LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOKINETIKA ANALISIS KADAR OBAT DALAM URIN Tanggal Praktikum : 6 Juni 2023 Tanggal Pengumpulan : 13 Juni 2023
OLEH:
Kelompok 5
Fajrin Yudha Pamungkas 320210201007 Kania Khoirunnisa 320210201010 Muhammad Keflin Syahputra 320210201015 Yosephine Nisa Pulalo 320210201026
LABORATORIUM FARMAKOKINETIKA
PROGRAM STUDI SARJANA ILMU FARMASI MILITER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS PERTAHANAN REPUBLIK INDONESIA
2022
I. Tujuan
1. Mahasiswa mampu melakukan penetapan kadar paracetamol dalam urin secara in vivo.
2. Mahasiswa mampu menetapkan parameter farmakokinetika berdasarkan hasil penetapan kadar paracetamol dalam urin.
II. Prinsip percobaan
Percobaan ini menggunakan simulasi model in vivo analisis obat dalam urin manusia dengan memberikan perlakuan dalam lingkungan yang terkendali diluar tubuh organisme. Model simulasi menggunakan alat-alat dan lingkungan yang seakan akan terjadi di dalam tubuh organisme.
III. Pendahuluan
Konsentrasi obat merupakan faktor penting dalam menentukan farmakokinetika individu ataupun populasi. Konsentrasi suatu obat dapat diukur dengan sampel biologis seperti air liur, plasma, urin dan juga air susu. Sensitivitas, akurasi serta akurasi metode analisis harus tersedia untuk mengukur obat secara langsung dengan matriks biologis. Untuk alasan ini, biasanya diperlukan untuk memvalidasi metode uji untuk mendapatkan informasi yang akurat untuk farmakokinetik dan pemantauan klinis (Shargel, 2012).
Parameter farmakokinetika suatu obat dapat diperoleh dari pengukuran kadar obat yang tidak berubah atau metabolitnya dalam cairan tubuh yaitu darah, urin, saliva, ataupun cairan lainnya. Untuk memberikan efek biologis, obat aktif harus berinteraksi cukup tinggi dengan reseptor atau sel target. Untuk mencapai reseptornya, suatu obat harus melalui proses farmakokinetik terlebih dahulu yaitu fasa II dan Fasa III. Fasa II merupakan proses penyerapan molekul obat, yang mengarah pada ketersediaan obat biologis, zat aktif dalam cairan tubuh yang didistribusikan di jaringan dan organ tubuh. Sedangkan Fasa III adalah fase yang melibatkan distribusi, metabolisme, dan ekskresi obat dan menentukan tingkat obat dalam kompartemen di mana reseptor berada.
Urin merupakan hasil pembuangan dari metabolisme tubuh berupa air, ammonia, urea, natrium klorida, asam urat, kreatinin, kalium sulfat dan fosfat yang dikeluarkan melalui ginjal. Umumnya pada keadaan normal urin dikeluarkan sebesar 900-1.500 ml per 24 jam, tetapi dapat bervariasi tergantung asupan cairan yang masuk dan jumlah yang keluar melalui rute lain.
Pengukuran parameter urin meliputi konstanta eliminasi, waktu paruh,
dan klirens. Konstanta eliminasi merupakan Laju eliminasi untuk sebagian obat merupakan suatu proses order kesatu, dimana laju eliminasi bergantung pada jumlah atau konsentrasi obat yang ada. Waktu paruh menyatakan waktu yang diperlukan oleh sejumlah obat atau untuk berkurang menjadi setengahnya.
Klirens yaitu suatu ukuran eliminasi obat dari tubuh tanpa mempermasalahkan mekanisme prosesnya. Eliminasi obat terdiri dari proses metabolisme dan ekskresi. Klirens dapat didefinisikan sebagai volume bersih suatu obat dari tubuh persatuan waktu (mL/menit) atau (L/gr). Maka kurva urin dapat ditunjukan sebagai berikut: (Shargel, 2012).
Dalam menganalisis data urin terdapat faktor-faktor yang dapat mempengaruhi, diantaranya:
1. Suatu fraksi yang bermakna dari obat tidak berubah harus diekskresi dalam urin.
2. Teknik penetapan kadar harus spesifik untuk obat tidak berubah, dan harus tidak dipengaruhi oleh metabolit-metabolit obat yang mempunyai struktur kimia yang serupa.
3. Diperlukan pengambilan cuplikan yang sering untuk mendapatkan gambaran kurva yang baik.
4. Cuplikan hendaknya dikumpulkan secara berkala sampai hampir semua obat diekskresi. Suatu grafik dari kumulatif obat yang diekskresi vs waktu akan menghasilkan kurva yang mendekati
“asimtot” pada waktu yang tak berhingga. Dalam praktek diperlukan kurang lebih 7 t1/2eliminasi untuk mengeliminasi 99%
obat.
5. Perbedaan pH urin dan volume dapat menyebabkan perbedaan laju ekskresi urin yang bermakna.
(Shargelet al., 2005).
IV. Alat dan bahan
● Alat
Tabel 4.1.Gambar alat
Alat Gambar Alat Gambar
Mikropipet Vortex
Sentrifuge dan tabung
Beaker glass
Tabung reaksi Spektrofotom
eter
● Bahan
Tabel 4.2.Gambar bahan
Bahan Gambar
Asam triklorasetat (TCA) 50 %
Natrium nitrit 10 %
Ammonium
sulfamat (amonium amido sulfinat) 0,5%
Paracetamol baku
N(1-naftil)
etilendiamil 0,1%
Es batu
Aquades
V. Metode percobaan A. Penyiapan sampel urin
1. Tetapkan 1 orang volunteer/sukarelawan untuk percobaan ini. Tiga hari sebelum praktikum, volunteer tidak diperbolehkan mengkonsumsi obat sejenis dengan paracetamol atau obat lain yang dapat mengganggu penetapan kadarparacetamol.
2. Volunteer diminta mengumpulkan sampel urin sewaktu sebanyak lebih kurang 300 mL pada wadah yang sudah disediakan, sebelum kegiatan praktikum dan diserahkan kepada laboran.
B. Prosedur analisis sampel urin
1. Ambil 1,0 mL sampel urin yang dikumpulkan pada jam ke-0; 0,25; 1,0; 2,0;
4,0; 6,0; 9,0; dan 12,0 (sampel sudah disiapkan laboran).
2. Masukkan sampel urin ke dalam tabung reaksi, kemudian tambahkan 1,0 mL larutan TCA 10%, segera aduk hingga homogen dengan menggunakan vortex.
3. Jika terdapat endapan, sentrifugasi pada 4000 rpm selama 5 menit. Pindahkan 1,0 mL supernatan yang jernih ke dalam tabung reaksi lain.
4. Tambahkan larutan NaNO2 0.1% (1,0 mL) kedalam tabung tersebut, dan diamkan selama 3 menit.
5. Tambahkan larutan Amonium sulfamat 0,5% (2,0 mL), aduk hingga homogen dan diamkan selama 2 menit.
6. Tambahkan larutan N(1-naftil) etilendiamin 0,1% (2,0 mL). Campur baik-baik, diamkan 5 menit di tempat gelap dan di tempat dingin.
7. Ukur serapannya pada panjang gelombang 545 nm.
8. Lakukan prosedur yang sama terhadap blanko urin
C. Pembuatan larutan stok Paracetamol
Timbang dengan seksama paracetamol baku, dilarutkan dalam NaOH 1N, encerkan dengan aquadest ad 100.0 mL. Encerkan larutan tersebut sehingga diperoleh kadar sulfadiazin 10, 20, 30, 40, dan 50 ppm.
D. Pembuatan kurva kalibrasi
Kedalam aquades ditambahkan larutan stokparacetamolsehingga diperoleh kadar paracetamol: 10, 20, 30, 40, dan 50 ppm, kemudian aduk masing-masing larutan dengan vortex hingga homogen dan reaksikan dengan reagen.
E. Uji perolehan kembali
Buat campuran urin dengan larutan baku paracetamol sehingga diperoleh kadar paracetamol 20 µg/mL, 30 µg/mL dan 50 µg/mL kemudian aduk masing-masing larutan dengan vorteks hingga homogen dan reaksikan dengan reagen. Tetapkan kadar sulfadiazin dalam urin terhadap bakuparacetamol.
VI. Hasil pengamatan
Tabel 7.1 Tabel Kurva Kalibrasi Konsentrasi (ppm) Absorbansi (A)
400 0,648
800 1,288
1200 1,787
1600 2,193
2400 2,519
3000 2,555
Grafik 7.1 Persamaan Regresi Linear
● Nilai absorbansi diambil menggunakan Spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang maksimum Parasetamol sebesar434 nm. Dari data diatas maka didapatkan persamaan regresi linier dengan rumus y = a + bx dan didapatkan kurva regresinya.
● Persamaan regresi linier yang didapat y = 0,0007 x + 0,718, R =² 0,8646dengan nilair = 0,929, a = 0,718, b = 0,0007
SAMPEL URIN
No. t
(min)
Vol Absorba nsi
Cu (mcg/m
L)
Du (mcg)
tMid dt dDu
/dt
lndDu/dt (dDu/dt)’
1 0,25 0,5 1,911 170,428 85,21429 0,25
0,25
3408 ,571
8,134048
42 102,333
2 0,5 0,5 1,924 172,285 86,14286 0,37
5 0,25
3445 ,714
8,144886
42 100,9836
3 1 0,5 1,9165 171,2143 85,60714
0,75 0,5
1712 ,143
7,445501
08 97,427
4 2 0,5 1,81 156 78 1,5 1 780 6,659293 90,7642
92 5 4 0,5 1,0895 53,07143 26,53571
3 2
132, 6786
4,887792
966 82,8378
6 6 0,5 1,056 48,28571 24,14286
5 2
120, 7143
4,793426
6 67,4327
7 9 0,5 0,9655 35,35714 17,67857
7,5 3
58,9 2857
4,076326
03 48,3728
8 12 0,5 0,92 28,85714 14,42857
10,5 3
48,0 9524
3,873183
21 36,6351
Grafik Semilog Analisis Sampel Urin
VII. Perhitungan
VIII. Pembahasan
Praktikum dilakukan pada 06 Juni 2023 yaitu melakukan pengujian farmakokinetika dengan menghitung kadar obat dalam Urin. Tujuan dilaksanakannya praktikum ini adalah menentukan dan menghitung parameter farmakokinetik obat setelah pemberian obat melalui intravena dalam darah atau plasma terhadap waktu.
Sampel yang digunakan sebagai obat dalam percobaan kali adalah paracetamol alasan dipilihnya paracetamol adalah karena paracetamol merupakan obat yang paling umum digunakan oleh masyarakat dan merupakan yang stabil sehingga dapat dibaca kadarnya menggunakan spektrofotometri uv dengan baik. selanjutnya obat akan terdistribusi dalam plasma dan terdistribusi dianggap sebagai sistem 2 kompartemen pemberian iv tunggal, selanjutnya di dalam tubuh obat akan mengalami proses eliminasi-ekskresi melalui urin.
Sebelum mengukur kadar obat Paracetamol dalam plasma darah , terlebih dahulu dibuat kurva kalibrasi dengan perbedaan konsentrasi: 400 ppm; 800 ppm; dan 1200 ppm; 1600 ppm; 2400 ppm;m dan 3000 ppm. kemudian
dilakukan pengukuran absorbansi, dimana Prinsip yang digunakan dalam penentuan konsentrasi parasetamol adalah terbentuknya garam diazonium dari gugus amina aromatik sekunder yang terkandung dalam parasetamol dan terbentuknya garam diazonium pada saat suhu sampel dan reagen 5 °C sampai 15 °C. Setelah absorbansi peroleh kemudian ditentukan persamaan regresi sebesar y = 0,0007 x + 0,718,R = 0,8646² dengan nilair = 929 , a = 0,718, b
= 0,0007, Dalam melakukan percobaan, digunakan sampel urin yang telah disediakan laboran/pengajar yang telah berisi obat parasetamol dengan konsentrasi tertentu dan disimulasikan sebagai sampel yang telah diambil sesuai dengan waktu pengambilan dan konsentrasinya.
Sampel urin umumnya digunakan jika kadar obat dalam darah terlalu kecil untuk dapat dideteksi. selain itu sampel urin juga digunakan apabila eliminasi obat dalam bentuk utuh melalui ginjal cukup besar yaitu lebih dari 40% salah satu keuntungan sampel urin jika digunakan dalam analisis adalah mudah dilakukan karena pengambilan sampelnya lebih mudah daripada pengambilan sampel darah. Selain itu, jumlah sampel yang didapatkan lebih banyak, lama dan selang waktu penampungan urin sesuai dengan karakteristik obat yang akan diuji, dan umumnya tidak mengandung lipid dan protein sehingga mudah untuk diekstraksi menggunakan pelarut organik.
Pada praktikum kali ini, sampel urin diberikan perlakuan seperti sampel darah pada praktikum sebelumnya. Sampel urin ditambahkan beberapa senyawa yang bertujuan untuk memastikan tidak adanya kandungan protein atau apapun yang masih tersisa dalam urin. proses pemisahan dimulai dengan menyiapkan sampel urin yang telah disiapkan oleh laboran, selanjutnya diletakkan Dalam tabung reaksi, setelah itu ditambahkan 50% TCA yang diberikan melalui dinding tabung reaksi. Penggunaan TCA digunakan untuk mencegah aglomerasi dan mendenaturasi protein dalam protein serta membuatnya lebih mudah dipisahkan, dan disingkirkan. Setelah itu dilakukan penambahan HCl dan NaNO2, penambahan HCL dan NaNO2 ini menyebabkan berlangsungnya proses diazotasi. Proses diazotasi terjadi dengan cara NaNO2 bereaksi dengan kation H+TCA dan HCl, Dalam bentuk HNO2, proses diazotasi berguna untuk memperluas gugus kromofor (ikatan rangkap terkonjugasi) sehingga absorbansinya dapat dibaca. Namun, penambahan HNO2 dapat
merusak sampel, sehingga ditambahkan asam sulfat 15% yang terbentuk Gelembung/busa N2 menunjukkan bahwa HNO2 berkurang dan NaOH ditambahkan 10% untuk menetralkan sisa HNO2. Kemudian diamkan selama 3 menit dan setelah itu didinginkan karena panas dihasilkan dalam reaksi diazotasi, sehingga perlu didinginkan terlebih dahulu sebelum diukur menggunakan spektro. Pengukuran penyerapan kemudian dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis
Pengukuran serapan sampel urin pada sampel yang disimulasikan diambil pada rentang waktu jam ke : 0-0,25; 0,25-0,5; 0,5-1; 1-2; 2-4; 4-6; 6-9; dan 9-12 yang dianalisis menggunakan spektrofotometer untuk mendapatkan nilai absorbansi antara lain: 1,911; 1,924; 1,9165; 1,81; 1,0895; 1,056; 0,9655;
dan 0,92 Dari nilai absorbansi tersebut dapat diketahui bahwa semakin lama maka absorbansi yang terbentuk semakin kecil sehingga tercipta grafik seperti dua kompartemen, Berdasarkan pengamatan hasil yang didapatkan pada masing-masing waktu konsentrasi obat dalam urin berturut-turut adalah 170,4286; 172,2857; 171,2143; 156,000; 53,07143; 48,28571; 35,35714;
28,85714 mcg/mL. dan Du/dt sebesar: 3408,571; 3445,714; 1712,143;
780; 132,6786; 120,7143; 58,92857; 48,0924 yang diukur dengan dengan menggunakan panjang gelombang 434 nm.
Prinsip uji perolehan kembali dalam penentuan kadar obat dalam darah didasarkan pada perbandingan antara hasil pengukuran obat pada sampel dengan kadar obat yang diketahui (sampel yang telah disiapkan dengan penambahan obat yang diketahui secara tepat) dan hasil pengukuran obat pada sampel asli yang akan diuji. Dalam uji perolehan kembali, dilakukan pengukuran obat pada sampel dengan kadar obat yang diketahui secara akurat dan pada sampel asli. Perolehan kembali dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
Perolehan Kembali (%) = (Kadar Obat pada Sampel dengan Kadar Obat yang Diketahui / Kadar Obat pada Sampel Asli) × 100%. Nilai perolehan kembali yang diharapkan adalah mendekati 100%. Jika perolehan kembali mendekati 100%, itu menunjukkan bahwa metode pengukuran obat dalam darah memiliki akurasi yang tinggi dan dapat memberikan hasil yang sesuai dengan kadar obat yang sebenarnya.
Namun, nilai perolehan kembali yang diterima sebagai "nilai normal"
dapat bervariasi tergantung pada berbagai faktor, termasuk metode analisis yang digunakan, batas kesalahan yang diterima, dan persyaratan spesifik dari lembaga atau otoritas yang berwenang. Pada umumnya, nilai perolehan kembali yang diterima untuk metode pengukuran obat yang baik adalah sekitar 90-110% atau sesuai dengan persyaratan yang ditetapkan oleh badan pengatur terkait. Adapun nilai perolehan kembali yang terlalu tinggi (misalnya, melebihi 110%) dapat menunjukkan adanya kesalahan sistematis atau bias positif dalam metode pengukuran. Sedangkan nilai perolehan kembali yang terlalu rendah (misalnya, kurang dari 90%) dapat menunjukkan adanya kesalahan sistematis atau bias negatif dalam metode pengukuran.
Uji Perolehan kembali (ppm) Absorbansi
600 0,826
800 1,053
1600 1, 804
2400 1,913
Uji perolehan kembali 600 ppm = 40,95%: Hasil pengukuran obat pada sampel dengan kadar obat yang diketahui (600 ppm) memberikan hasil perolehan kembali sebesar 40,95%. Ini berarti bahwa metode pengukuran menghasilkan sekitar 40,95% dari kadar obat yang sebenarnya pada sampel asli. Meskipun hasil perolehan kembali ini masih di atas 100%, perlu diperhatikan bahwa nilai ini mungkin bervariasi tergantung pada persyaratan dan batas kesalahan yang ditetapkan dalam metode analisis yang digunakan.Uji perolehan kembali 800 ppm = 37,12%:Pada konsentrasi 800 ppm, hasil pengukuran obat menghasilkan perolehan kembali sebesar 37,12%. Nilai ini menunjukkan bahwa metode pengukuran menghasilkan sekitar 37,12% dari kadar obat yang sebenarnya pada sampel asli. Perolehan kembali yang lebih rendah dari sebelumnya (600 ppm) menunjukkan adanya penurunan akurasi dalam pengukuran pada konsentrasi yang lebih tinggi.
Uji perolehan kembali 1200 ppm = 35,225%:Pada konsentrasi 1200 ppm, perolehan kembali obat adalah 35,225%. Angka ini menunjukkan bahwa metode pengukuran hanya menghasilkan sekitar 35,225% dari kadar obat yang sebenarnya pada sampel asli. Terlihat bahwa semakin tinggi konsentrasi obat, semakin rendah nilai perolehan kembali yang diperoleh.Uji perolehan kembali 2400 ppm = 31,44%:Pada konsentrasi obat tertinggi, yaitu 2400 ppm, hasil perolehan kembali adalah 31,44%. Angka ini menunjukkan bahwa metode pengukuran hanya mampu menghasilkan sekitar 31,44% dari kadar obat yang sebenarnya pada sampel asli. Perolehan kembali yang rendah pada konsentrasi ini menunjukkan adanya penurunan akurasi yang signifikan dalam pengukuran obat pada konsentrasi tinggi.
Kesahana sistemik dari konsentrasi 600, 800, 1200, 2400 ppm secara berturut-turut adalah 59,05%; 62,88%; 64,775% dan 63,83% Kesalahan sistemik yang tinggi pada konsentrasi ini menunjukkan bahwa metode pengukuran obat cenderung menghasilkan hasil yang lebih rendah dari kadar obat yang sebenarnya pada sampel asli. Kesalahan sistemik yang tinggi ini mengindikasikan adanya bias negatif yang signifikan dalam metode pengukuran.
adanya bias negatif disebabkan oleh beberapa kesalahan dalam praktikum antara lain sebagai berikut:
●Cara mengambil sampel yang kurang tepat dan pada waktu yang kurang tepat
●Praktikan tidak hati-hati saat menambahkan reagen,
●Kesalahan pada metode pembacaan spektrofotometer UV-Vis yang ada Gelembung udara di supernatan
●Cairan supernatan yang kurang jernih dipipet sehingga dapat menimbulkan efek gangguan pada proses pengukuran serapan.
●Lebih rendah dari suhu optimum untuk pembentukan garam diazonium.
X. Kesimpulan
Pengukuran kadar obat parasetamol dalam urin menggunakan spektrofotometer kali ini masih banyak kesalahan karena data yang dihasilkan kurang akurat, mulai dari pemrosesan hingga pengukuran sampel.
XI. Lampiran
XII. Daftar Pustaka
Ahmed, T. A. (2015). Pharmacokinetics of drugs following IV bolus, IV infusion, and oral administration. Basic Pharmacokinetic Concepts and Some Clinical Applications, 10.
Ansel., Howard., C. 2004.Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. UI Press. Jakarta.
Devissaguet., Aiache. 1982. Farmasetika 2 Biofarmasi Edisi ke-2. Technique et Documentation 11 Rue Lavoisier. Airlangga University.
Ganiswara., 2005. Farmakologi Dan Terapi. Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran. Universitas Indonesia. Jakarta.
Hakim, L., 2012,Farmakokinetika, Yogyakarta: Bursa Ilmu.
Michael., J., Neal. 2006. At a Glance Farmakologi Medis Edisi keLima. Penerbit Erlangga PT Gelora Aksara Pratama. Jakarta.
Shargel, L. dan Yu., 2005, Biofarmasetika Dan Farmakokinetika Terapan.
Surabaya: Airlangga University Press.
Shargel, Leon. 2012. Biofarmasetika Dan Farmakokinetika Terapan. Airlangga University. Jakarta.
Shargel, Leon; Yu, A. B. C. (2016). Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics (7th ed.). New York: McGraw Hill Education.
Setiawati, A., 2005, Farmakokinetik Klinik Farmakologi dan Terapi Edisi 4.
Jakarta :Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Waldon, D.J. (2008). Pharmacokinetic and Drug Metabolism. Cambridge:
Amgen, Inc.,One Kendall Square, Building 1000, USA.