes
- Skrining Senyawa Bioaktif Actinomycetes
- Uji Ketahanan Staphylococcus aureus
- Skrining Antibakteri
- Uji Pembentukan Biofilm
- Skrining Antibiofilm
- Isolasi Senyawa Bioaktif Antibiofilm
- Minimum Biofilm Inhibitory Concentration (MBIC)
- Karakterisasi Fraksi Aktif dengan Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy (LC-MS)
Hasil deproteinisasi dikeringkan dalam oven (suhu 55oC semalaman) dan ditimbang beratnya, produk yang diperoleh adalah kitin. Susunan spora dan struktur sporulasi diamati secara mikroskopis dengan menggunakan metode kultur kaca penutup yang mengacu pada Kawato dan Shinobu (1959). Isolat Actinomycetes ditumbuhkan pada media cair koloidal kitin menurut Hsu dan Lockwood (1975) dengan berbagai modifikasi.
Ekstrak kasar dibuat menjadi larutan stok 2 mg/mL untuk skrining antibakteri dan 0,5 mg/mL untuk skrining antibiofilm. Uji resistensi difusi cakram (Bauer et al., 1966) digunakan untuk menentukan pola resistensi antibiotik pada bakteri dengan beberapa modifikasi. Inokulum 100 µL dan 100 µL media ditambahkan ke masing-masing sumur, sesuai dengan inokulum sekitar 5×106 sel, sebagai kontrol untuk pertumbuhan biofilm.
Pewarnaan selanjutnya dilakukan dengan menambahkan 200 µL larutan kristal violet 0,1% (b/v) (Blando et al., 2019) dan didiamkan selama 5-15 menit. Identifikasi menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM) EVO dilakukan untuk mempelajari komposisi miselium dan spora isolat unggul Actinomycetes mengacu pada metode Setiawan dkk. Isolat Actinomycetes banyak dikultur pada media cair kitin koloidal mengacu pada Hsu dan Lockwood (1975), dengan beberapa modifikasi.
Setelah tumbuh, kultur ditambahkan (1:10) ke dalam 500 ml media kitin koloid baru dalam labu Erlenmeyer 2 liter, kemudian diinkubasi pada suhu 30°C dalam kondisi statis hingga 14 hari. Fraksi alkaloid dominan selanjutnya difraksinasi menggunakan metode kromatografi kolom dengan fasa diam C18 dan fasa gerak air MeOH. Fraksinasi selanjutnya dilakukan dengan metode kromatografi kolom dengan fasa diam silika dan fasa gerak DCM 100%.
Fraksi alkaloid yang dominan kemudian dilakukan uji antibiofilm untuk mengetahui kemampuan fraksi tersebut dalam menghambat pertumbuhan biofilm. Pada fraksi alkaloid dominan dilakukan uji MBIC dengan mengacu pada metode uji antibiofilm (Kwasny dan Opperman, 2010). LC-MS/MS digunakan untuk menentukan berat molekul (m/z) dan rumus molekul yang terkandung dalam sampel (Silverstein et al., 2005).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
-Laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) assisted mass spectrometry applied to virus identification. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-like P. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Evaluation of anti-biofilm and antibacterial effects of Juglans regia L. extracts against clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa.
A new meroterpenoid from Nocardiopsis sp. and Fortas and Rebecca Pogni, Z. Basic Biology and Applications of Actinobacteria. Powdered chitin agar as a selective medium for the enumeration of actinomycetes in water and soil. November, a new marine sponge-derived Actinobacterium with antibacterial potential against Streptococcus agalactiae. Optimization of culture conditions for ganoderic acid production in ganoderma lucidum liquid static culture and design of a suitable bioreactor.
Brock Biology Of MicroorganismFourteenth Edition. Pearson Education, Inc. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Investigation of the fluorescent dye Alamar Blue (resazurin) to assess mammalian cell cytotoxicity. Effect of culture medium and nutrients on biofilm growth kinetics of laboratory and clinical strains of Enterococcus faecalis.
Mechanisms of action of systemic antibiotics used in periodontal treatment and mechanisms of bacterial resistance to these drugs.
