PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kanker merupakan suatu penyakit yang disebabkan oleh pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal dan tidak terkontrol (Bosman, 1996).Kanker payudara adalah kanker pada jaringan payudara.Kanker payudara merupakan kanker terbanyak kedua setelah kanker leher rahim di Indonesia (Tjindarbumi, 1995).Diperkirakan, kematian akibat kanker di dunia mencapai 4,3 juta per tahun dan 2,3 juta diantaranya ditemukan di negara berkembang (Parkinet al., 1998).Oleh karena itu perlu dilakukan pencegahan terhadap penyakit kanker sedini mungkin mengingat resiko yang dapat ditimbulkannya.
Pencegahan kanker dapat dilakukan dengan cara menghindari faktor pencetus kanker dan memperbaiki pola makan.Kemoterapi merupakan salah satu terapi yang digunakan saat ini selain dengan pembedahan, radioterapi, dan pengobatan dengan hormon (Dalimartha, 1999). Tetapi kebanyakan orang lebih memilih untuk tidak memeriksakan ataupun mengobati kanker tersebut menggunakan terapi medis seperti obat-obatan dan penyinaran dengan berbagai alasan, seperti takut akan efek samping obat, biaya serta takut akan ketergantungan terhadap obat-obat tersebut karena harganya yang relatif mahal.
Salah satu bahan alam yang dipercaya memiliki khasiat antikanker adalah buah mengkudu (Morinda citrifolia L.). Kandungan buah mengkudu akan senyawa antrakuinon seperti damnachantal, alizarin dan proxeronine diduga sebagai senyawa yang bertanggung jawab atas aktivitasnya sebagai agen khemopreventif.
Pada penelitian ini akan dilakukan uji sitotoksik dan pengamatan apoptosis dari ekstrak etanolik buah mengkudu terhadap sel kanker payudara MCF-7. Uji dilakukan secara in vitro melalui uji sitotoksik dan uji apoptosis untuk mengetahui potensi antikanker dari ekstrak tersebut.Penelitian ini diharapkan mampu membuktikan ekstrak etanolik buah mengkudu sebagai antikanker payudara yang potensial yang berasal dari bahan alam.
Perumusan Masalah
1. Apakah ekstrak etanolik buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) mempunyai efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara MCF-7?
2. Apakah ekstrak etanolik buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) dapat memacu terjadinya apoptosis pada sel MCF-7?
Tujuan Program 1. Tujuan Umum
Mengetahui efek antiproliferatif buah mengkudu (Morinda Citrifolia L.) 2. Tujuan Khusus
a. Mengetahui aktifitas ekstrak etanolik buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) sebagai agen sitotoksik terhadap sel kanker payudara.
b. Mengetahui lebih lanjut apakah ekstrak etanolik buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) mempunyai potensi sebagai pemacu terjadinya apoptosis pada sel kanker payudara (Sel MCF-7).
Luaran Yang Diharapkan
Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai bukti ilmiah dari penggunaan buah mengkudu sebagai salah satu alternatif terapi antikanker payudara.
Kegunaan Program
A. Bagi penulis dan kalangan peneliti
1. Dapat dijadikan acuan untuk penelitian selanjutnya mengenai manfaat dan khasiat buah mengkudu.
2. Sebagai dasar untuk pembuatan obat dari bahan alam untuk pencegahan dan pengobatan kanker payudara.
B. Bagi masyarakat secara umum
1. Sebagai sumber informasi untuk masyarakat mengenai manfaat buah mengkudu sebagai agen antikanker yang berbahan dasar alam.
2. Dapat mendorong masyarakat untuk lebih memanfaatkan tanaman yang dianggap kurang berguna menjadi salah satu alternatif pengobatan herbal yang mudah dan murah.
METODE PELAKSANAAN
Ekstraksi
Buah mengkudu yang sudah berwarna kuning bening tetapi masih mengkal dipanen di daerah Kotagede,Yogyakarta sebanyak 5 kg. Mengkudu yang sudah dipanen dan dipilih berdasarkan kekerasan dan warna dicuci bersih dengan air mengalir sebanyak tiga kali untuk memastikan bahwa mengkudu sudah benar-benar bersih dari kotoran yang menempel.Kemudian buah mengkudu dipotong tipis-tipis dan di oven dengan suhu 60oC sampai benar-benar kering.
Simplisia yang sudah kering kemudian diserbuk dengan menggunakan mortir,stamper,dan blender.Penyerbukan dilakukan untuk mempermudah penarikan zat aktif dari simplisia tetapi tidak terlalu halus agar pada saat penyaringan tidak terlalu banyak ampas yang tersaring.Serbuk halus yang didapat sebanyak300 gram.Setelah didapatkan serbuk halus kemudian dilakukan maserasi.
Dalam maserasi, pelarut yang digunakan adalah etanol teknis.Sebanyak 300 gram serbuk mengkudu dibagi ke dalam 2 bejana. Masing-masing bejana berisi 150 gram serbuk yang dimaserasi dengan 700 ml etanol.Kemudian bejana dilapisi dengan kain hitam agar terhindar dari kontak langsung dengan sinar matahari.Maserasi dilakukan selama 5 hari.
Selama proses maserasi bejana digojog setiap hari. Setelah 5 hari dilakukan penyaringan.Sisa penyaringan di remaserasi selama 2 hari tanpa penggojogan.Maserat hasil penyaringan yang pertama disimpan dalam erlenmeyer dan dilapisi dengan kain hitam.Setelah 2 hari, dilakukan penyaringan hasil remaserasi.Hasil dari seluruh penyaringan kemudian dievaporasi agar didapatkan ekstrak kental.Didapatkan ekstrak kental sebanyak 85 gram.
Uji Sitotoksik
Dalam uji sitotoksik hal pertama yang dilakukan adalah persiapan media.Larutan DMEM dibuat dengan melarutkan DMEM dalam aquades, ditambah 2,0 gram NaHCO3 dan 2,0 gram Hepes. Larutan selanjutnya distirer sampai homogen kemudian dibuffer dengan HCl encer 1N hingga pH 7,2-7,4 diukur dengan pH meter. Selanjutnya larutan disaring dengan filter polietilensulfon steril 0,2µm secara aseptis. Media kultur dibuat dengan caramencampurkan larutan DMEM steril dengan FBS 10%, dan penisilin-streptomisin 1%
secara aseptis di dalam LAF.Setelah media kultur disiapkan, kemudian menyiapkan sel kanker yang akan digunakan untuk uji sitotoksik. Sel diambil dari inkubator CO2 kemudian diamati terlebih dahulu, untuk dapat memanen sel harus dipastikan terlebih dahulu bahwa sel telah 80% konfluen.Media tempat tumbuh sel kemudian dibuang dan sel dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali.Selanjutnya ditambahkan tripsin-EDTA 1x dan diinkubasi di dalam inkubator selama 3 menit.Setelah itu ditambahkan media ±5 ml dan diresuspensi untuk kemudian dimasukkan kedalam conical steril.Kemudian dilakukan preparasi sampel.
Preparasi sampel diawali dengan penimbangan sampel kurang lebih 5 mg dalam eppendorf dan ditambahkan 50 µl DMSO dan dilarutkan dengan vortex. Kemudian dibuat serikadar sampel dengan pengenceran stok dalam DMSO manggunakan media kultur.Setelah itu dilakukan perhitunagn sel.
Sel diambil dari inkubator CO2kemudian media tempat tumbuh dibuang dan sel dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali.Selanjutnya ditambahkan tripsin-EDTA 1x dan diinkubasi dalam inkubator selama 3 menit. Setelah itu ditambahkan 2-3 ml media dan diresuspensi kemudian dimasukkan ke dalam conical steril dan diresuspensi kembali dengan menambahkan 2-3 ml media kultur. Selanjutnya diambil 10 µl sel yang sudah dipanen dan dimasukkan ke dalam hemasitometer kemudian sel dihitung dibawah mikroskop.Untuk sel yang akan diberi perlakuan dilakukan transfer sejumlah sel yang diperlukan ke dalam conical yang lain dan ditambahkan media kultur sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan.
Uji sitotoksik dilakuakan dengan mengambil sel dari inkubator CO2 kemudian sel dipindahkan ke dalam sumuran masing-masing 100µl dan disisakan 3 sumuran kosong.Selanjutnya sel diinkubasi kedalam inkubator kemudian dibuat seri konsentrasi sampel untuk perlakuan.Setelah terbentuk seri konsentrasi sampel kemudian sel diambil dari inkubator dan media sel dibuang.Selanjutnya dimasukkan 100 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel kemudian dibuang dengan membalikkan plate dan sisa cairan ditiriskan dengan tissue. Selanjutnya seri konsentrasi dimasukkan ke dalam sumuran kemudian di inkubasi selama 24-48 jam. Setelah diinkubasi sel dikeluarkan dari inkubator dan media sel di buang dan di cuci dengan PBS 1x kemudian ditambahkan reagen MTT 100 µl ke dalam tiap sumuran termasuk kontrol media dan diinkubasi selama 2-4 jam sampai terbentuk formazan. Setelah terbentuk formazan ditambahkan stopper 100 µl SDS 10% dalam 0,1 N HCl.Selanjutnya plate dibungkus alumunium foil dan diinkubasi di tempat yang gelap pada suhu kamar selama satu malam.Hasil kemudian di baca dengan elisa reader dengan panjang gelombang 595 nm untuk mendapatkan data absorbansinya.Selanjutnya data absorbanso yang telah didapatkan diolah dengan Excell untuk mendapatkan regresi linear yang kemudian digunakan untuk menghitung prosentase sel hidup dan analisis harga IC50.
Uji Apoptosis
Pengamatan apoptosis dilakukan dengan menggunakan metode Double staining. Sel diambil dari inkubator CO2kemudian dilakukan panen sel dan perhitungan sel. Selanjutnya membuat pengenceran suspensi sel sehingga didapatkan konsentrasi sel akhir 5x104 sel/1000 μl MK kemudian disiapkan 24 well plate dan cover slip. Selanjutnya 1000 μl suspensi sel dipindahkan ke atas cover slip yang telah dimasukkan ke dalam sumuran untuk kemudian diinkubasi dalam inkubator selama semalam. Selanjutnya dibuat satu konsentrasi sampel yaitu pada IC50untuk perlakuan dan satu kontrol sel, masing- masing sebanyak 1000 μl. Kemudian sel yang telah diinkubasi diambil dan buang semua MK secara hati-hati dan dicuci dengan PBS masing-masing 500 µl dan kemudian PBS dibuang perlahan.
Selanjutnya sampel dengan konsentrasi tertentu dimasukkan sebanyak 1000 µl ke dalam sumuran. Untuk kontrol sel digunakan media dan untuk kontrol pelarut digunakan pelarut DMSO kemudian plate diinkubasi dalam inkubator selama 10 jam. Setelah inkubasi selesai plate dikeluarkan dari inkubator dan semua media dikeluarkan dari sumuran secara perlahan. Selanjutnya sel dicuci dalam sumuran dengan PBS masing-masing 500 µl kemudian PBS dibuang dengan hati-hati. Setelah PBS dibuang cover slip diambil menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati. Selanjutnya di atas object glass diletakkan cover slip dan diberi label. Selanjutnya sel ditetesi dengan reagen campuran etidium bromida-akridin oranye di atas cover slip dan digoyang perlahan untuk meratakan.Selanjutnya hasil diamati di bawah mikroskop flouresen.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam uji aktivitas antikanker ini digunakan ekstrak etanolik buah mengkudu dimana yang diduga memiliki aktivitas antikanker adalah senyawa antrakuinon yang ada di dalamnya yakni senyawa damnachantal, alizarin dan proxeronine. Ekstraksi diakukan menggunakan penyari etanol 70% karena senyawa-senyawa tersebut bersifat relatif polar, sehingga diharapkan senyawa tersebut akan tersari pada ekstrak yang diperoleh. Dari hasil uji pendahuluan analisis kandungan senyawa kimia pada ekstrak menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) diketahui bahwa ekstrak mengandung senyawa antrakinon dan flavonoid ditunjukkan dari adanya bercak yang menunjukkan adanya senyawa tersebut.
Selanjutnya untuk menguji aktivitas ekstrak etanolik sebagai agen antikanker payudara yang potensial dilakukan dua uji yaitu uji sitotoksik menggunakan metode MTT dan uji induksi apoptosis menggunakan metode pengecatan etidium bromide-akridin oranye. Dari hasil perhitungan uji sitotoksik, diketahui bahwa ekstrak etanolik Morinda citrifolia L. memiliki potensi cukup rendah dalam menghambat pertumbuhan sel kanker payudara MCF-7 ditunujukkan dari harga IC50 sebesar 1,17 mg/mL (Tabel 1). Menurut penelitian Ueda et al.
(2002) disebutkan bahwa suatu ekstrak dinyatakan aktif dan memiliki potensi besar untuk dijadikan agen antikanker apabila nilai IC50-nya kurang dari 100 μg/mL.
Tabel 1.Table dosis, absorbansi dan % viabilitas Dosis (μg/ml)
Absorbansi
rata-rata % Viabilitas
1 2 3
10 0.329 0.345 0.356 0.343 78.22
25 0.398 0.311 0.527 0.412 102.34
50 0.328 0.34 0.326 0.331 74.00
100 0.29 0.299 0.295 0.295 61.12
200 0.42 0.376 0.376 0.391 94.85
300 0.396 0.376 0.356 0.376 89.70
400 0.357 0.411 0.368 0.379 90.63
kontrol sel 0.417 0.409 0.39 0.405 100.00
KM 0.109 0.128 0.125 0.121
Nilai tersebut menunjukkan bahwa dengan konsentrasi yang diujikan masih belum mampu menghambat 50% pertumbuhan dari sel kanker MCF-7 (gambar 2).Tetapi bukan berarti dengan nilai IC50 yang sangat kecil, ekstrak tersebut semakin berpotensi. Hal tersebut disebabkan kekhawatiran dari sifat toksisitas yang berlebih akan menyebabkan kematian pada sel jaringan yang lain sehingga ekstrak tersebut bukan hanya menghambat pertumbuhan sel kanker tetapi juga menghambat pertumbuhan sel yang lain.
Gambar 2. Grafik Hasil Uji Sitotoksik Ekstrak Buah Mengkudu Pada Sel MCF-7
Pengamatan kematian sel dapat dilihat dari hasil uji induksi apoptosis. Apoptosis merupakan kematian sel yang terprogram yang tidak menyebabkan terjadinya inflamasi dan luka pada jaringan. Uji induksi apoptosis ekstrak etanolik buah mengkudu terhadap sel MCF-7 dilakukan dengan penambahan etidium bromida dan akridine oranye (double staining). ekstrak etanolik buah mengkudu diberikan dalam dua variasi dosis yakni dosis 500 μg/mL dan dosis 1000 μg/mL. Dosis yang diujikan lebih besar dari dosis uji sitotoksik sehingga diharapkan mempunyai efek apoptosis yang lebih tinggi. Sel yang hidup akan berfluorosensi hijau dengan penambahan etidium bromida, hal ini disebabkan karena enzim didalam mitokondria tidak mengalami kerusakan, sel yang tidak rusak akan dapat bereaksi dengan reagen etidium bromida yang berwarna hijau, sedangkan sel yang rusak akan dapat
menyerap reagen akridine oranye sehingga sel yang mati akan berfluorosensi oranye dengan pengamatan dibawah mikroskop flurosensce. Dari hasil pengamatan dapat dinyatakan bahwa ekstrak etanolik buah mengkudu dapat menginduksi apoptosis sel MCF-7 dan aktivitasnya akan meningkat dengan semakin tingginya pemberian dosis ekstrak (gambar 3).
Kontrol sel Dosis 500 g/ml Dosis 1000 g/ml Gambar 3.Hasil Uji Apoptosis Ekstrak Buah Mengkudu Pada Sel MCF-7
Kandungan senyawa antrakuinon, skopoletin, flavonoid dan alkaloid yang terdapat dalam buah mengkudu kemungkinan dapat menghambat sintesa DNA dan protein serta mampu menghambat sintesis RNA sehingga menyebabkan replikasi sel kanker payudara MCF-7 terganggu. Terganggunya proliferasi sel akan menghambat biosintesis membran sel sehingga mengakibatkan gangguan fungsi sel. Selanjutnya sel akan mengalami lisis dan kemudian mati.
Dari hasil kedua uji dapat terlihat bahwa ekstrak etanolik buah mengkudu memiliki potensi sebagai agen khemopreventif melalui mekanisme induksi apotosis. Senyawa yang diduga berpotensi adalah golongan senyawa antrakuinon dan flavonoid antara lain damnachantal, alizarin dan proxeronine yang pada penelitian sebelumnya telah terbukti memiliki khasiat sebagai antioksidan dan antibakteri. Kemudian dari hasil tersebut, buah mengkudu akan dapat dijadikan salah satu alternatif terapi untuk mencegah, menghambat, mengobati dan merehabilitasi pertumbuhan sel kanker payudara.
KESIMPULAN
1. Nilai IC50 ekstrak adalah sebesar 1117 μg/ml, sedangkan pada uji apoptosis menunjukkan adanya apoptosis sel kanker payudara MCF-7 lebih banyak pada dosis 1000 μg/ml dibandingkan pada dosis 500 μg/mL.
2. Buah mengkudu berpotensi sebagai agen khemopreventif melalui mekanisme apoptosis.
Penambahan dosis pemberian ekstrak mampu meningkatkan kemampuan induksi apoptosis terhadap sel kanker payudara MCF-7.
DAFTAR PUSTAKA
Bos FX., Ribes J., and Borras J. 1999. Epidemiology of Primary Liver Cancer.Sem.Liver Desease. 19(3): 271-285.
BPOM. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Depkes RI.
Ganiswara, S.G. 1995. ‘Farmakologi dan Terapi’. Bagian farmakologi Fakultas Kedokteran UI: Jakarta.
Hanahan, D. and Weinberg, R.A. 2000. The Hallmarks of Cancer, Cell, 100: 57-70.
Macdonald, F., Ford C.H.J. 1997. Molecular Biology of Cancer. Bio Scientific Publisher, Oxford, United Kingdom.
Meiyanto, E. 1999. Kurkumin Sebagai Obat Anti Kanker : Menelusuri Mekanisme Aksinya, Majalah Farmasi Indinesia, 10 (4): 224-236.
Mulyadi. 1997. Kanker, Karsinogen, Karsinogenesis, dan Antikanker. Cetakan pertama, Penerbit PT. Tiara Wacana Yogya, Yogyakarta.
Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., and Rodwell V.W.1990.’Kanker, Oncogen dan Faktor-faktor Pertumbuhan .’dalam Biokomia Harper, diterjemahkan oleh Hartono A. edisi 2, penerbit EGC, Jakarta.
Pitot, H.C., 1993, The Molekuler Biology of Carcinogenesis, Cancer, (72): 962-970.
Rizali, E., and Auerkari, E.I. 2003. Teknik pewarnaan Silver (AgNOR) sebagai Salah Satu Cara Menentukan Aktivitas Proliferasi Sel Tumor dan Apoptosis, JKGI;
10(3): 41-45.
Schneider, K. A. 1997.Cancer Genetics, Encyclopedia of Human Biology, 2nd Edition, Vol.2, Academic Press, London, 312-315.
Tjindarbumi, D., and Mangunkusumo, R. 2002. Cancer in Indonesia, Present and Future, Jpn. J. Clin. Oncol.: 32 (Supplement 1) 517-521.