Ibu Erni Yuniarti, H.E., Romo Rene Donantha, H.E., dan adik Ishaq Na'im Maulana yang tak henti-hentinya memberikan doa, kasih sayang, motivasi, dukungan dan semangat selama ini. Rodjichatin yang telah memberikan kenangan indah, nasehat berharga, kasih sayang, dukungan dan semangat selama ini. Dosen, pembimbing, penguji dan almamater saya, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember.
prof., dan bukan plagiarisme. Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Karakteristik DNA Barcode Anggrek Phalaenopsis deliciosa Rchb.f.” Bagus. Tesis ini ditulis dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan studi pascasarjana (S1) di Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember.
Mukhamad Su'udi, Ph.D, selaku pembimbing utama dan Tri Ratnasari, S.Si., M.Si sebagai anggota pembimbing yang dengan sabar memberikan bimbingan, arahan dan saran dalam penulisan disertasi ini; Dwi Setyati, M.Si selaku dosen penguji yang memberikan kritik, saran dan masukan yang membangun dalam penulisan skripsi ini; Hidayat Teguh Wiyono, M.Si. Pd selaku dosen pembimbing akademik yang memberikan arahan dan motivasi selama penulis menempuh studi untuk meraih gelar sarjananya;
Beasiswa dari Bupati Jember yang memberikan beasiswa sarjana sehingga penulis dapat memperoleh gelar sarjana dan Kelompok Penelitian DNA yang mendanai penelitian ini;
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang 1.1 Latar Belakang
Manfaat
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai barcoding DNA khususnya pada Phalaenopsis deliciosa Rchb.f. Berdasarkan hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan rekomendasi penanda molekuler yang tepat untuk proses identifikasi anggrek Phalaenopsis deliciosa.
TINJAUAN PUSTAKA
DNA Barcoding
Barcoding DNA melibatkan pengurutan satu atau lebih wilayah genom standar sebagai alat untuk identifikasi spesies (Kim et al., 2014). Proses identifikasi pada teknik barcode DNA dilakukan dengan membandingkan informasi genetik berupa sekuens DNA antar spesies berkerabat untuk mengetahui identitas dan fungsi gen atau fragmen DNA (Glick et al., 2010; Rogers, 2011). Barcode DNA dapat digunakan sebagai alat identifikasi bahan obat herbal untuk keamanan penggunaan jamu, pengendalian mutu obat herbal dan investigasi forensik untuk mendeteksi racun bahan herbal pada kasus yang mengancam jiwa (Li et al., 2011).
Barcode DNA yang sesuai harus memenuhi beberapa kriteria, antara lain memiliki universalitas yang tinggi, sehingga dapat diterapkan pada semua spesies tumbuhan, dan dapat membedakan spesies secara lebih spesifik (Li et al., 2011). Keuntungan dari DNA barcoding adalah proses identifikasi dalam kegiatan taksonomi menjadi lebih cepat dan akurat (Kang et al., 2017). Hal ini disebabkan karena barcode DNA sampel dapat mengidentifikasi suatu organisme meskipun hanya sebagian kecil dari barcode DNA sampel yang tersedia (Hebert et al., 2003).
Teknik ini sangat mendukung proses pemantauan dan penyelidikan keanekaragaman hayati, filogeni molekuler, dan evolusi (Kang et al., 2017). Gen K-maturase merupakan penanda yang direkomendasikan oleh The Consortium for the Barcode of Life (CBOL) Plant Working Group sebagai lokus barcode DNA (Heckenhauer et al., 2016). Gen matK mengandung substitusi tingkat tinggi dalam spesies dan berpotensi mempelajari sistematika tumbuhan (molekuler) dan evolusi tumbuhan pada berbagai tingkat taksonomi (Selvaraj et al., 2008).
Gen matK memiliki beberapa keunggulan yaitu ukuran gen yang ideal, tingkat substitusi yang tinggi, dan variasi kadar asam nukleat yang besar, sehingga dapat digunakan untuk identifikasi tanaman pada tingkat famili hingga spesies (Selvaraj et al., 2008). Berdasarkan penelitian tersebut, gen matK sebagai barcode yang digunakan untuk proses identifikasi juga dapat menganalisis hubungan interspesifik spesies hibrida dari Paphiopedilum (Kumar et al., 2016). Penggunaan gen matK sebagai barcode yang digunakan dalam proses identifikasi spesies menunjukkan hasil amplifikasi yang tinggi yaitu sebesar 85% dan sekuensing sebesar 69% sehingga menyarankan penggunaannya dalam perbanyakan berbagai jenis tanaman (Kress et al., 2009). .
Keunggulan rbcL menurut Newmaster et al., 2006), gen rbcL yang diberi barcode memiliki variasi yang cukup untuk membedakan spesies tanaman (Dong et al., 2013). Penggunaan rbcL untuk studi filogenetik telah dilakukan oleh Chase dkk (1993) untuk merekonstruksi keterkaitan spesies tumbuhan yang berbeda dan sejak itu rbcL menjadi populer untuk digunakan dalam memperdalam penelitian. Keunggulan lain dari rbcL menurut Clegg (1993) adalah bersifat universal dan memiliki kualitas sekuensing basa DNA yang baik (Dong et al., 2013).
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Perakitan sekuens in silico tidak ditemukan karena sekuens DNA Phalaenopsis deliciosa Rchb.f tidak tersedia. Isolasi DNA genom dari sampel anggrek Phalaenopsis deliciosa dilakukan dengan menggunakan GenExTM Plant Sx Kit (GeneAll Biotechnology, Korea). Sampel yang sudah homogen kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 1,5 jam pada thermal shaker kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu kamar (27°C) selama 30 detik.
Sebanyak 400 µl supernatan kemudian diambil dari sampel yang telah disentrifugasi; 20 l; 200 l; 1000 µL, L dan dipindahkan ke mikrotube baru (jika volume supernatan yang diperoleh kurang dari 400 µL; 20 µL; 200 µL; 1000 µL, L, tambahkan buffer PP hingga sepertiga volume supernatan). Sampel yang homogen diinkubasi dalam es selama 5 menit untuk memperoleh kualitas DNA yang lebih baik. Amplifikasi DNA target dilakukan dengan mereaksikan 2x PCR Master mix, primer forward, primer reverse dan ekstrak DNA genom Phalaenopsis.
Tahapan pada mesin PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dan menurut Handoyo dan Rudiretna (2001), kondisi mesin PCR dikontrol dan dijelaskan menurut tahapan yang berbeda-beda yaitu tahap pradenaturasi dilakukan pada suhu 95°C selama 5 siklus. menit. . Fase elongasi dilakukan setelah selesai fase annealing pada suhu 72°C selama 1 menit 15 detik, selanjutnya fase elongasi akhir pada suhu 72°C selama 5 menit dan fase akhir diadakan pada suhu 16°C. Hasil PCR diamati secara elektroforesis melalui beberapa tahap yaitu pembuatan gel gram agarosa dalam 50 ml buffer TAE (Tris Acetic-EDTA).
Setelah proses elektroforesis yang sedang berlangsung selesai, divisualisasikan dengan meletakkan gel di atas UV transilluminator untuk melihat apakah ada pita DNA dari hasil PCR. Produk PCR yang telah melalui proses elektroforesis dapat dimurnikan untuk memaksimalkan hasil amplifikasi DNA target. Selanjutnya ditambahkan 3x volume solubilization buffer (SB) dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik pada suhu 25°C dalam tabung berisi sampel.
DNA dicuci menggunakan wash buffer (WB), kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 25°C selama 30 detik. Kemudian disentrifugasi pada suhu 25oC dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik dan encerkan DNA menggunakan H2O steril atau Elution Buffer (EB) sebanyak 20-50 µl, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 25oC selama 30 detik. Analisis data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak BLAST yang tersedia di database DNA GenBank NCBI (Pusat Informasi Bioteknologi Nasional) untuk mengkonfirmasi urutan DNA target (matK, rbcL dan ITS2) dari Phalaenopsis deliciosa.
KESIMPULAN DAN SARAN
KESIMPULAN
Molecular phylogenetics of the species-rich genus Habenaria (Orchidaceae) in the new world based on nuclear. A two-locus global DNA barcode for land plants: The coding rbcL gene complements the non-coding trnHpsbA spacer region. On the precise relationship between the growth of Phalaenopsis leaves and greenhouse environmental factors using an IOT-based monitoring system.
Evaluation of five different loci (rbcL, rpoB, rpoC1, matK and ITS) for DNA barcoding of Indian orchids. In Proceedings of the International Conference on Integrated Solid Waste Management in Southeast Asian Cities, Siem Reap, Cambodia. Phylogenetic Analysis of Sorghum and Related Taxa Using Internal Transcribed Spacers of Nuclear Ribosomal DNA.
The Internal Transcribed Spacer (ITS) region and trnhHpsbA are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species in India. Evaluation of the Ribosom al DNA Internal Transcribed Spacer (ITS), in particular ITS1 and ITS2, for the analysis of fungal diversity by deep sequencing. The benefits of the ITS2 region of the nuclear rDNA Cistron for analysis of insect phylogenetic relationships: a Drosophila example.
