jurnal taksonomi numerik fanetik molekular kapang

(1)

Mikologi Medistahun 1999,37, 25–33 Diterima 5 Oktober 1998

Identifikasi ulang molekuler patogen manusia Trichoderma mengisolasi sebagai Trichoderma longibrachiatum Dan

Trichoderma citrinovirida

K. KUHLS,* E. LIECKFELDT,* T. BO8RNER* dan E. GUÉHO†

*

Bahasa Humboldt-Universitas BerlinBahasa Indonesia:Institut für Biologie (Genetik)Bahasa Indonesia:Sepatu Chausseestr.117Bahasa Indonesia:D-10115 Kota BerlinBahasa Indonesia:Jerman; dan †Institut Pasteur Bahasa Indonesia:Unit MikologiBahasa Indonesia:25Bahasa Indonesia:jalan Dokter RouxBahasa Indonesia:F-75724 Paris Cedex 15Bahasa Indonesia:Perancis

Beberapa spesies dari genus saprofit yang terkenal

Trichoderma

telah diidentifikasi sebagai penyebab infeksi pada manusia yang mengalami imunosupresi. Karena diferensiasi dan identifikasi

Trichoderma

spesies berdasarkan karakter morfologi saja, sangat sulit, dua pendekatan molekuler diterapkan untuk identifikasi spesies. Enam patogen manusia

Trichoderma

isolat diselidiki dengan PCR-fingerprinting dan analisis urutan internal transcribed spacer (ITS) DNA ribosomal dan dibandingkan dengan set data terkait yang ditetapkan untuk spesies genus yang dijelaskan. Lima dari strain ini diidentifikasi sebagai

T

.

bunga longibrachiatum

, sedangkan satu strain tunggal ternyata

T

.

jeruk nipis

6

warna merah muda

Kedua spesies tersebut sangat erat hubungannya dan termasuk dalam

Trichoderma

bagian

Bunga Longibrachiatum

Data ini menunjukkan bahwa kejadian patogen

Trichoderma

strain mungkin dibatasi pada spesies bagian

Bunga Longibrachiatum

.

Kata Kuncimikosis oportunistik, PCR-sidik jari, DNA ribosom,Triko- kulit

Perkenalan

TrichodermaSpesies ini dilaporkan bertanggung jawab atas manifestasi alergi tipe 1 [4].Trichoderma6warna merah muda diisolasi dari bangunan lembab dan berjamur ditemukan menyebabkan gejala mukosa/pernapasan pada orang yang mengeluhkan efek kesehatan yang merugikan [5]. Juga ditunjukkan bahwa beberapaTrichodermaspesies (terutama bagianBunga Longibrachiatum) dapat menyebabkan masalah kesehatan serius akibat emisi metabolit alergenik atau toksik yang mudah menguap (U. Thrane, Universitas Teknik, Departemen Bioteknologi, Lyngby, Denmark, komunikasi pribadi). Tiga kasus peritonitis dilaporkan, yang disebabkan olehT.6warna merah muda[6],T.koningi[7] danT. bunga longibrachiatum[8], masing- masing. Masalah serius lainnyaTriko- kulitinfeksi telah diamati pada komplikasi pascatransplantasi.Trichoderma6warna merah mudaditemukan bertanggung jawab atas infeksi hematoma perihepatik pada penerima transplantasi hati [9] danT.

pseudokoningiidiidentifikasi sebagai agen penyebab infeksi fatal pada penerima transplantasi sumsum tulang [10]. Dua

keberhasilan Dalam beberapa tahun terakhir banyak jamur yang biasanya

dianggap sebagai saprofit dan tidak berbahaya telah terbukti menjadi patogen serius pada pasien dengan gangguan kekebalan tubuh. Di antara jamur ini, spesies dari genusTrichodermatelah dilaporkan sebagai penyebab infeksi serius pada manusia.

BiasanyaTrichodermaSpesies ini adalah jamur saprofit atau jamur pelapuk kayu yang tidak berbahaya. Di antaraTrichoderma beberapa spesies memiliki kepentingan komersial.Trichoderma 6 bunga irenBahasa Indonesia:T.bunga harzianumDanT.6warna merah mudaditerapkan dalam pengendalian hayati jamur patogen tanaman [1].Trichoderma reeseidigunakan dalam bioteknologi sebagai penghasil selulase dan enzim hidrolitik lainnya [2].Trichoderma harzianum Strain ini dikenal sebagai pesaing serius dalam produksi jamur komersial [3].

Korespondensi: Dr K. Kuhls, Humboldt-Universität zu Berlin, Institut für Biologie (Genetik), Chausseestr. 117, D-10115 Berlin, Jerman. Telp.: +49 30 20938140; faks: +49 30 20938141.

Diunduh dari https://academic.oup.com/mmy/article/37/1/25/1046828 oleh tamu pada 12 Oktober 2024

(2)

perawatanTrichodermainfeksi baru-baru ini telah terjadi. Dalam kasus pertama, abses otak karenaT. bunga longibrachiatumpada pasien leukemia dengan neutropenia berkepanjangan

disembuhkan dengan reseksi bedah abses dan terapi antijamur berkepanjangan [11]. Pada kasus kedua,T.bunga longibrachiatum Infeksi kulit invasif yang berkembang pada anak dengan anemia aplastik parah dengan etiologi yang tidak diketahui dan neutropenia berkepanjangan disembuhkan dengan terapi antijamur sistemik yang kemudian memungkinkan transplantasi sumsum tulang yang berhasil [12].

Sistematika genus Hyphomycete

Trichoderma

(Deuteromycetes) menjadi rumit karena kurangnya karakteristik morfologi yang khas. Revisi komprehensif dari genus ini disajikan oleh Rifai [13] dan Bissett [14–17].

Tinjauan rinci tentang biologi dan taksonomi

Trichoderma

baru-baru ini dipresentasikan [18]. Resolusi dan

identifikasi

Trichoderma

Spesies tetap sulit diidentifikasi jika hanya karakter morfologi yang dipertimbangkan. Hal ini menyebabkan seringnya terjadi kesalahan identifikasi pada tingkat spesies.

Dalam beberapa tahun terakhir metode molekuler digunakan untuk menjelaskan hubungan filogenetik Trichoderma Metode-metode ini meliputi analisis isozim [19–21], sidik jari DNA [22], analisis RFLP gen selulase [23,24] dan mtDNA [25], kariotipe [26], sidik jari PCR dan RAPD [27–31] dan sekuensing wilayah ITS1–5·8S–

ITS2 DNA ribosom [31,32]. Dalam penelitian ini, sidik jari PCR dan analisis sekuens wilayah ITS rDNA digunakan untuk mengidentifikasi patogen manusia.

Trichoderma strain, termasuk strain dari dua kasus yang dilaporkan [10,11].

Karena spesiesnyaT.bunga longibrachiatumdikutip dalam beberapa makalah medis [8,11,12] serta kerabat dekatnyaT.pseudokoningii[10], 11 strain non-klinisT. bunga longibrachiatumditambahkan ke penelitian untuk perbandingan, termasuk kultur tipe ex (ATCC 18648) dariT.panjang- brakialis, serta kultur tipe ex (DAOM 167678) dariT.

pseudokoningiiStrain spesies lain (T. koningiBahasa Indonesia:T.6 warna merah mudaBahasa Indonesia:T.bunga harzianum/atro6warna merah mudaBahasa Indonesia:T.reeseiBahasa Indonesia:T. jeruk nipis6 warna merah mudaBahasa Indonesia:T.parceramosum) juga dimasukkan dalam penelitian untuk perbandingan PCR-sidik jari karena spesies tersebut telah dilaporkan dalam literatur medis dan/

atau karena spesies tersebut umumnya ditemukan di lingkungan (Tabel 1). Empat strain non-klinisT. jeruk nipis6warna merah muda diselidiki dalam percobaan sidik jari PCR tambahan. Beberapa strain dan spesies lainnya ditambahkan, seperti yang ditampilkan dalam Tabel 1, untuk analisis filogenetik menggunakan wilayah rDNA ITS1–

5·8S–ITS2. Kultur jamur ditumbuhkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [30].

Isolasi DNA

Kultur dipanen dengan penyaringan, miselium dibekukan dan digiling menjadi bubuk dalam nitrogen cair. DNA diisolasi seperti yang dijelaskan [33], disuspensikan dalam 300Ml TEbuffer [34] dan disimpan pada suhu −20 °C.

PCR - sidik jari

Reaksi sidik jari PCR dilakukan seperti yang dijelaskan di tempat lain [30]. Oligonukleotida (GACA)4, (GTG)5dan 5%- GAGGGTGGCGGTTCT-3% (urutan inti fage M13) digunakan sebagai primer. Produk amplifikasi dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1·2% dalam 1Bahasa Indonesia:

Penyangga TBE [34] dan dideteksi dengan pewarnaan etidium bromida.

Bahan dan metode Kultur jamur

Itu

Trichoderma

Strain yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel 1. Lima dari enam strain patogen

Trichoderma

Strain yang diperiksa diisolasi dari pasien immunocompromised. Strain IP 92·0494 (=IP 2110·92) (P8), IP 92·0647 (P1) dan IP 93·1192 (P2) diisolasi dari pasien dengan leukemia akut. Strain IP 92·0494 (P8) adalah penyebab infeksi fatal pada penerima transplantasi sumsum tulang [10]. Strain IP 93·1192 (P2) menyebabkan abses otak pada pasien leukemia dengan neutropenia berkepanjangan [11]. Strain IP 94·0958 (P3) diisolasi bersama dengan

Jamur Aspergillus fumigatus

dari pasien yang menjalani transplantasi paru-paru. Strain IP 95·1151 (P9) dan IP 96·0086 (P10) diisolasi dari hemokultur pasien yang mengalami aplasia terkait limfoma dan dari luka hematoma pasien yang sehat. Semua isolat klinis ini toleran terhadap suhu 37 °C.

Uji amplifikasi DNA ribosom

Fragmen DNA yang mengandung internal transcribed spacer 1 (ITS1), rDNA 5·8S, dan internal transcribed spacer 2 (ITS2) diperoleh melalui amplifikasi PCR DNA genom menggunakan dua primer SR6R (5%-

AAGTAGAAGTCGTAACAAGG-3%) dan LR1 (5%- GGTTGGTTTCTTTCCT-3%) [35]. Primer ini terdiri dari urutan yang dilestarikan dalam rDNA subunit kecil (SR6R) dan rDNA subunit besar (LR1), yang mengapit internal transcribed spacer. Campuran reaksi (100Ml) mengandung 2·5 U

Tak

DNA polimerase (Promega, Heidelberg, Jerman);

10Ml dari 10Bahasa Indonesia:

Tak

Penyangga reaksi DNA polimerase (Promega); 0,2 mMmasing-masing

deoksiribonukleotida trifosfat (Boehringer Mannheim, Mannheim, Jerman); 3 mMmagnesium asetat

(3)

Tabel 1 Daftar yang diselidikiTrichodermaketegangan

Jenis Nomor strain* Sumber EMBL (EBI)†

TrichodermaBahasa Indonesia: sp.

T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.bunga longibrachiatum T.jeruk nipis6iris T.jeruk nipis 6iris T.jeruk nipis6iris T.jeruk nipis6iris T.jeruk nipis6iris T.

bunga harzianum/atro6iris T .koningi

T.parceramosum T.polisporum T.pseudokoningii T.reesei

T.6warna merah muda T.6warna merah muda

IP-92·0494 (P8) IP-92·0647 (P1) IP-93·1192 (P2) IP-94·0958 (P3) IP-95·1151 (P9) IP-96·0086 (P10)

Nomor ATCC 18648T Nomor telepon ATCC 38586 Nomor telepon ATCC 52326 Nomor ATCC 60641

DAOM 175956

nomor induk kependudukan 92027

IMI 291014 GJS 91-157 CEK 2606 PPRI 3894 PJS 79-3

Nomor ATCC 24961 Nomor ATCC 58843T

DAOM 167676 DAOM 183926 DAOM 191523

Nomor ATCC 36042 Nomor ATCC 64262 Nomor ATCC 28019T

ATCC 18650 CBS 408,91T Nomor ATCC 13631T

Nomor ATCC 18652

CBS 240·63

Manusia, leukemia Manusia, leukemia Manusia, leukemia Transplantasi paru-paru manusia

Manusia, limfoma Manusia, infeksi kulit

Lumpur Tanaman

Ampas tebu

Serasah daun Busuk lunak cedar Benang katun Tidak ditentukan Lumut Tanah

Zea mays

Karpet yang membusuk Pohon Pinustanah Tanah hutan Serpihan kayu Serat kaca berminyak Tanah

Jeruk nipis Gabus Tanah Tidak ditentukan

Kayu

Kandang bebek kapas Tidak ditentukan Pinus siwalan6estrus

Z82902 Z79621 Z79622 Z79786 Z82903 Z82904 Z31019 Z48948 Z48935 Z48934 –– Z82912 X93933 X93929 X93930 X93932 Z48949 Z31017 X93958 – X93941 Z48812 X93983 Z31015 Z48815 Z31014 Z31016 X93978 X93979

* IP, Institut Pasteur, Paris, Prancis; ATCC, American Type Culture Collection, Rockville, MD, AS; DAOM, Departemen Pertanian, Ottawa, Kanada; IMI, International Mycological Institute, Egham, Inggris; CECT, Colección Española de Cultivos Tipo, Burjasot, Spanyol; PJS, PJ Stadler, Koleksi Institut für Biochemische Technologie und Mikrobiologie, Wien, Austria; PPRI, Plant Protection Research Institute, Pretoria, Afrika Selatan; GJS, koleksi GJ Samuels, Departemen Pertanian AS, Beltsville, MD, AS; CBS, Centraalbureau voor

Schimmelcultures, Baarn, Belanda; (P1, 2, …), penomoran gel.TJenis kultur ex-tipe spesies tersebut.

† Nomor akses sekuens di Perpustakaan Biologi Molekuler Eropa (Heidelberg, Jerman), Institut Bioinformatika Eropa Luar Negeri (EBI), Hinxton Hall, Inggris.

etate; 50 ng DNA genomik dan 50 ng dari dua primer.

Campuran reaksi dilapisi dengan minyak mineral. Amplifikasi dilakukan dalam bio-med 60/2 thermocycler dengan program berikut: denaturasi awal selama 3 menit pada 97 °C; 20 siklus 35 detik pada 97 °C, 55 detik pada 50 °C, 45 detik pada 72 °C (waktu ekstensi ditingkatkan 4 detik per siklus); 10 siklus 45 detik pada 97 °C, 55 detik pada 50 °C, 2 menit pada 72 °C (waktu ekstensi ditingkatkan 4 detik per siklus); langkah ekstensi tunggal terakhir 7 menit pada 72 °C. Hasil dari amplifikasi diuji dengan elektroforesis gel agarosa 1·2%

menggunakan 5Ml alikuot dan 1Bahasa Indonesia: penyangga TAE [34].

DNA Ribosom-pengurutan

Kedua untai fragmen amplifikasi PCR-rDNA dari semua strain diurutkan dengan direct cycle sequencing menggunakan metode manual konvensional [31] atau automatic sequencer A373 (Applied Biosystems). Untuk sekuensing otomatis, fragmen PCR dimurnikan dengan menggunakan QUIAquick PCR purity kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). Reaksi sekuensing dilakukan dengan

Tak

PewarnaDeoksiWaktu StandarTerminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), menggunakan 50–70 ng fragmen yang dimurnikan dan 20 pmol masing-masing

(4)

Gbr. 1Pola sidik jari PCR klinisTrichodermaisolat dibandingkan denganT.bunga longibrachiatumdan spesies lain yang mirip dengan genus tersebut.

Amplifikasi dengan primer (GACA)4(A) dan M13 (B). 1, P1 (IP-92·0647); 2, P2 (IP-93·1192); 3, P3 (IP-94·0958); 4, P8 (IP-92·0494); 5, P10 (IP-96·0086); 6,T.

bunga longibrachiatum(Tl) ATCC 52326; 7, Tl PJS 79-3; 8, Tl DAOM 175956; 9, Tl ATCC 18648 (Jenis); 10, TlATCC 60641; 11, TlATCC 38586; 12, Tl IMI 92027; 13, Tl IMI 291014; 14,T.jeruk nipis6warna merah muda(Tc) DAOM 167676; 15 Tc ATCC 24961; 16,T. pseudokoningii(Tps) DAOM 167678 (Jenis);

17,T.koningi(Tk) ATCC 64262; 18,T.6warna merah muda(Tv) ATCC 18652; 19, Tv CBS 240·63. M, penanda berat molekul (tangga 1 kb).

primer (SR6R atau LR1), menerapkan kondisi PCR yang direkomendasikan oleh produsen. Reaksi sekuensing dijalankan pada gel poliakrilamid 6% yang ditempelkan pada sequencer.

pola tipe ing [29–31]. Jenis pola pita spesifik spesies ini berfungsi sebagai penanda identifikasi spesies. Pada percobaan pertama kami menyertakan, selain strain patogen, satu atau beberapa strain non-klinis dari berbagaiTrichodermajenis:T.pseudokoningii DAOM 167678 (tipe ex),T.koningiNomor ATCC 64262,T.panjang- brakialisATCC 18648 (tipe ex) dan ATCC 52326,T. reeseiQM9123,T.

parceramosumATCC 28019 (tipe ex), T.jeruk nipis6warna merah mudaNomor ATCC 24961,T.6warna merah mudaATCC 18652 dan T .bunga harzianum/atro6warna merah mudaATCC 36042 (data tidak ditampilkan). Galur P1, P2, P3, P8, dan P10 menunjukkan pola sidik jari PCR yang sangat mirip seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1 (jalur 1–5). Kesamaan yang tinggi seperti itu sebelumnya hanya ditemukan di antara galur dari spesies yang sama [29–31], oleh karena itu disimpulkan bahwa galur-galur ini termasuk dalam spesies yang sama. Selain kesamaan pola secara keseluruhan ini, masing-masing galur patogen P1, P2, P3, P8, dan P10 memiliki pola yang unik dengan primer M13 (Gambar 1A, jalur 1–5). Galur P1 memiliki pola yang berbeda dari galur lainnya dengan primer (GACA)4(Gbr. 1B, lajur 1). Strain P2, P3, dan P10 menunjukkan pola yang tidak dapat dibedakan dengan primer yang sama (Gbr. 1B, lajur 2, 3, 5), sedangkan strain P8 berbeda pada posisi dua pita (Gbr. 1B, lajur 4).

Pada percobaan pertama (data tidak ditampilkan) terlihat adanya kemiripan yang tinggi antara strain tipe ex

T

.

panjang

-

brakialis

dan strain P1, P2, P3, P8 dan P10.

Sebaliknya, tidak ada kesamaan dengan penelitian lain.

Analisis data

Urutan diselaraskan menggunakan program penyelarasan gandaKLUSTALF, diikuti dengan optimasi visual. Analisis filogenetik dari sekuens dilakukan dengan

PAPUA(Phylogenetic Analysis Using Parsimony) program komputer, versi 3.1.1 [36]. Kesenjangan tunggal diperlakukan sebagai basis kelima. Pencarian pohon yang paling parsimonious dilakukan dengan menggunakan algoritma 'branch-and-bound'. Analisis bootstrap [37] digunakan untuk mengevaluasi kekuatan cabang internal pohon dengan melakukan 100 replikasi dengan opsi pencarian heuristik diPAPUA

3.1.1.

Hasil

Untuk karakterisasi molekuler pertama dari strain klinis, kami memilih metode PCR-fingerprinting. Tiga primer berbeda digunakan untuk amplifikasi: M13, (GACA)

⁴

dan (GTG)

⁵

Dari penelitian sebelumnya diketahui bahwa masing-masing spesies Trichoderma yang diteliti dikarakterisasi dengan PCR-sidik jari spesifik spesies

(5)

spesies yang terpagar dari genus (lihat juga Gambar 1, jalur 14–19), yang sebelumnya sering disebutkan dalam literatur sebagai penyebab infeksi [5–7,9,10].

Pada percobaan kedua kami memasukkan strain P1, P2, P3, P8, P10, delapan strainT.bunga longibrachiatum, dua strain masing-masingT.jeruk nipis6warna merah mudaDanT.6warna merah muda, dan satu strain masing-masingT.pseudokoningii DanT.koningi(Gambar 1). Hal ini dilakukan untuk

menunjukkan variabilitas intra-spesiesT.bunga

longibrachiatum, membandingkan pada saat yang sama, pola strain saprofit dan patogen. Kesamaan yang tinggi antara pola strain klinis dan semua strain non-klinisT.bunga longibrachiatumstrain (Gambar 1, jalur 6-13) diamati. Data ini menunjukkan bahwa strain P1, P2, P3, P8 dan P10T.bunga longibrachiatumSelain itu, dalam percobaan sidik jari PCR sebelumnya dengan sejumlah besarT.bunga longibrachiatum strain kami menemukan empat subkelompok (A–D) dalam spesies ini yang dapat dikenali dari jenis pola sidik jari PCR [38]. Gambar 1 menunjukkan tiga subkelompok ini,6saya.

subgrup A—jalur 9–10, subgrup B—jalur 6–8, dan subgrup C—

jalur 11–13. Subgrup A mencakup budaya tipe exT.bunga longibrachiatum. Isolat klinis P2, P3, P8, P10 menunjukkan hubungan yang lebih dekat dengan subkelompok B,

sedangkan posisi isolat P1 adalah intermediet. Dengan primer M13, strain ini tampaknya lebih dekat hubungannya dengan subkelompok B, dengan primer (GACA)4ke subgrup A dan C.

Strain patogen keenam (P9) memiliki pola yang sama sekali berbeda dari semua strain klinis lainnya (Gbr. 2, lajur 1, 6–8).

Perbedaan antara strain ini dan lima isolat klinis lainnya merupakan hal yang umum pada tingkat antarspesies. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa strain ini tidakT. bunga longibrachiatumSebaliknya, sidik jari PCR menunjukkan homologi yang tinggi dengan pola yang diperoleh dari strain T.jeruk nipis6 warna merah muda(Gbr. 2, jalur 1, 2–5).

Percobaan sekuensing wilayah ITS dilakukan untuk

mengonfirmasi identifikasi yang dibuat berdasarkan data sidik jari PCR. Kelompok sidik jari PCR bertepatan persis dengan kelompok yang diamati dalam sekuens ITS. Galur P2, P3, P8 dan P10 memiliki sekuens yang identik. Galur P1 hanya berbeda dalam satu nukleotida (dalam ITS1) dari empat lainnya. Sekuens ini dibandingkan dengan basis data sekuens ITS dari berbagaiTiga- kodratspesies [32,38]. Dalam percobaan sebelumnya kami menemukan urutan ITS spesifik spesies untukTrichodermaIsolasi yang tidak teridentifikasiTrichodermadapat dimasukkan ke dalam spesies tertentu berdasarkan urutan ITS mereka. Strain P1–P3, P8 dan P10 memiliki urutan ITS spesifikT.bunga longibrachiatum Dalam percobaan sebelumnya kami menemukan empat subkelompok urutan ITS dalamT.bunga longibrachiatum [32,38].

Membandingkan isolat patogen manusia dengan subkelompok ini, kami menemukan bahwa strain P1 memiliki 100%

homologi dengan urutan ITS dari kultur tipe ex T.bunga longibrachiatum(subkelompok I), sedangkan strain P2, P3, P8 dan P10 identik dengan subkelompok II, yang mencakup sebagian besarT.bunga longibrachiatumketegangan.

Isolat patogen keenam P9 dikonfirmasi sebagai strainT.jeruk nipis6warna merah mudaberdasarkan homologi 100% dengan urutan ITS unik dari spesies ini, termasuk juga kultur tipe ex. Tidak ada variabilitas intra-spesifik dalam urutan ITS yang diamati dalam T.jeruk nipis6warna merah mudadalam penelitian sebelumnya [32].

Gambar 3 adalah filogram yang dihasilkan oleh analisis parsimoni dari urutan ITS, yang mewakili salah satu dari enam pohon paling parsimoni yang diperoleh dengan algoritma 'cabang dan batas' diPAPUA

3.1.1. Pohon ini menunjukkan hubungan filogenetik dari spesies yang diteliti.Trichodermastrain dan spesies. Semua spesies dari bagian Bunga Longibrachiatumklaster dalam satu klade utama yang didukung oleh 100% set data bootstrap. Dalam klade ini semua spesies dari bagianpanjang- brakialis(T.bunga longibrachiatumBahasa Indonesia:T.

jeruk nipis6warna merah mudaBahasa Indonesia:T.semu- dokoningii Bahasa Indonesia:T.reeseiBahasa Indonesia:T.parceramosum[32,38]) dapat dibedakan dengan jelas. Filogram ini menjelaskan posisi isolat patogen manusia di antara spesies bagianBunga Longibrachiatum serta kedekatannya dengan subkelompok spesies tertentuT.bunga longibrachiatumDua klade lainnya yang didukung juga oleh nilai bootstrap sebesar 100% terdiri dari spesies bagianTrichodermadan bagian Pakibasium, masing-masing.

Gambar 2Identifikasi ulang klinisTrichodermamengisolasi sebagaiT. jeruk nipis6warna merah muda(P9) danT.bunga longibrachiatum(P1, P2, P10, lihat juga Gambar 1) dengan sidik jari PCR. Amplifikasi dengan primer (GACA)4(A) dan M13 (B). 1, P9 (IP-95·1151), 2,T.jeruk nipis6warna merah muda(Tc) ATCC 24961; 3, Tc DAOM 167676; 4, Tc DAOM 191523; 5, Tc DAOM 183926; 6, P10 (IP-96·0086); 7, P2 (IP-93·1192); 8, P1 (IP-92·0647); 9,T.bunga longibrachiatum ATCC 52326. M, penanda berat molekul (tangga 1 kb).

(6)

Gambar 3Posisi filogenetik klinis Trichoderma strain (ditandai) dalam genus Trichoderma berdasarkan urutan ITS. Filogram yang disajikan adalah salah satu dari enam pohon paling parsimoni yang diperoleh dengan analisis parsimoni urutan wilayah ITS1–5·8S–ITS2 menggunakan algoritma 'cabang dan batas' dalamPAPUA3.1.1 (191 langkah, CI=0,901, HI=0,099; RI=0,942). Angka di bawah cabang menunjukkan persentase cabang yang didukung oleh analisis bootstrap (100

replikasi). Nilai di atas cabang menunjukkan total perubahan nukleotida yang ditetapkan pada setiap cabang. Jenis strain ExTrichoderma Spesies ditandai dengan tanda bintang.

Diskusi

Hanya ada satu laporan tentang infeksi olehT. pseudokoningii[10].

Strain patogen ini telah diidentifikasi ulang dengan metode molekuler sebagaiT.bunga longibrachiatumSering terjadi kebingungan spesiesT.

bunga longibrachiatumBahasa Indonesia: T.pseudokoningiiDanT.jeruk nipis6warna merah mudakarena kesamaan morfologinya telah dibuktikan dengan menggunakan pendekatan molekuler [29,32,38].

Studi-studi tersebut juga menunjukkan bahwa T.pseudokoningiiadalah spesies langka yang hanya ditemukan di Australasia (dengan satu pengecualian-strain yang ditemukan di AS), sedangkanT.bunga longibrachiatumDanT.jeruk nipis6warna merah muda memiliki distribusi di seluruh dunia.

Sungguh mengejutkan mengetahui bahwa strain patogen manusia hanya terbatas pada satu bagianTrichoderma, bagian panjang- brakialisSpesies lainTrichodermayang termasuk dalam bagian yang berbeda lebih umum di lingkungan daripada anggota bagianBunga LongibrachiatumHal ini menimbulkan pertanyaan tentang faktor apa yang mempengaruhiT.panjang- brakialisdan, pada tingkat yang lebih rendah,T.jeruk nipis6warna merah muda terhadap patogenisitas manusia.Trichoderma longibrachiatum diketahui memiliki suhu pertumbuhan optimum yang tinggi Ini adalah pertama kalinya sejumlah penelitian klinis Trichoderma

isolat telah diidentifikasi secara jelas menggunakan dua pendekatan molekuler. Kecuali isolat tunggal P9, diidentifikasi sebagaiT.jeruk nipis6warna merah muda, semua patogen manusia lainnyaTrichodermastrain yang kami periksa adalahT.

bunga longibrachiatumKedua spesies tersebut sangat erat hubungannya dalam bagianBunga LongibrachiatumDalam sebuah penelitian ekstensif sebelumnya tentangTrichoderma menggunakan urutan rDNA (wilayah ITS1–5·8S–ITS2), bagian Bunga Longibrachiatumditemukan sebagai kelompok monofiletik dalam genus Trichoderma[32,38].

Trichoderma koningii

atau

T

.6

warna merah muda

dilaporkan tiga kali dalam literatur medis [6,7,9] sebagai patogen manusia tetapi karena strain yang sesuai tidak dijelaskan dan tampaknya tidak diawetkan, kami tidak dapat mengkonfirmasi identitasnya. Prevalensi

T

.

panjang

-

brakialis

di antara strain klinis yang telah kami periksa membuat kami menduga bahwa laporan sebelumnya

T

.

koningi

Dan

T

.6

warna merah muda

mungkin tidak benar.

(7)

(\28 °C) dan suhu pertumbuhan maksimum yang tinggi (\

38 °C) [39]. Kedua spesies memiliki laju pertumbuhan yang sangat cepat, menutupi cawan Petri 9 cm dengan agar kentang dekstrosa dalam waktu 64 jam pada suhu 30 °C [39]. Namun, beberapa faktor terlibat dalam virulensi jamur oportunis. Selain termotoleran dan hidrofobisitas (adherensi) konidia, protease ekstraseluler, pigmen melanik atau karotenoid, dan mikotoksin juga terlibat dalam proses infeksi [40].

Karena pentingnya beberapa hal secara ekonomi,Tiga- kodratspesies, kehati-hatian harus dilakukan dalam

penggunaannya. Hal ini terutama berlaku untukT.reesei, yang digunakan sebagai penghasil selulase dan penghasil potensial protein heterolog.Trichoderma reeseisebelumnya diterima sebagai sinonim untukT.bunga longibrachiatum[14].

Investigasi molekuler baru-baru ini mengungkapkan bahwa itu adalah turunan klonal dari ascomycete pantropisHipokrea jecorinadan hubungan dekatnya denganT.bunga

longibrachiatum [31,32].Trichoderma reeseitelah terbukti tidak berbahaya, tidak patogen dan tidak beracun bagi hewan laboratorium yang sehat [41]. Namun, jamur ini dapat bertindak sebagai patogen dalam kondisi eksperimen yang ekstrim, ketika inokulum konidia besar diberikan kepada hewan yang mengalami imunosupresi [42]. Produksi peptaibol paracelsin olehT.reesei, suatu zat yang dilaporkan memiliki sifat pengubah membran dan aktivitas antibiotik, terutama terhadap bakteri Gram-positif, telah dilaporkan dalam satu publikasi [43], namun hal ini tidak dapat dibuktikan oleh penulis lain [42,44]. Anggota lain dari bagian Bunga LongibrachiatumBahasa Indonesia:T.saturnisporum[

32,39], juga menunjukkan aktivitas antibiotik dan mikotoksik.

Suatu zat dari keluarga paracelsin diisolasi dari ekstrak kultur spesies ini [45].

Berdasarkan hasil yang ada saat ini, tampaknya semua penelitian klinisTrichodermaisolat dibatasi pada bagian Bunga LongibrachiatumMasih terlalu dini untuk menggeneralisasi apakah semua spesies dari bagian ini dapat menjadi patogen bagi manusia (dan hewan). Namun, sejauh ini, semua isolat klinis yang diidentifikasi dengan jelasTrichodermaadalah T.

bunga longibrachiatum, kecuali satu pengecualian T.jeruk nipis6warna merah mudaketegangan. Bisa dibayangkan bahwa banyakTiga- kodratinfeksi telah terlewatkan atau tidak terdokumentasi.

Dalam revisi terbaru dariTrichodermabagianpanjang- brakialis[39] semua spesies dari bagian ini, termasuk juga T.

bunga longibrachiatumDanT.jeruk nipis6warna merah muda telah dideskripsikan ulang dan diilustrasikan. Strain klinis yang dilaporkan dalam makalah ini sesuai dengan deskripsi kedua spesies sebagaimana diterima oleh penulis revisi.

Indikasi pertama dariT.bunga longibrachiatumDanT.jeruk- TIDAK6 warna merah mudaadalah pembentukan pigmen difusif kuning dalam kultur, terutama pada agar dekstrosa kentang pada suhu

suhu lebih dari 30 °C dalam kegelapan. Pigmen ini merupakan ciri khas bagianBunga Longibrachiatum. Pada agar tepung jagung dekstrosa atau agar tepung jagung tanpa dekstrosa, konidiofor terbentuk baik di sepanjang miselium udara yang diproduksi sedikit atau dalam jumbai kecil, yang masing-masing berdiameter 1 mm atau kurang. Tidak ada konidiofor yang terpisah, tetapi cabang fertil yang muncul dari dalam jumbai atau di sepanjang hifa udara cenderung menghasilkan phialida secara tunggal di belakang ujung cabang fertil. Phialida cenderung berbentuk silinder atau agak bengkak di bagian tengah, tetapi tidak pernah berbentuk subglobose. Konidia berbentuk lonjong hingga elipsoidal, halus, massanya berwarna hijau tua, dan berukuran 3·5–4·5Bahasa Indonesia:2·3–3·0MM.Trichoderma citrino6warna merah mudaDanT. bunga longibrachiatumsecara morfologis mirip, perbedaan utamanya adalah konidiofor bercabang lebih rapat dan konidia agak lebih kecil (3·0–5·0Bahasa Indonesia:2·0–

2·8Mm) dari T.jeruk nipis6warna merah mudaKonidia tidak pernah berbentuk bulat atau subbulat, atau berkutil seperti padaT.6warna merah mudaKonidiofor dariT.koningicenderung lebih bercabang dan phialides dipegang dalam lingkaran tiga atau lebih. Selain itu, kulturT.koningihanya tumbuh buruk pada suhu 30 °C dan tidak tumbuh pada suhu 40 °C, seperti yang terjadi padaT. bunga longibrachiatumDanT.jeruk nipis6warna merah muda.

Sejak penelitian molekuler ini dilakukan, beberapa penelitian klinis lainnya Trichoderma isolat dikirim ke Pusat Referensi Nasional Mikosis dan Obat Antijamur (CNRMA) di Institut Pasteur untuk identifikasi dan produksi antifongigram agen penyebab. Yang pertama (IP-93·1282) diisolasi dari pencucian bronkoalveolar pada penerima sumsum tulang berusia 2 bulan yang ditandai dengan splenomegali myeloid. Yang kedua (IP-93·1792), diperoleh dari kateter turunan

serebrospinal, cairannya sendiri tetap steril. Yang ketiga diisolasi dari sinus maksilaris yang terinfeksi (IP-94·1510), dan yang terbaru (IP-97·0711) dari cairan chylothorax. Keempat strain tersebut merupakan tipikal T . bunga longibrachiatum .

Studi molekuler saat ini menunjukkan bahwa PCRfingerprinting dapat digunakan untuk identifikasi cepat penyakit klinis.

Trichoderma

mengisolasi hingga tingkat spesies dengan membandingkannya dengan pola spesifik spesies dari strain referensi (misalnya strain tipe ex). Selain itu, karena pola spesifik strain, metode ini juga dapat diterapkan untuk identifikasi strain dan studi epidemiologi. Potensi sidik jari PCR untuk identifikasi strain dan spesies telah ditunjukkan juga dengan patogen jamur yang terkenal seperti

Kandida albicans

[46] atau

Kriptokokus neoformans

[47].

Sebagai kesimpulan, kedua hal tersebutTrichodermajenis,T.panjang - brakialis, khususnya, danT.jeruk nipis6warna merah mudasekarang harus ditambahkan ke daftar yang sudah sangat panjang dari jamur patogen dan oportunistik manusia [48].

(8)

Ucapan Terima Kasih 17 Bissett J. Sebuah revisi dari genusTrichodermaIV. Catatan tambahan pada bagianBunga Longibrachiatum.Bisakah J BotTahun 1991;69:tahun 2418–2420.

18 Samuels GJ.Trichoderma: tinjauan biologi dan sistematika dari genus.Res Mikoltahun 1996;100:923–935.

19 Stasz TE, Nixon K, Harman GE, Weeden NF, Kuter GA.

Evaluasi spesies fenetik dan hubungan filogenetik dalam genusTrichodermadengan analisis kladistik polimorfisme isozim.jamurTahun 1989;81:391–403.

Samuels GJ, Petrini O, Manguin S. Karakterisasi morfologi dan makromolekulHipokrea schweinitziidan itu Trichoderma anamorf.jamurTahun 1994;86:421–435. Leuchtmann A, Petrini O, Samuels GJ. Subkelompok isozim di Trichodermabagian Bunga Longibrachiatum.jamurtahun 1996;88: 384–394.

22 Meyer W, Morawetz R, Börner T, Kubicek CP. Penggunaan Analisis sidik jari DNA dalam klasifikasi beberapa spesies Trichodermaagregat.Arus GenTahun 1992;21 tahun:27–30. 23 Morawetz R, Gruber F, Messner R, Kubicek CP. Kehadiran,

transkripsi dan translasi gen selobiohidrolase di beberapa Trichodermajenis.Arus GenTahun 1992;21 tahun:31–36. González R, Ramón D, Pérez-González JA. Kloning, analisis sekuens dan ekspresi ragi darimisalnya1 gen dariTriko- kulit panjang brakialis.

Aplikasi Mikrobiol BioteknologiTahun 1992;38: 370–375.

Meyer RJ. DNA Mitokondria dan Plasmid sebagai karakteristik taksonomi dalamTrichoderma6warna merah muda.Aplikasi En6besi Mikrobiol Tahun 1991;57:2269–2276.

Herrera-Estrella A, Goldman GH, Van Montagu M, Geremia RA.

Kariotipe elektroforesis dan penugasan gen pada kromosom yang terpecahkanTrichodermaspp.Mol MikrobiolTahun 1993;nomor 7:

515–521.

Zimand G, Valinsky L, Elad Y, Chet I, Manulis S. Penggunaan prosedur RAPD untuk identifikasiTrichodermaketegangan. Res MikolTahun 1994;98:531–534.

28 Fujimori F, Okuda T. Aplikasi poliamida yang diperkuat secara acak DNA morfik menggunakan reaksi berantai polimerase untuk eliminasi strain duplikat secara efisien dalam penyaringan mikroba. I. Jamur. Jurnal Antibiotik Tahun 1994;47:173–182.

Turner D, Kovacs W, Kuhls K, Lieckfeldt E, Peter B, Arisan-Atac I, Strauss J, Samuels GJ, Börner T, Kubicek CP. Biogeografi dan variasi fenotipik diTrichodermasekte. Bunga Longibrachiatum dan terkaitHipokreaspp.Res Mikoltahun 1997; 101:449–459.

Kuhls K, Lieckfeldt E, Börner T. PCR-fingerprinting digunakan untuk perbandingan strain tipe exTrichodermaspesies yang disimpan dalam koleksi kultur yang berbeda.Res MikrobiolTahun 1995;150:363– 371.

31 Kuhls K, Lieckfeldt E, Samuels GJ, Kovacs W, Meyer W, Petrini O, Gams W, Börner T, Kubicek CP. Bukti molekuler bahwa jamur industri aseksualTrichoderma reeseiadalah turunan klonal dari ascomyceteHipokrea jecorina.Proc Natl Acad Sci USAtahun 1996;93:7755–7760.

Kuhls K, Lieckfeldt E, Samuels GJ, Meyer W, Kubicek CP, Börner T. RevisiTrichodermasekte.Bunga Longibrachiatumtermasuk teleomorf terkait berdasarkan analisis urutan pengatur transkripsi internal DNA ribosom.jamurtahun 1997; 89:442–

460.

Gruber F, Visser J, Kubicek CP, de Graaff LH. Pengembangan sistem transformasi heterolog untuk jamur selulolitik Trichoderma reeseiberdasarkan padapirG-strain mutan negatif.Arus GenTahun 1990;18:71–76.

Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada J. Müller (Berlin) atas bantuan teknis dalam pengurutan dengan sequencer otomatis. Pekerjaan ini didukung oleh hibah (LI 627/1-2) dari Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bonn, Jerman kepada EL

Referensi

20

1 Chet I. Trichoderma—aplikasi, cara kerja, dan potensi sebagai agen pengendali hayati jamur patogen tanaman yang hidup di tanah. Dalam: Chet I, ed.Tidak tahu6ati6Pendekatan Pengendalian Penyakit Tanaman, edisi ke-1, John Wiley & Sons, New York, 1987;

137–160. Eveleigh DH. Trichoderma. Dalam: Demain AL, Solomon NA, eds. Biologi Mikroorganisme Industri, edisi ke-1, The Benjamin Cummings Publ. Co. Ltd, London, Amsterdam, Tokyo, 1985; 487–

509.

Muthumeenakshi S, Mills PR, Brown AE, Seaby DA. Variasi molekuler intraspesifik di antaraTrichoderma harzianum mengisolasi kolonisasi kompos jamur di Kepulauan Inggris.

Mikrobiologi Tahun 1994;140:769–777.

Gravesen S, Frisvad JC, Samson RA, penyunting.Mikrojamur. edisi ke-1.

Kopenhagen: Munksgaard, 1994: 150–1.

Larsen FO, Clementsen P, Hansen M, Maltbaek N, Gravesen S, Stahl Skov P, Norn S. Jamur mikro dalam ruanganTrichoderma 6warna merah mudameningkatkan pelepasan histamin dari sel bronkoalveolar manusia.APMIStahun 1996;104:673–679.

Loeppky CB, Sprouse RF, Carlson JV, Everett ED.Triko- kulit6warna merah mudaradang selaput perut.Mediterania Selatan JTahun 1983;76 tahun:798–799. Ragnaud JM, Marceau C, Roche-Bezian MC, Wone C.

Infeksi péritonéale àTrichoderma koningiisur dialyse péritonéale lanjutkan ambulatoire.Méd Malad InfectTahun 1984;7/nomor 8:402–

405. Tanis BC, Van den Pijl H, Van Ostrup ML, Kibbehaar RE, Chang PC.

Peritonitis jamur yang fatal olehTrichoderma longi- brakialis mempersulit dialisis peritoneal.Transplantasi Dial NephrolTahun 1995;

10:114–116.

Jacobs F, Byl B, Bourgeois N, Coremans-Pelseneer J, Florquin S, Depré G, Van de Stadt J, Adler M, Gelin M, Thys JP. Trichoderma6 warna merah mudainfeksi pada penerima transplantasi hati.

MikosisTahun 1992;35:301–303.

Gautheret A, Dromer F, Bourhis JH, Andremont A.Triko- Derma pseudokoningiisebagai penyebab infeksi fatal pada penerima transplantasi sumsum tulang.Klinik Infeksi DisTahun 1995;20 tahun:

1063– 1064.

11 Seguin P, Degeilh B, Grulois I, Gacouin A, Maugendre S, Dufour T, Dupont B, Camus C. Pengobatan abses otak yang berhasil karenaTrichoderma longibrachiatumsetelah reseksi bedah.Jurnal Eur Clin Mikrobiol Infeksi DisTahun 1995;14:445–448.

Munoz FM, Demmler GJ, Travis WR, Ogden AK, Rossmann SN, Rinaldi MG.Trichoderma longibrachiatuminfeksi pada pasien anak dengan anemia aplastik.Jurnal Klinis Mikrobiologitahun 1997; 35:

499–503.

13 Rifai MA. Revisi dari genusTrichoderma.Makalah Mycol

Tahun 1969;116:1–56.

14 Bissett J. Sebuah revisi dari genusTrichoderma. I. Bagian Bunga Longibrachiatumbagian nov.Bisakah J BotTahun 1984;62:924–

931. Bissett J. Sebuah revisi dari genusTrichodermaII. Klasifikasi infragenerik.Bisakah J BotTahun 1991;69:2357–2372.

16 Bissett J. Sebuah revisi dari genusTrichodermaIII. Bagian Pakibasium.Bisakah J BotTahun 1991;69:2373–2417.

21

2

3

24

4

5 25

26 6

7 27

8

9 29

10

30

12

32

15 33

(9)

34 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, ed.Kloning Molekuler: Sebuah Manual LaboratoriumJakarta: Yayasan Pendidikan Indonesia, 1989.

35 Vilgalys R, Hester M. Identifikasi dan pemetaan genetika yang cepat dari DNA ribosom yang diperkuat secara enzimatik dari beberapaMenangis- tokokusjenis.Jurnal BakteriolTahun 1990;172:4238–4246.

36. Suhartoyo D.Analisis Filogenetik Menggunakan Parsimoni(PAPUA

3.1.1)., Survei Sejarah Alam Illinois, Champaign, IL, AS, 1993.

Felsenstein J. Batasan keyakinan pada filogeni: Suatu pendekatan menggunakan bootstrap.Bahasa Inggris6solusiTahun 1985;39:783–791.

38 Kuhls K.Penggunaan dan Penilaian DNA-Analis

Metode Taksonomi Zur Lösung-Fragestel Filogenetik- lungen Bei Filamentösen Pilzen Am Beispiel Der Gattung Tricho- kulit, edisi pertama. Berlin: VWF-Verlag für Wissenschaft dan Forschung, 1997.

39 Samuels GJ, Petrini O, Kuhls K, Lieckfeldt E, Kubicek CP.

ItuHipokrea schweinitziikompleks danTrichodermasekte.Panjang- bunga lili.Pejantan Mikoltahun 1998;41:1–54.

Hogan LH, Klein BS, Levitz SM. Faktor virulensi jamur yang penting secara medis.Mikrobiologi Klinik6tahun 1996;9:469–488. 41 Nevelainen H, Suominen P, Taimisto K. Tentang keamanan

Trichoderma reesei.Jurnal BioteknologiTahun 1994;37:193–200.

Hjortkjaer RK, Bille-Hansen V, Hazelden KP, McConville M, McGregor DB, Cuthbert JA, Greennough RJ, Chapman E, Gardner JR, Ashby R. Evaluasi keamanan Celluclast, asam

selulase berasal dariTrichoderma reesei.Fd Kimia Toksikol Tahun 1986;

24 tahun:55–63.

Brückner H, Graf H, Bokel M. Paracelsin: karakterisasi dengan spektroskopi NMR dan dikroisme sirkuler, dan sifat hemolitik antibiotik peptaibol dari jamur aktif selulolitikTrichoderma reeseiBagian B.PengalamanTahun 1984;40: 1189–1197.

Taylor A. Beberapa aspek kimia dan biologi genusHipokreadan anamorfiknya,TrichodermaDanGliokla- jam.Nomor Prosedur6 sebuah Institut Sains ScotiaTahun 1986;36:27–58.

Ritieni A, Fogliano V, Nanno D, Randazzo G, Altomare C, Perrone G, Bottalico A, Maddau L, Marras F. Paracelsin E, peptaibol baru dari Trichoderma saturnisporum.J Nat Prod Tahun 1995;58:Tahun 1745–1748.

Thanos M, Schönian G, Meyer W, Schweynoch C, Gräser Y, Mitchell TG, Presber W, Tietz HJ. Identifikasi cepat Kandida spesies melalui sidik jari DNA dengan PCR.Jurnal Klinis Mikrobiologitahun 1996;34:615–621.

Meyer W, Mitchell TG, Freedman EZ, Vilgalys R. Probe hibridisasi untuk sidik jari DNA konvensional digunakan sebagai primer tunggal dalam reaksi berantai polimerase untuk membedakan strainKriptokokus neoformans.

Jurnal Klinis MikrobiologiTahun 1993;31. halaman 31tahun 2274–2280.

de Hoog GS. Penilaian risiko jamur yang dilaporkan dari manusia dan hewan.Mikosistahun 1996;39:407–417.

43

44 37

45

46

40 47

42 48