LAPORAN PENELITIAN
PENELITIAN PENGEMBANGAN IPTEK (PPI)
IDENTIFIKASI GEN RESEPTOR PPARγ PADA TIKUS DIABETES MELLITUS TIPE 2 YANG DIBERI SUPLEMENTASI PREBIOTIK
Tim Pengusul
Hanifah Rahmi, S.Si, M.Biomed (Ketua) (0326098603) Lusi Putri Dwita, M.Si., Apt (Anggota) (0321028801)
Nomor Surat Kontrak Penelitian : 210/F.03.07/2019 Nilai Kontrak : Rp. 12.000.000
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA JAKARTA
2019
ii
iii
iv
v ABSTRAK
Diabetes Mellitus Tipe 2 merupakan penyakit hiperglikemia akibat insensivitas sel terhadap insulin. Pada DM tipe 2 terjadi disbiosis mikrobiota usus, yang akan menyebabkan chronic systemic low grade inflammation yang mendasari gangguan metabolik. Salah satu gangguan metabolik yaitu terganggu reseptor PPAR gamma dalam menjalankan perannya dalam metabolisme lipid. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi gen PPAR gamma pada hati tikus Diabetes Mellitus Tipe 2 yang diberi suplementasi xilooligosakarida (XOS). Metode yang digunakan adalah isolasi RNA, reverse transcriptase PCR dan dianalisis secara kualitatif dengan elektroforesis agarosa. Hasil penelitian menunjukkan persentase pencegahan peningkatan kadar pada kelompok dosis 200 mg minggu ke-8 sebagai berikut:
glukosa darah sebesar 25,28%, trigliserida 31,85%, kolesterol total 21,44%, dan LDL 25,77%. Konsentrasi RNA rerata sebesar 2831.6 ug/mL dengan tingkat kemurnian rerata sebesar 1.88. Hasil isolasi RNA dilanjutkan dengan sintesis cDNA, sebelum dilakukan amplifikasi dengan metode PCR. Analisis data dilakukan secara kualitatif menggunakan teknik elektroforesis agarosa. Visualisasi hasil berupa pita dengan ukuran 78 bp.
DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN ... ii
SURAT KONTRAK PENELITIAN... iii
ABSTRAK ... v
DAFTAR ISI ... 1
DAFTAR GAMBAR ... 2 BAB 1. PENDAHULUAN ...
1.1 Latar Belakang ...
1.2 Rumusan Masalah ...
1.3 Tujuan Penelitian ...
1.4 Urgensi Penelitian ...
BAB 2. KAJIAN PUSTAKA ...
BAB 3. METODE PENELITIAN ...
3.1 Alat Penelitian ...
3.2 Bahan Penelitian ...
3.3 Prosedur Penelitian ...
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ...
BAB 5. SIMPULAN DAN SARAN ...
DAFTAR PUSTAKA ...
LAMPIRAN ...
1. Luaran Penelitian ...
2. Biodata Ketua dan Anggota ...
3. Surat Pernyataan Ketua Pengusul ...
3 3 5 5 5 6 8 8 8 8 13 15 17 19 19 20 24
2 DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hasil Identifikasi Uji Kualitatif Metode KLT ... 18 Gambar 2. Identifikasi PPARγ pada Liver Tikus Diabetes Mellitus Tipe 2 .... 20
3 BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) (2016) memperkirakan bahwa jumlah penderita diabetes akan meningkat dari 171 juta pada tahun 2000 menjadi 366 juta pada tahun 2030; terutama di negara-negara berkembang. Diabetes Mellitus Tipe 2 (DMT2), yakni diabetes dengan resistensi insulin dan atau gangguan sekresi insulin, menyumbang 90-95% dari semua kasus diabetes (American Diabetes Association, 2014). Diabetes mellitus tipe 2 termasuk masalah kesehatan yang tinggi di Indonesia (Widyahening, Graaf, Soewondo, & Glasziou, 2014). Hasil survey Kementerian Kesehatan Indonesia (RISKESDAS) pada tahun 2007 menemukan bahwa prevalensi diabetes di Indonesia adalah sekitar 6%, jumlah ini setara dengan lebih dari 12 juta penduduk Indonesia.
Kebanyakan pasien DMT2 mengalami obesitas, dan sebaliknya, obesitas juga dapat menyebabkan resistensi insulin. Meskipun beberapa pasien diabetes memiliki berat badan normal, namun terdapat peningkatan lemak tubuh terutama di daerah perut (American Diabetes Association, 2014). Penyebab obesitas dan DMT2 pada dasarnya karena ketidakseimbangan nutrisi yang dikonsumsi oleh seseorang, kelebihan kalori dan lemak dalam jangka panjang dan kurangnya serat.
Ketidakseimbangan diet ini bisa mengakibatkan dysbiosis, yang ditandai dengan perubahan dalam komposisi mikrobiota, perubahan aktivitas metabolisme bakteri dan/atau perubahan distribusi mikrobiota usus (Delzenne, Neyrinck, & Cani, 2013).
Mikrobiota usus memainkan peran penting dalam peningkatan imunitas, ekstraksi energi dari makanan, fermentasi serat makanan untuk menghasilkan (Short Chain Fatty Acid) SCFA, perubahan metabolisme asam lemak dan glukosa, pengaturan permeabilitas usus, produksi vitamin dan peningkatan penyerapan mineral pada manusia (Kellow, Coughlan, & Reid, 2014). Penelitian menunjukkan pada pasien DMT2 terjadi peningkatan bakteri patogen oportunistik, seperti Bacteroides caccae, Clostridium hathewayi, Clostridium ramosum, Clostridium symbiosum, Eggerthella lenta dan Escherichia coli, serta terjadi penurunan beberapa jenis bakteri penghasil butirat (Lactobacillus dan bifidobacter) (Lau, Carvalho, Pina-vaz, Barbosa, & Freitas, 2015). Salah satu upaya peningkatan
4
proliferasi mikroorganisme produsen butirat adalah melalui pemberian prebiotik, yang telah banyak diketahui memiliki efek positif terhadap kesehatan dan berdampak baik pada fungsi gastrointestinal (Kellow et al. 2014; Devaraj et al.
2013).
PPARγ (peroxisome proliferator–activated receptor-γ) merupakan faktor transkripsi yang diaktifkan oleh ligan. Faktor transkripsi ini berperan terhadap fungsi homeostasis usus serta meregulasi gen yang terlibat pada metabolisme lipid dan glukosa. Pada kondisi DMT2, aktifasi PPARγ dengan pemberian senyawa agonis seperti thiazolidenediones dapat meningkatkan sensitifitas jaringan otot, hati, dan jaringan adiposa terhadap aktifitas hormon insulin (Bermudez et al., 2010).
Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan perlakuan pemberian prebiotik pada hewan coba diabetes mellitus tipe 2. Berdasarkan hasil penelitian Dwita LP &
Rahmi H (2018), membuktikan bahwa pemberian XOS (xylo-oligosakarida) dapat mencegah peningkatan gula darah dan kadar kolesterol total. Hasil tersebut sejalan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh (Majd, Tabandeh, Shahriari, &
Soleimani, 2018), suplementasi Okra secara signifikan mampu menurunkan kolesterol total, trigliserida, serta homeostasis resistensi insulin. Ekspresi gen PPARγ meningkat pada kelompok tikus yang mengalami diabetes dan secara signifikan ekspresi PPARγ menurun setelah tikus diabetes diberi suplementasi Okra (Majd et al., 2018). Pada penelitian ini suplementasi yang diberikan adalah prebiotik XOS.
Prebiotik merupakan komponen makanan yang tidak tercerna, yang dapat merangsang pertumbuhan mikroorganisme untuk tujuan meningkatkan fungsi pencernaan (Elizabeth, Loo, & George, 2003). Xylo-oligosakarida telah diteliti sebagai prebiotik yang mampu secara signifikan meningkatkan bifidobacterial usus dengan konsumsi relatif rendah (2.8 g per hari) (Slavin, 2013). Hasil penelitian menunjukkan bahwa makanan tinggi lemak dapat meningkatkan lipopolisakarida (LPS) plasma (endotoksemia metabolik), dimana akan berdampak pada peningkatkan berat badan, gula darah puasa dan inflamasi. Ini adalah salah satu mekanisme yang menjelaskan hubungan antara mikrobiota usus, regulasi penyimpanan lemak dan perkembangan obesitas serta DMT2 (Lau et al., 2015).
Intervensi prebiotik telah terbukti dapat menunda timbulnya penyakit ini.
5
Suplementasi oligofructose, yang meningkatkan jumlah Bifidobacteria, dapat mengurangi LPS plasma dan sitokin proinflamasi di jaringan adiposa (Cani et al., 2007). Penelitian lain juga menunjukkan bahwa suplementasi prebiotik selama 5 minggu bisa menurunkan kadar HbA1c dan LPS plasma secara signifikan pada pasien DMT2 (Kellow et al. 2014). Hasil penelitian menunjukkan hewan yang diinduksi obesitas dan DMT2 mengalami penurunan Bifidobacteria dan peningkatan bilophila secara signifikan (Everard et al., 2011).
Pengembangan prebiotik sebagai suplement untuk penunjang kesehatan pasien DMT2 masih belum cukup berkembang di Indonesia. Oleh karena itu, dalam penelitian ini akan dilakukan uji potensi prebiotik XOS untuk mengetahui ekspresi gen PPARγ pada kondisi diabetes mellitus tipe 2.
1.2 Perumusan Masalah
Diabetes mellitus tipe 2 termasuk salah satu penyakit penyebab kematian yang tinggi di Indonesia. Intervensi dini sangat penting untuk menunda perkembangan penyakit ini. Salah satu cara untuk melakukannya adalah dengan pendekatan gizi.
Suplementasi prebiotik bermanfaat merangsang pertumbuhan mikrobiota usus yang mempengaruhi respon PPARγ terhadap regulasi metabolisme glukosa dan lipid pada kondisi diabetes mellitus tipe 2.
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek pemberian prebiotik terhadap pencegahan penurunan sensitivitas insulin tikus yang diinduksi diabetes mellitus tipe 2 dilihat dari ekspresi PPARγ di jaringan hati.
1.4 Urgensi Penelitian
Meskipun telah dilakukan penelitian mengenai efek prebiotik terhadap diabetes, namun belum ditemukan dampak perubahan komposisi bakteri tersebut pada kondisi diabetes mellitus tipe 2. XOS berpontesi untuk dikembangkan sebagai produk prebiotik untuk mencegah diabetes mellitus tipe 2.
6 BAB II
KAJIAN PUSTAKA
2.1 Diabetes Mellitus
Diabetes mellitus (DM) adalah sekelompok gangguan metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein yang dikarenakan adanya kelainan pada sekresi insulin, kerja insulin (sensitivitas) atau keduanya (Dipiro et al 2014). Diabetes mellitus yang ditandai dengan hiperglikemia dapat menyebabkan komplikasi seperti retinopati, neuropati, nefropati dan penyakit jantung (Hsieh et al 2010).Jenis DM yang dapat diatasi dengan antidiabetik oral adalah DM tipe 2, yaitu DM yang diakibatkan oleh penurunan respon biologi terhadap insulin. Hal ini disebut dengan resistensi insulin di mana terjadi defisiensi insulin relatif (Aravind & Sridevi, 2017).
Timbulnya DM tipe 2 dikaitkan akibat dari diet gaya barat, meningkatnya obesitas, gaya hidup dan peningkatan populasi minoritas. DM tipe 2 ditandai dengan kombinasi beberapa tingkat resistensi insulin dan relatif kurangnya sekresi insulin (yang cukup untuk menormalkan kadar glukosa plasma) dari waktu ke waktu. Kebanyakan individu dengan DM tipe 2 menunjukkan obesitas perut, yang dengan sendirinya menyebabkan resistensi insulin. Selain itu, hipertensi, dislipidemia dan peningkatan tingkat plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) yang berkontribusi pada keadaan hiperkoagulasi dan sering hadir dalam pasien DM (DiPiro 2014). Penderita DM tipe dua biasanya mengalami lesu, poliuria, nokturia dan polidipsia serta penurunan berat badan secara signifikan yang lebih sering terjadi pada pasien kelebihan berat badan atau obesitas (DiPiro 2015). Diabetes tipe 2 memiliki kecenderungan genetik yang kuat dan lebih sering terjadi pada semua kelompok etnis selain yang dari keturunan Eropa (DiPiro 2014).
2.2 Hasil Pencapaian
Penyebab diabetes mellitus tipe 2 (DMT2) pada dasarnya karena ketidakseimbangan nutrisi yang dikonsumsi oleh seseorang, kelebihan kalori dan lemak dalam jangka panjang dan kurangnya serat. Ketidakseimbangan diet ini bisa mengakibatkan dysbiosis, yang ditandai dengan perubahan dalam komposisi
7
mikrobiota, perubahan aktivitas metabolisme bakteri dan/atau perubahan distribusi mikrobiota usus (Delzenne, Neyrinck, and Cani 2013).
Penelitian terdahulu dilakukan pemberian XOS dapat mencegah peningkatan gula darah pada hewan yang diinduksi STZ. Kelompok yang diberikan XOS 2 g/kg bb dapat mencegah kenaikan gula darah tertinggi yaitu 57.84 % lebih rendah dibandingkan kontrol diabetes, diikuti oleh kelompok XOS 1g/kg dan 0.5 g/kg. Selain itu, kadar kolesterol hewan uji yang diberikan XOS 2 g/kg menunjukkan perbedaan signifikan (p<0.05) dibandingkan kontrol diabetes. Hal ini menunjukkan pemberian XOS dapat mencegah peningkatan kadar kolesterol hewan. (Dwita & Rahmi, 2018).
Roadmap Penelitian Penelitian terdahulu (2018)
Penelitian yang akan dilakukan (2019)
Penelitian tindak lanjut (2020)
Tahap Hilir (tahap lanjut)
Tahap Pengemb angan Tahap inisisasi
Pengujian pemberian prebiotik dari sumber alami terhadap DMT2 dan pengamatan histologi pangkreas (Publikasi Jurnal Internasional)
Pemberian XOS 4g/hari dapat menurunkan glukosa darah, LDL, dan total kolesterol pada tikus DMT2 (Publikasi Jurnal Nasional)
Pengujian lebih lanjut terhadap parameter molekular terkait sensitifitas insulin dijaringan melalui
pengukuran PPARγ (Publikasi Jurnal Nasional)
8 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimentatif di dalam laboratorium dengan memanfaatkan teknologi terkini menggunakan alat qPCR.
Selain menggunakan alat penunjang penelitian, bahan dan prosedur yang digunakan juga disiapkan sesuai kebutuhan metode tersebut.
3.1 Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain adalah kandang hewan uji yang dilengkapi tempat pakan dan minum, timbangan hewan, timbangan analitik, sonde oral, labu ukur, mikropipet Eppendorf, mikrotube, tip, vorteks, mesin real time PCR, elektroforesis, sentrifus, dan tissue homogenizer.
3.2 Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain adalah tikus Sprague Dawley sebagai hewan uji, pakan hewan uji, streptozotocin, xylo- oligosakarida (xos) sintetis, phosphate buffer saline (PBS), FastKing RT kit, dapar TAE, agarosa, gelred, dan Superscript III Supermix kit.
3.3 Prosedur Penelitian Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan (Ratus novergicus) strain Sparague Dawley umur 2-3 bulan dengan berat badan 200 – 250 gram sebanyak 30 ekor yang diperoleh dari peternakan tikus di Bogor. Hewan uji di determinasi di Laboratorium Peternakan Hewan Insitut Pertanian Bogor.
Uji Etik
Hewan uji sudah lolos kaji etik dari penelitian sebelumnya oleh Komite Etik Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia dengan nomor 119/UN2.FI/ETIK/2018.
9 Determinasi Tanaman
Tanaman jagung di determinasi untuk mengidentifikasi jenis dan memastikan kebenaran tanaman jagung dilakukan di Balai Penelitian dan Pengembangan Botani (Herbarium Bogoriense) LIPI, Bogor.
Pembuatan XOS dari Bonggol Jagung
Untuk mendapatkan XOS menggunakan bonggol jagung manis dengan umur panis ±85 hari. Pisahkan bonggol jagung dari bulir-bulir jagung lalu keringkan bonggol jagung dengan sinar matahari sampai mengering, setelah kering potong bonggol jagung kecil-kecil haluskan dan ayak dengan mesh No. 40. Kemudian serbuk bonggol jagung rendamlah dengan NaOCl 0,5% selama 24 jam (proses delignifikasi) pada suhu 25-30°C. Kemudian bilas menggunakan aquadest dan saring untuk mendapatkan serbuk bonggol jagung tersebut. Serbuk bonggol jagung yang telah didelignifikasi kemudian rendamlah dengan KOH 10% (b/v) selama 1 jam pada suhu 100°C dan sesuaikan pH dengan menambahkan H2SO4 5%.
Selanjutnya sentrifuse selama 30 menit dengan kecepatan 4000 rpm untuk memisahkan padatan dan cairan. Dari proses sentrifuse yang ambil hanya bagian padatan saja, dikarenakan bagian padatannyalah yang mengandung xylan. Bilas padatan menggunakan aquadest kemudian saring dengan menggunakan kertas saring whatmann no. 4. Keringkan hasil penyaringan menggunakan oven pada suhu 80°C selama 48 jam. Setelah semua proses dilakukan maka akan terbentuk filtrat yang mengandung gula pereduksi (xylose dan XOS) (Boonchuay 2014).
Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian menggunakan rancangan acak kelompok dengan enam kelompok perlakuan, sehingga penentuan jumlah tikus tiap kelompok, dihitung berdasarkan rumus federer :
(t-1) (n-1) ≥ 15... (2) (6-1) (n-1) ≥ 15
5 (n-1) ≥ 30 5n ≥ 20 n ≥ 4
10 Keterangan :
t = jumlah kelompok percobaan, n = jumlah hewan yang dipakai
Jumlah minimum tikus dalam tiap kelompok adalah 4 ekor. Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 ekor yang dibagi menjadi 6 kelompok yang terdiri dari 5 ekor.
Pembuatan Sediaan Uji Pembuatan Pakan Hiperlipid
Menurut jurnal Majd et al (2018) pemberian pakan hiperlipid dengan komposisi pakan standar 65% dan lemak sapi 35% mampu menaikkan kadar lipid selama 4 minggu. Bahan yang digunakan adalah pakan standar sebanyak 65% dam lemak sapi 35%. Lemak sapi dibuat dengan merebusnya hingga mencair, pakan standar dihancurkan. Semua bahan dicampurkan hingga homogen seperti adonan kemudian digiling dan dikeringkan.
Perlakuan Terhadap Hewan Uji
Selama 7 hari tiga puluh ekor tikus putih jantan hingga mencapai bobot 200 g – 250 g. Hewan uji dikelompokkan menjadi 3 kelompok dengan masing - masing kelompok terdiri dari 10 ekor tikus yang terdiri dari kelompok kontrol positif, kelompok kontrol negatif, kelompok normal. Selanjutnya hewan uji diberi XOS selama 2 minggu. Setelah 2 minggu dilakukan induksi dengan STZ melalui intra peritoneal (i.p) dosis 35 mg/kgBB. Hewan uji diistirahatkan selama 5 hari. Setelah 5 hari dilakukan pembedahan untuk mengambil organ Jaringan hati dan dilakukan uji untuk melakukan pengamatan.
Ekstraksi dan Isolasi RNA
Homogenat jaringan diresuspensi dengan PBS sebanyak 200 μL. Suspensi jaringan ditambahkan 400 μL bufer lisis dan divortex selama 15 detik. Suspensi sel dipipet ke dalam tube filter, kemudian tube filter yang berisi suspensi sel disentrifus pada kecepatan 8000 xg selama 15 detik. Cairan yang tertampung pada tube koleksi dibuang. Sebanyak 100 μL Dnase I ditambahkan ke dalam tube filter, kemudian tube filter diinkubasi selama 15 menit pada suhu 18 derajat Celcius (Roche 2011).
11
Larutan bufer pencuci I ditambahkan ke dalam tube sebanyak 500 μL dan disentrifuse pada kecepatan 8000 xg selama 15 detik. Cairan yang mengalir ke dalam tube koleksi dibuang. Larutan bufer pencuci II ditambahkan ke dalam tube sebanyak 500 μL dan disentrifuse pada kecepatan 13000 xg selama 2 menit. Cairan yang mengalir ke dalam tube koleksi dibuang. Larutan bufer elusi ditambahkan sebanyak 100 μL dan disentrifuse pada kecepatan 8000 xg selama 1 menit. Tabung mikro mengandung RNA, lalu aliquot menjadi 4 bagian. Sampel RNA dapat disimpan dalam lemari pendingin suhu -80 ᴼC (Roche 2011).
Sintesis cDNA
Langkah pertama mencairkan RNA template di atas es. Mencairkan solusi primer, Campuran 10x RT (termasuk RNasin dan DTT), dNTP Super murni (masing-masing 2,5 mM), dan ddH2O RNase-Free pada suhu kamar (15-25°C).
Letakkan di atas es segera setelah pencairan. Campur setiap larutan dengan vortex, dan centrifuge sebentar untuk mengumpulkan cairan residu dari sisi tabung.
Langkah kedua siapkan master mix (Campuran 10xR, dNTPs Sangat murni (setiap 2.5 mM), Oligo(dT)15 atau acak (10 μM), Kuantitas Terbalik Transkriptase, RNase-Free ddH2O, Template RNA ditambahkan dengan total volume reaksi 20μL) baru di atas es. Campur, teliti dan hati-hati dengan vortex tidak lebih dari 5 detik. Centrifuge sebentar untuk mengumpulkan sisa cairan dari dinding tabung, dan simpan di atas es. Tambahkan template RNA di langkah keempat. Langkah ketiga Jika menyiapkan lebih dari satu reaksi transkripsi balik, distribusikan volume campuran induk yang sesuai ke dalam tabung reaksi individu. Simpan tabung di atas es. Langkah keempat tambahkan RNA template (50 ng-2 μg) ke masing- masing tabung yang berisi master mix. Aduk rata dan hati-hati dengan vortex tidak lebih dari 5 detik. Centrifuge sebentar untuk mengumpulkan sisa cairan dari dinding tabung. Lalu inkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C. Terakhir tambahkan alikuot dari reaksi transkripsi balik jadi ke campuran PCR. (QuantScript RT Kit Handbook).
12 Elektroforesis Agarosa
Sebanyak 0.9 g agarosa ditimbang untuk dilarutkan dalam bufer TAE sebanyak 60 mL. Larutan tersebut dipanaskan dengan microwave selama 4 menit suhu medium hingga agarosa larut sempurna. Larutan agarosa ditambahkan etidium bromida jika suhu larutan sudah hangat sekitar 60ᴼC. Larutan agar dituang ke dalam cetakan elektroforesis dan dibiarkan agar mengeras. Aplikasi sampel dan marker ke dalam sumur agar, kemudian jalankan elektroforesis pada 100 volt selama 30 menit (FKUI, 2001).
RT PCR
Analisis ekspresi gen dengan RT-PCR menggunakan Superscript III Supermix (Life Technologies, 2010). Reaksi RT-PCR melibatkan bufer PCR, MgCl2, dNTP, Taq DNA Polimerase, reverse transcriptase, serta primer.
RT PCR cycle : 1. Sintesis cDNA
1 cycle 55⁰C 30 menit
2. Denaturasi
1 cycle 94⁰C 2 menit
3. PCR amplifikasi
40 cycle 94⁰C 30 menit
55⁰C 30 menit
68⁰C 30 menit
4. Ekstensi Akhir
1 cycle 68⁰C 30 menit
13 BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Determinasi Tanaman dan Hewan
Determinasi merupakan langkah awal dalam penelitian untuk mendapatkan identitas yang benar dari tanaman yang akan diteliti, sehingga dapat memberikan kepastian tentang kebenaran tanaman tersebut. Berdasarkan hasil determinasi dari Pusat Penelitian Biologi LIPI, Bogor. Simplisia yang digunakan adalah benar tanaman jenis Zea mays L dan dilakukan determinasi hewan untuk memastikan jenis hewan yang digunakan dalam penelitian. Hasil determinasi dari
“Laboratorium Mamalogi” Bidang Zoologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI Cibinong menyatakan bahwa hewan yang digunakan adalah tikus putih (Ratus norvegicus) strain Sprague Dawley.
4.2 Identifikasi XOS Bonggol Jagung
Uji identifikasi senyawa XOS bonggol jagung menggunakan pereaksi semprot DAP mengikuti jurnal (Salupi 2014). Adanya bercak yang terdapat pada plat menandakan bahwa sampel yang diuji mengandung xilooligosakarida.
Perbedaan nilai Rf diakibatkan karena masih adanya pengotor pada proses KLT sehingga terdapat perbedaan nilai Rf. Bercak yang dihasilkan berwarna kecoklatan yang dapat terlihat secara visual. Nilai Rf XOS bonggol jagung yang didapatkan sebesar 0,58 tidak sama dengan nilai Rf XOS komersil yang menjadi pembanding yaitu 0,59. Hal ini diduga masih adanya bahan pengotor maupun bahan lain yang masih terkandung didalam XOS bonggol jagung. Tetapi, rentang perbedaan nilai Rf XOS bonggol jagung tidak terlalu berbeda jauh dengan XOS komersil sebagai pembanding.
Gambar 1. Hasil Identifikasi Uji Kualitatif Metode KLT.
Keterangan: (a) XOS Komersil, (b) XOS Bonggol Jagung
14 4.3 Isolasi RNA
Jaringan hati yang diperoleh dari 6 kelompok yang mana masing-masing terdiri atas 4 ekor tikus, semua jaringan terlebih dahulu ditimbang masing-masing 50 mg untuk diisolasi RNA. Hasil isolasi RNA dari hati tikus berupa nilai konsentrasi dan kemurnian yang terdapat pada Tabel 1. Isolasi RNA diukur serapannya pada panjang gelombang 260 nm serta 280 nm. Rumus yang digunakan untuk menghitung kadar RNA adalah :
[RNA] ug/mL = A260nm x 40 ug/mL ...(1)
Tabel 1. Kadar dan kemurnian hasil isolasi RNA.
No Kelompok Kadar (ug/mL) Kemurnian 1 Kontrol
Normal
2756 1.85
2 2896 1.90
3 2842 1.80
4 2798 1.85
5 Konrol Negatif
2678 1.90
6 2766 1.83
7 2687 1.85
8 2789 1.87
9 Kontrol Positif
2876 1.90
10 2868 1.89
11 2878 1.87
12 2884 1.92
13 Dosis 200mg/
200gBb xos
2788 1.88
14 2776 1.91
15 2798 1.88
16 2812 1.90
17 Dosis 300mg/
200gBb xos
2812 1.86
18 2822 1.84
19 2850 1.87
20 2850 1.87
21 Dosis 400mg/
200gBb xos
2889 1.84
22 2984 1.92
23 2890 1.88
24 2966 1.94
Rerata 2831.6 1.88
Berdasarkan nilai kemurnian, hasil isolasi RNA yang diperoleh cukup baik karena memenuhi ketentuan kemurnian asam nukleat yaitu berada dikisaran 1.8-
15
2.0. Nilai kemurnian ini diperoleh dengan mengukur serapan RNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
4.4 Pengaruh Pemberian XOS Bonggol Jagung Terhadap Ekspresi PPARγ pada Liver Tikus
RNA dari masing-masing kelompok tikus digunakan untuk mensintesis cDNA, sehingga dapat dilakukan teknik reverse transcriptase PCR. Primer PPARγ (NM_011146.2) yang digunakan antara lain 5’CTG CTC AAG TAT GGT GTC CAT GA3’(forward) dan 5’TGA GAT GAG GAC TCC ATC TTT ATT CA3’(reverse), dari primer-primer tersebut diperolehlah ukuran pasang basa sebesar 78 bp (pada urutan ke- 1071-1148) jika menggunakan penjajaran pada BLASTn. Hasil PCR diidentifikasi dengan elektroforesis agarosa dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 2. Identifikasi PPARγ pada liver tikus diabetes mellitus tipe 2.
Keterangan : M : Ladder DNA 100 bp, N : Kelompok Normal, K+ : Kelompok pemberian xos komersil, K- : Kelompok pemberian STZ, D1 : Kelompok pemberian xos bonggol jagung 200 mg, D2 : Kelompok pemberian xos bonggol jagung 300 mg, D3 : Kelompok pemberian xos bonggol jagung 400 mg.
Secara kualitatif dapat dilihat tiap kelompok perlakukan teridentifikasi gen PPARγ, namun tidak dapat ditentukan kelompok manakah yang mengalami peningkatan atau penurunan ekspresi gen PPARγ. Berdasarkan literatur, gen PPARγ terdapat pada jaringan hati, pankreas, adiposa, serta mukosa usus (Ferre P 2004).
M N K+ K- D1 D2 D3
M N K+ K- D1 D2 D3
78 bp
78 bp
16 BAB 5
SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan
Prebiotik XOS bonggol jagung yang digunakan secara kualitatif memiliki nilai Rf yang hampir sama dengan XOS komersil yaitu berturut-turut sebesar 0.58 dan 0.59.
Seluruh sampel telah diperoleh RNA murni dan akan dilanjutkan ke tahapan sintesis cDNA serta RT PCR. RNA yang diperoleh memiliki kadar pada kisaran 2687-2984 ug/mL dengan kemurnian pada kisaran 1.8-2.0. Gen Reseptor PPARγ dapat teridentifikasi pada semua kelompok perlakuan dengan ukuran 78 bp.
5.2 Saran
Perlu dilakukan uji kuantitatif XOS bonggol jagung untuk mengetahui kadar yang terkandung didalamnya dan perlunya kombinasi pemakaian dengan prebiotik lain ataupun probiotik sehingga mencapai kontrol normal. Selain itu, perlu dilakukan uji kuantitatif dengan qPCR untuk mengetahui ekspresi gen PPAR gamma pada hati tikus dengan perlakuan yang telah dilakukan.
17 DAFTAR PUSTAKA
American Diabetes Association. (2014). Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 37(January), 81–90. https://doi.org/10.2337/dc14- S081
Aravind, S., & Sridevi, S. (2017). Variations In Hand Grip Strength Among Type- I And Type-II Diabetics, 3(1), 1–8.
Bermudez, V., Finol, F., Parra, N., Parra, M., Perez, A., Penaranda, L., Velasco, M.
(2010). PPAR-gamma agonists and their role in type 2 diabetes mellitus
management. Am J Ther, 17(3), 274–283.
https://doi.org/10.1097/MJT.0b013e3181c08081
Cani, P. D., Neyrinck, A. M., Fava, F., Knauf, C., Burcelin, R. G., Tuohy, K. M.,
… Delzenne, N. M. (2007). Selective increases of bifidobacteria in gut microflora improve high-fat-diet-induced diabetes in mice through a mechanism associated with endotoxaemia. Diabetologia, 50(11), 2374–2383.
https://doi.org/10.1007/s00125-007-0791-0
Delzenne, N. M., Neyrinck, A. M., & Cani, P. D. (2013). Gut microbiota and metabolic disorders : how prebiotic can work ? British Journal of Nutrition.
https://doi.org/10.1017/S0007114512004047
Devaraj, S., Hemarajata, P., & Versalovic, J. (2013). The human gut microbiome and body metabolism: Implications for obesity and diabetes. Clinical Chemistry, 59(4), 617–628. https://doi.org/10.1373/clinchem.2012.187617 Dwita, L. P., & Rahmi, H. (2018). Efek Suplementasi Prebiotik Pada Tikus
Diabetes Mellitus Tipe 2. Laporan Penelitian SIMAKIP 2018. UHAMKA.
Jakarta
Elizabeth, A., Loo, J. Van, & George, C. (2003). Nutritional responses to the presence of inulin and oligofructose in the Diets of Domesticated Animal: A Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43(1), 19–60.
Everard, A., Lazarevic, V., Derrien, M., Girard, M., Muccioli, G. G., Neyrinck, A.
M., … Cani, P. D. (2011). Responses of Gut Microbiota and Glucose and Lipid Metabolism to Prebiotics in Genetic Obese and Diet-Induced Leptin-Resistant Mice, 60(November), 2775–2786. https://doi.org/10.2337/db11-0227
FKUI, B. B. (2001). Biokimia: Eksperimen Laboratorium. Jakarta: EGC Penerbit Buku Kedokteran.
Kellow, N. J., Coughlan, M. T., & Reid, C. M. (2014). Systematic Review Metabolic benefits of dietary prebiotics in human subjects : a systematic review of randomised controlled trials, 1147–1161.
https://doi.org/10.1017/S0007114513003607
Lau, E., Carvalho, D., Pina-vaz, C., Barbosa, J., & Freitas, P. (2015). Beyond gut microbiota : understanding obesity and type 2 diabetes, 14(3), 358–369.
18
Life Technologies, I. (2010). SuperScript TM III One-Step RT-PCR System with Platinum ®. System, (12574), 1–4.
Majd, N. E., Tabandeh, M. R., Shahriari, A., & Soleimani, Z. (2018). Okra (Abelmoscus esculentus) Improved Islets Structure, and Down-Regulated PPARs Gene Expression in Pancreas of High-Fat Diet and Streptozotocin- Induced Diabetic Rats. Cell Journal, 20(1), 31–40.
https://doi.org/10.22074/cellj.2018.4819
Roche. (2011). High Pure miRNA Isolation Kit. Karty Charakterystyki, (1907), 1–
27.
Slavin, J. (2013). Fiber and Prebiotics: Mechanisms and Health Benefits, 1417–
1435. https://doi.org/10.3390/nu5041417
Widyahening, I. S., Graaf, Y. Van Der, Soewondo, P., & Glasziou, P. (2014).
Awareness , agreement , adoption and adherence to type 2 diabetes mellitus guidelines : a survey of Indonesian primary care physicians, 1–8.
Yang, X., Xie, L., Li, Y., & Wei, C. (2009). More than 9,000,000 unique genes in human gut bacterial community: Estimating gene numbers inside a human body. PLoS ONE, 4(6). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006074
Dipiro, Joseph T., et al. 2015. Pharmacotherapy Handbook Ninth Edition.
Columbus: Mc Graw – Hill Company. Hlm 160.
19 Lampiran 1. Luaran Penelitian
20 Lampiran 2. Biodata Ketua dan Anggota
21
22
23
24
