Module 5:
Deteksi Antigen SARS-CoV-2 Pada Mencit (Mus musculus) galur BALB/c melalui metode Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
15 November 2023
PJ: Azka Fathiya | Co-PJ: Yashmine Salsabila Theo
A. Pendahuluan
Deteksi protein terlarut spesifik baik secara kualitatif maupun kuantitatif dalam suatu larutan dapat dilakukan dengan metode Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Dalam studi imunologi dan virologi, ELISA umum digunakan untuk mendeteksi protein seperti antigen, antibodi, dan sitokin yang terdapat dalam sampel biologis. Prinsip dari metode ELISA adalah imobilisasi antigen atau antibodi pada plat, kemudian ke dalam plat ditambahkan antibodi terkonjugasi dengan enzim untuk deteksi dan menghasilkan sinyal.
Terdapat empat komponen dalam suatu format ELISA, antara lain:
1. Coatingyaitu tahap imobilisasi antigen atau antibodi pada plat.
2. Blocking yaitu penambahan protein non-target atau molekul lain yang dapat melapisi sisa permukaan dasar plat yang tidak berikatan dengan komponencoating.
3. Deteksi yaitu proses inkubasi dengan antibodi yang dapat berikatan secara spesifik dengan antigen atau protein target deteksi.
4. Pembacaan sinyal untuk mengetahui protein target terdeteksi berdasarkan sinyal yang dihasilkan darienzyme tagpada antibodi spesifik terhadap target protein.
Setiap komponen dalam ELISA dapat dimodifikasi dan disesuaikan formatnya sesuai dengan target deteksi yang diinginkan. Umumnya, terdapat tiga format umum dalam ELISA yaitu direct, indirect, dan sandwichELISA.
Gambar 1.Format ELISA yang umum digunakan.
Pada praktikum ini akan dilakukan uji deteksi antigen SARS-CoV-2 dengan metode sandwich ELISA (Gambar 2). Polyclonal antibody yang mengenali antigen SARS-CoV-2 akan dilapiskan pada plate ELISA. Selanjutnya ditambahkan antigen SARS-CoV-2. Primary antibody yang digunakan berasal dari mencit yang sudah divaksinasi dengan antigen SARS-CoV 2 dan secondary antibody yang digunakan adalah antibodi dari kambing yang mengenali antibodi mencit. Pada praktikum ini secondary antibody yang digunakan telah dikonjugasikan dengan enzim horseradish peroxidase (HRP) yang akan mengubah substrat TMB dari tidak berwarna menjadi berwarna kuning.
Gambar 2.FormatSandwichELISA untuk deteksi antibodi IgG dalam serum mencit.
B. Metode
Alat dan Bahan
Tabel 1.Alat dan Bahan untuksandwichELISA deteksi antibodi IgG dalam serum mencit.
Alat Bahan
1. Multichannel pipette(8channel, 10-100µL)
2. Sterile Solution Basin(Reservoir) 3. GloMax® DiscoverMicroplate
Reader(ProMega)
1. 1 pcs Nest Scientific 701001 Polystyrene 96 Well Cell Culture Plate, Flat Bottom
2. Chicken IgY Antibody 3. Bovine Serum Albumin 4. Antigen Protein MEV-CoV19 5. Sampel serum mencit kelompok
kontrol PBS
6. Sampel serum mencit kelompok uji MEV-CoV19
7. Secondary Antibody Goat
Anti-Mouse IgG(HRP-Conjugated) 8. 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidin (TMB)
9. Asam sulfat 2M 10. PBS
11. TBS-T 12. Tisu
13.Pipette tips100µL
Alur Kerja
Gambar 3.FormatSandwichELISA untuk deteksi antibodi IgG dalam serum mencit.
*Dibuat dalam bentuk alur kerja
*Serum mencit yang dimasukkan memiliki 2 variasi dilusi (1:500 dan 1:5000)
*Dilakukan wash setelah inkubasi dan sebelum menambahkan reagen selanjutnya
Skema ELISA Per Kelompok (di print yaa)
Jantan Betina
Antibodi PBS-adjuvant Antibodi PBS-adjuvant
SARS-CoV-2 SARS-CoV-2
1 plate digunakan 2 kelompok dengan rincian sebagai berikut:
Plate 1 = K1 (Jantan 1) & K2 (Betina 1) Plate 2 = K3 (Jantan 2) & K4 (Betina 2) Plate 3 = K5 (Jantan 3) & K6 (Betina 3)
P = Pre vaccination
1W = 1 week post vaccination 3W = 3 week post vaccination 6W = 6 week post vaccination
Rundown Kerja
Waktu Durasi Langkah kerja Catatan
Mulai Selesai
12:00 (Selasa)
13:00 1 Jam Coating Chicken IgY Antibody Perwakilan kelompok
13.00 (Selasa)
05.00 (Rabu)
16 jam Inkubasicoating
05:00 06:00 1 jam BlockingBSA 5% in TBS-T 1X Dilakukan asisten
06:00 08:00 2 jam Inkubasi BSA + Dilusi serum room temperature
08:00 09:00 1 Jam Wash+ AddAntigen MEV-CoV19 Perwakilan kelompok
09:00 10:30 1,5 jam Inkubasi antigen
10:30 11:30 1 jam Wash + Add Mouse Serum All samples 1:500 and 1:5000
Perwakilan kelompok *bila memungkinkan
11:30 13:30 2 jam Inkubasi serum
13:30 14:30 1 jam Wash + Secondary Antibody Goat Anti-Mouse IgM diluted in BSA 1%
TBS-T 1X Dilution 1:20000
Bersama-sama saat praktikum
14:30 15:00 30
menit
Inkubasi secondary antibody + Penjelasan asisten
Bersama-sama saat praktikum
15:00 15:50 50
menit
Wash + Add TMB + Stop Solution Bersama-sama saat praktikum
15.50 16.05 15
menit
Reading plate ELISA/Menonton video reading plate ELISA
Perwakilan kelompok
16.05 16.15 10
Menit
Tes Akhir *tentative Bersama-sama saat praktikum
C. Poin Pembahasan Jurnal 1. Prinsip dasar ELISA 2. Jenis ELISA
3. Aplikasi ELISA
4. Jenis enzim dan substrat dalam ELISA secara umum 5. Fungsi reagen dan plate dalam ELISA secara umum
D. Pembahasan Modul (Laporan)
1. Perbandingan antar perlakuan (vaksin dan kontrol PBS)
2. Perbandingan antar waktu (Pre-vaccination, 1 week, 3 week, 6 week) 3. Optimasi dilusi optimumm (1:500 vs 1:5000)
4. Kekurangan dan kelebihan ELISA
Catatan
Praktikan membawa tissue dapur yang tebal dan membawa plastik sampah beserta tempat sampahnya. Tempat sampah dapat menggunakan kaleng bekas atau tempat tissue yang bundar.
