PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA

Tujuan dibuatnya Panduan Praktikum ini adalah untuk membantu mahasiswa dalam melakukan Praktikum Biokimia di Fakultas Farmasi Universitas Andalas. Materi yang diamalkan meliputi : Pemeriksaan urin secara makroskopis, mikroskopis dan sedimen urin; Analisis karbohidrat (pemeriksaan urin untuk glukosa) dan analisis protein (pemeriksaan urin untuk protein). Urinalisis untuk indikasi bilirubin, urobilin, urobilinogen; Tes hemoglobin; studi protein plasma; pemeriksaan gula darah (Diabetes Mellitus) dan kreatinin (penurunan fungsi ginjal); pengendalian kolesterol (hiperlipidemia); pemeriksaan SGPT dan SGOT (penurunan fungsi hati).

Panduan praktik ini juga memuat lembar kerja tes praktik yang harus diselesaikan siswa setelah praktik. Semoga Panduan Praktikum ini bermanfaat bagi para pembaca khususnya mahasiswa dalam melaksanakan Praktikum Biokimia. Minggu ke 3 Analisis Karbohidrat (Urinalisis glukosa) dan Analisis Protein (Urinalisis protein) Minggu ke 4 Urinalisis untuk indikasi bilirubin, urobilin.

PROSEDUR KERJA 4.1 Alat dan Bahan

JENIS

PENGAMATAN

PEMERIKSAAN SEDIMEN URIN I. TUJUAN

• PRINSIP
• TEORI

Unsur-unsur dalam urin diendapkan dengan sentrifugasi dan dianalisis di bawah mikroskop.

UNSUR SEDIMEN URINE ORGANIK 1. Eritrosit

Patofisiologi: Pengendapan albumin, baik albumin dari filtrat atau sekret tubulus, akan memerangkap bahan yang ada dalam urin. Silinder ini ditemukan pada nefritis akut, penyakit kuning tanpa albuminaria, dan pada orang sehat setelah berolahraga. Jika nefritis akut, struktur sel epitelnya masih jelas, namun jika prosesnya menjadi kronis, struktur epitelnya akan berubah menjadi butiran lemak.

Silinder ini berisi butiran halus hingga kasar berupa albumin, sel epitel, lemak, leukosit, dan eritrosit yang rusak. Silinder ini tidak berwarna, lebih besar dari silinder hialin, ujung-ujungnya sering tidak rata karena cekungan. Sel epitel tubulus ginjal lebih kecil dari sel epitel ureter dan kandung kemih, namun lebih besar dari leukosit.

UNSUR SEDIMEN URINE ANORGANIK

• PROSEDUR KERJA 4.1 Alat dan Bahan
• TUJUAN
• PROSEDUR KERJA 4.1 Alat-alat
• Bahan-bahan
• Metoda Pengerjaan
• Pemeriksaan Urin Terhadap Glukosa 1.1 Pembuatan Reagen Benedict
• Pemeriksaan Urin Terhadap Protein 2.1 Tes Pemanasan dengan Asam Asetat

Tes glukosa urin dapat dilakukan dengan menggunakan reaksi reduksi, dilakukan dengan fehling, benedict dan clinitest. Cara non spesifik dapat dilakukan dengan menggunakan zat dalam reagen yang berubah sifat dan warnanya bila direduksi dengan glukosa. Salah satu tes protein urin yang cukup sensitif adalah dengan memanaskan urin dengan asam asetat.

Pemberian asam asetat dilakukan untuk mencapai atau mendekati titik isoelektrik protein, sedangkan pemanasan bertujuan untuk mendenaturasinya sehingga terjadi pengendapan. Pemberian asam asetat yang berlebihan akan menghasilkan hasil tes negatif palsu. Kelebihan metode Bang adalah tidak terganggu oleh kekeruhan garam kalsium dan fosfat.Dengan adanya buffer asam asetat diperoleh pH yang ideal untuk pengendapan protein.

PEMERIKSAAN URINE ATAS INDIKASI BILIRUBIN I. TUJUAN

• PROSEDUR KERJA
• Percobaan Harrison

Bilirubin terkonjugasi bereaksi cepat dengan asam sulfanilat diazotisasi membentuk azobilirubin (reaksi van den Bergh), oleh karena itu sering disebut bilirubin langsung atau bilirubin langsung. Bilirubin tak terkonjugasi (hematobilirubin), yaitu bilirubin bebas yang terikat pada albumin, harus dicampur terlebih dahulu dengan alkohol, kafein, atau pelarut lain sebelum dapat bereaksi karena disebut bilirubin tidak langsung atau bilirubin tidak langsung. Peningkatan kadar bilirubin langsung menandakan adanya gangguan pada hati (sel hati rusak) atau saluran empedu (batu atau tumor).

Bilirubin terkonjugasi tidak dapat keluar dari empedu ke usus, sehingga akan masuk kembali dan diserap ke dalam aliran darah. Peningkatan kadar bilirubin tidak langsung sering dikaitkan dengan peningkatan penghancuran sel darah merah (hemolisis), seperti pada penyakit hemolitik autoimun, transfusi, atau eritroblastosis yang fatal. Meningkatnya penghancuran eritrosit tidak dibarengi dengan laju konjugasi dan sekresi di saluran empedu, sehingga mengakibatkan peningkatan kadar bilirubin tidak langsung.

Cara ini menggunakan kertas saring kasar (Shlesinger atau Schull No. 470) yang direndam dalam BaCl2 jenuh, kemudian kertas saring tersebut dikeringkan.

PEMERIKSAAN URINE ATAS INDIKASI UROBILIN (PERCOBAAN SCHLESINGER)

Filtrat yang diperoleh dari percobaan bilirubin menurut Harrison tidak dapat digunakan untuk pemeriksaan urobilin menurut Schlesinger karena urobilin akan diserap oleh endapan yang terjadi akibat BaCl2 (dari pereaksi Fauchet). Oleh karena itu pada pereaksi Fauchet BaCl2 diganti dengan CaCl2 sehingga terjadi duplikasi uji bilirubin menurut Harrison dan uji urobilin menurut Schlesinger, masing-masing filtrat uji Schlesinger dan endapan uji bilirubin.

PEMERIKSAAN URINE ATAS INDIKASI UROBILINOGEN (PERCOBAAN WALLACE DIAMOND)

• Alat Dan Bahan a. Alat
• Prosedur Kerja A. Metode Sahli

Peningkatan ekskresi urobilinogen urin terjadi ketika fungsi sel hati menurun atau terdapat kelebihan urobilinogen di saluran cerna sehingga melebihi batas kapasitas ekskresi hati. Peningkatan urobilinogen terlihat pada: kerusakan hemoglobin yang berlebihan (ikterus hemolitik atau anemia hemolitik karena alasan apa pun), kerusakan parenkim hati (toksisitas hati, hepatitis menular, sirosis hati, keganasan hati), penyakit jantung ibu kronis, obstruksi usus, mononukleosis menular, penyakit sel sabit anemia. Hasil positif juga bisa didapat setelah berolahraga atau minum, namun bisa juga disebabkan oleh kelelahan atau sembelit.

Pengurangan urobilinogen dalam urin, diamati pada penyakit kuning obstruktif, kanker pankreas, penyakit hati yang parah (sejumlah kecil empedu diproduksi), penyakit radang parah, penyakit batu empedu, diare parah. Hemoglobin diubah menjadi asam hematin, kemudian warna yang muncul secara visual dibandingkan dengan standar pada alat. Hemoglobin dalam darah diubah menjadi sianmethemoglobin (hemiglobin sianida) dalam larutan yang mengandung kalium ferricyanide dan potasium sianida (larutan Drabkin).

Larutan Drabkin yang digunakan dalam metode ini mengubah hemoglobin, oksihemoglobin, methemoglobin, dan karboksihemoglobin menjadi sianmeth-hemoglobin, selain sulfhemoglobin. Hemoglobin merupakan protein mengandung zat besi yang terdapat pada sel darah merah yang berfungsi mengangkut oksigen dari paru-paru ke seluruh tubuh dan mengangkut CO2 dari seluruh tubuh ke paru-paru untuk dibuang. Penentuan jumlah hemoglobin dalam darah berperan penting dalam biokimia klinis untuk menentukan diagnosis suatu penyakit.

Catat waktunya dan segera biarkan darah mengalir dari pipet ke dasar tabung yang berisi HCL. Angkat sedikit pipet, lalu masukkan HCl bening ke dalam pipet sebanyak 2 atau 3 kali untuk mengeluarkan darah yang tersisa di dalam pipet. Pencocokan warna campuran dan batangan standar harus dicapai dalam waktu 3 sampai 5 menit setelah pencampuran darah dan HCl.

Metode Fotoelektrik

• PROSEDUR KERJA 4.1 Alat

Protein plasma yang telah teridentifikasi dan menyusun 70% darah adalah albumin, globulin, dan fibrinogen. Tekanan osmotik intravaskular selalu 18 mmHg lebih tinggi daripada tekanan osmotik ekstravaskular, yang disebut juga tekanan onkotik. Udem juga ditemukan pada penyakit ginjal seperti sindrom nefrotik dan glomerulonefritis kronis dengan patofisiologi berbeda.

Dalam hal ini, ginjal berperan sebagai faktor hilangnya albumin melalui glomerulus, yang dapat menyebabkan kadar albumin plasma turun. Setelah dilakukan sentrifugasi diperoleh filtrat albumin bening, filtrat inilah yang digunakan dalam penelitian albumin. Ambil filtrat dari masing-masing pengujian, dimana : F St = filtrat albumin dari serum standar FS = filtrat albumin dari serum sampel.

Globulin = Total Protein - Albumin

PEMERIKSAAN GULA DARAH (DIABETES MELLITUS) I. TUJUAN

• PROSEDUR KERJA 4.1 Alat dan bahan
• Fungsi reagen

Dengan perhitungan kimia, pengurangan K3Fe(CN)6 dapat dihitung, yang sesuai dengan jumlah gula. Sedangkan fruktosa akan meningkat pada banyak makanan buah-buahan dan galaktosa darah akan meningkat pada ibu hamil dan menyusui. Di laboratorium, pemeriksaan glukosa darah banyak dilakukan mengingat luasnya kepentingan diagnostik klinis dalam bidang medis.

Dalam kondisi fisiologis, kadar gula darah bervariasi namun tetap dalam batas normal, yang nilainya tergantung pada waktu setelah makan, jenis makanan, dan cara pemeriksaan yang digunakan. Dalam metode non-enzimatik, seperti metode reduksi atau kalorimetri, selain glukosa, juga dibaca zat lain seperti fruktosa, galaktosa, vitamin C, dll. Nilai normal glukosa darah sebenarnya adalah 60-100 mg/100 ml darah utuh dalam keadaan puasa (Nucter) minimal 10 jam, 70-110 dengan metode Ortho-Toluidine dan bahkan lebih tinggi lagi 80-120 mg dengan metode reduksi. .

Gula darah akan meningkat setelah mengonsumsi makanan enteral, namun akan kembali normal setelah kurang lebih 2 jam. Glikogen merupakan cadangan karbohidrat dalam tubuh yang dapat dengan cepat dimobilisasi ketika kadar gula darah yang bersirkulasi mulai menurun, terutama untuk kebutuhan energi tubuh pada saat lapar. Gula darah merupakan sumber energi paling aktif yang digunakan tubuh melalui glikolisis lengkap (Embden Meyerhof, siklus Kreb).

Selain glukosa disimpan sebagai cadangan lemak melalui lipogenesis, glukosa juga dapat digunakan sebagai bahan baku sintesis asam amino non-esensial melalui proses aminasi asam keto. Glukosa juga dapat disintesis menjadi bahan aktif lain seperti glikolipid atau glikoprotein dan lain-lain. Sebaliknya jika pemanfaatan glukosa terganggu, seperti kekurangan insulin atau reseptor pada dinding sel, maka akan mengakibatkan peningkatan gula darah yang disebut hiperglikemia.

Ditambahkan 2 ml K3Fe(CN)6 ke dalam filtrat, dididihkan selama 15 menit, didinginkan kemudian ditambahkan 3 ml KI dan 2 ml asam asetat.

PEMERIKSAAN KREATININ DARAH I. TUJUAN

• H 2 SO 4 0,006 N 3. FBP
• Cara kerja
• Bahan
• Cara Kerja

Dalam penelitian menggunakan teknik radioisotop N13 pada kreatinin yang berasal dari asam amino arginin, glisin dan metionin. Bersihan kreatinin, untuk menilai fisiologi ekskresi tubulus ginjal, adalah kemampuan ginjal untuk mengeluarkan kreatinin per menit. Ini dihitung dengan mengukur jumlah darah atau plasma yang dimurnikan dan jumlah kreatinin yang dikeluarkan melalui urin per menit (ml/menit).

Jika standar murni digunakan, hal yang sama diterapkan tanpa deproteinisasi, karena standar murni tidak mengandung protein. Kolesterol membentuk senyawa hijau tua dengan anhidrida asetat dan asam sulfat pekat pada suhu kamar. Kolesterol merupakan senyawa lemak kompleks yang diproduksi tubuh dengan beberapa fungsi, antara lain pembuatan hormon seks, hormon korteks adrenal, vitamin D, dan pembuatan garam empedu yang membantu usus menyerap lemak.

Campur, tunggu 20 menit lalu tambahkan masing-masing pengujian 0,5 ml asam sulfat pekat ke dinding tabung tepat di atas cairan, segera setelah menambahkan asam sulfat, lalu dinginkan dalam gelas kimia berisi air dingin 15-25oC, tunggu 5 menit dan kocok tes untuk ketiga kalinya, kemudian baca setelah 10 menit pada 610 nm atau 560-580 nm bila menggunakan filter. Serum yang mengandung bilirubin akan memberikan nilai yang lebih tinggi, 1 mg/100 ml bilirubin menghasilkan peningkatan nilai kolesterol sebesar 5-6 mg/100 ml serum.

METODA CHOD-PAP I. TUJUAN

• SGOT

Uji enzim transaminase yang direkomendasikan oleh IFCC (Federasi Internasional Kimia Klinis) adalah teknik kinetik UV pada 340 nm. Enzim yang ada dalam serum pasien mengkatalisis reaksi antara oksoglutarat dan L-alanin untuk membentuk glutamat dan piruvat. Penurunan NADH akan sebanding dengan aktivitas GPT, seperti terlihat pada A setelah 1 menit reaksi.

Enzim transaminase merupakan enzim intraseluler yang fungsinya mengkatalisis reaksi pemisahan (gugus amino (NH2)) dan asam amino, sehingga terbentuk turunan asam keto baru dan terbentuk pula asam amino baru. Pada prinsipnya semua sel mengandung enzim ini, namun mayoritas adalah sel hati, jantung, dan otak. Jika terjadi nekrosis sel yang parah, perubahan permeabilitas membran atau kapiler enzim ini akan masuk ke aliran darah.

Campurkan 50 µl serum + 500 µl larutan reagen, baca A setelah kurang lebih satu menit dan kemudian baca setiap menit selama 3 menit.