PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN HBsAg100-GST SEBAGAI MODEL IMUNOGEN UNTUK MENGHASILKAN ANTIBODI PADA
MENCIT
• Latar Belakang:
kandidat vaksin hepatitis B rekombinan dengan teknologi rekayasa DNA menggunakan bakteri, hal yang melatar belakanginya yaitu karena hampir semua vaksin hepatitis B konvensional yang sudah mendapat lisensi saat ini adalah vaksin yang dihasilkan dari plasma. Namun, keberhasilan program imunisasi menyebabkan pasien hepatitis B yang akan menjadi sumber vaksin tersebut semakin berkurang yang berakibat pada semakin terbatasnya darah yang dapat digunakan sebagai sumber vaksin. Oleh sebab itu produksi vaksin hepatitis B dengan menggunakan plasma semakin sulit dilakukan. Kekhawatiran terhadap adanya kontaminan pada darah terutama oleh virus berbahaya seperti HIV.
• Kloning = kloning gen adalah suatu teknik rekayasa genetik untuk memperoleh replika yang sama dari dna target
• Proses Kloning
1. Penyiapa DNA target
• DNA targetnya = fragmen S (asam amino nomor 100-164) dari gen penyandi antigen permukaan virus hepatitis B
• Cara mendapatkan dna targetnya dengan PCR, dimana proses PCR yaitu membatasi asam amino 100 – 164 dengan menggunakan primer forward (100) dan primer revers (164).
Tekniknya yaitu dengan
1) Denaturasi = memecahkan DNA target dari doble helix menjadi untai tunggal pada suhu 94 C selama 30 detik.
2) anneling = proses penempelan primer pada bagian sekuen DNA yang akan di amplifikasi dimana cara kerjanya yaitu membatasi asam amino 100 – 164 dengan menggunakan primer forward (100) dan primer revers (164). dengan suhu 54 C selama 30 detik
3) Elongasi = proses pemanjangan primer dgn bantuan enzim polymerase (peneliti menggunaka enzym polymerase pyrobest dikarenakan enzim polymerase Pyrobest merupakan enzim dengan tingkat kecermatan tinggi (high fidelity) yang memiliki kemampuan proof-reading) pada suhu 72 c selama 30 detik. Jadi nanti primer forward akan melangkah maju sementara primer reversnya ada berjalan mundur.
2. Penyiapan Vektor
Vektor adalah molekul DNA yang dpt:
• Bereplikasi sendiri di dalam sel
• Dpt disisipkan DNA asing
• sudah dimodifikasi sesuai kebutuhan
jenis vektor yang digunakan yaitu plasmid dengan jenis pGEX- 4T-2
• vektor kloning , Syarat:
1) nanti vektor dimasukkan ke dalam sel bakteri sehingganya vektor harus dapat memperbanyak diri (replikasi), syarat untuk replikasi itu adanya daerah ORI (origin of replication)
2) MCS (multiple cloning site) untuk menyisipkan DNA target, jdi tdi kn sudah ada DNA target dan enzim restriksi selanjutnya DNA nanti akan dipotong oleh enzim restriksi Enzim yang digunakan yaitu enzim Sma1
3) Selectable marker / marker seleksi untuk menentukan proses ligasi berhasil atau tidak. Jdi kn nanti plasmidnya dimasukkan kedalam sel bakteri , nanti kita hrus tau mana yg berhasil disisipkan dna target dan mana yg tidak.
3. Ligasi
Ligasi adalah menggabungkan fragmen DNA target ke dalam DNA vektor pGEX-4T-2 dengan bantuan enzim ligase sehingga menghasilkan DNA rekombinan
4. Transformasi
Memasukkan plasmid rekombinan ke sel inang
Sel inang yang digunakan yaitu bakteri E. coli DH5α.
Dimana sel nya harus sel yag kompeten yaitu selnya harus di tretmen terlebih dahulu yaitu dengan
1) Sel kompeten disiapkan dengan cara sebagai berikut: 1 ml starter E. coli DH5α dimasukkan ke dalam 100 ml LB (media Luria Bertani) cair dan diinkubasikan semalam pada temperatur 18oC, kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit dalam temperatur 4oC.
Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan bufer transfer dengan cara menambah 27 ml transfer bufer, kemudian dihomogenkan dan didiamkan selama 10 menit di dalam serbuk es batu. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi lagi
dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit dalam temperatur 4oC dan supernatannya dibuang. Peletnya ditambah 6.4 ml transfer bufer dan dihomogenkan, kemudian didiamkan lagi 10 menit di dalam 29 es.
Selanjutnya ditambah 480 µl dimethyl sulfoxide (DMSO), homogenkan lagi dan didiamkam 10 menit di dalam es.
Selanjutnya didistribusikan ke tabung eppendorf dingin masing-masing 100 µl, kemudian disimpan di dalam freezer yang bersuhu -80oC sebagai sel kompeten siap digunakan untuk proses transformasi
2) Transformasinya dilakukan dengan metode hit shock dengan cara sebagai berikut: sebanyak 50 µl sel kompeten dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian ditambah dengan 1 µl plasmid rekombinan, kemudian didinginkan di dalam es selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan hit shock dengan cara tabung eppendorf yang berisi sel kompeten dan plasmid rekombinan dimasukkan ke dalam waterbath dengan temperatur stabil pada 42oC selama 30 detik, kemudian dipindahkan lagi ke dalam bok es selama satu menit, selanjutnya dimasukkan ke dalam falkon yang berisi 800 µl LB cair yang tidak mengandung ampisilin, dihomogenkan, kemudian dikultur selama 90 menit dalam shaker dengan kecepatan 120 rpm. Selanjutnya dipindahkan ke dalam tabung eppendorf berukuran 1.5 ml, kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama lima menit. Supernatan selanjutnya dibuang sampai tersisa sekitar 25 µl dan siap dikultur pada media seleksi (ampisilin50 µl/ml) yang mengandung X-gal dan IPTG untuk dilakukan skrining koloni yang mengandung plasmid rekombinan.
3) Seleksi
Koloni bakteri yang berwarna putih diduga membawa plasmid rekombinan pGEX-SR100, sedangkan koloni bakteri yang berwarna biru tidak membawa plasmid rekombinan. Dikarenakan pada bagian mcs dna target tidak menyisip pada plasmid, sehingga pada lacz nanti akan diubah menjadi enzim menghasilkan warna biru.
5. Skrining dan Sekuensing
Penentuan bahwa bakteri-bakteri berwarna putih pembawa gen SR100, maka dilakukan skrining dengan PCR menggunakan koloni bakteri tersebut sebagai cetakan (PCR Koloni). Primer yang digunakan untuk PCR koloni tersebut harus dapat mengamplifikasi bagian 5’-insert dan bagian 3’-dari plasmid. Hal ini dilakukan untuk memastikan tidak terjadi kesalahan arah insert. Amplifikasi hanya akan terjadi pada DNA rekombinan yang tidak tersambung secara terbalik. Adanya pita tunggal DNA dari gambar hasil elektroforesis merupakan indikasi bahwa klon yang diamplifikasi mengandung plasmid rekombinan. Jika gen target tersambung secara terbalik, maka PCR koloni tidak akan menghasilkan pita setelah elektrophoresis. Elektroporesis gel adalah analisis hasil pcr dengan teknik memisahkan dna berdasarkan bobot molekul dengan bantuan arus listrik.
Koloni yang mengandung plasmid rekombinan dengan hasil PCR koloni pita tunggal kemudian dikultur dari replika pada media LB pada suhu 37oC selama 12 jam dengan shaker untuk isolasi plasmid rekombinan. Hasil elektroforesis dari hasil isolasi plasmid rekombinan ditampilkan pada Gambar 9. Pada gambar tersebut terlihat hasil isolasi plasmid rekombinan dengan ukuran sekitar 5.106 pasang basa, yang terdiri atas vektor pGEX-4T-2 mencapai 4.900 pasang basa dan gen target 206 pasang basa.
Plasmid hasil isolasi tersebut kemudian disekuensing. Hasil sekuensing nukleotida disejajarkan dengan sekuen asli virus hepatitis B. Pensejajaran (alignment) gen insert dengan bagian genom virus Hepatitis B dapat dilihat pada Gambar 10. Hasil pensejajaran (alignment) sekuensing plasmid rekombinan yang diisolasi dari koloni bakteri rekombinan menunjukkan kesamaan dengan sekuen dari bagian genom virus hepatitis B. Hal ini menunjukkan bahwa gen hasil amplifikasi tersebut tidak mengalami mutasi dan dapat digunakan untuk menghasilkan antigen hepatitis B bagian S pada bakteri. Plasmid rekombinan yang tidak memiliki mutasi pada sekuen gen SR100 selanjutnya disimpan untuk ditransformasikan pada E. coli BL21 untuk memproduksi protein HBsAg100
Ekspresi
✓ Jenis sel inang yang digunakan pada Penelitian ini menggunakan E. coli DH5α serta E. coli BL21. E. coli DH5α merupakan bakteri inang yang umum dipergunakan untuk tujuan kloning dan memperbanyak plasmid, sedangkan E. coli BL21 merupakan inang yang umum digunakan untuk tujuan ekspresi. Perbedaan kedua strain bakteri E. coli tersebut adalah E.
coli DH5α memiliki banyak enzim protease baik di periplasma maupun sitoplasma, yang dapat mendegradasi protein rekombinan yang dihasilkan pada bakteri tersebut. Gen-gen penyandi enzim protease pada E. coli BL21 sudah dimutasi sehingga ekspresi protein rekombinan tidak akan mengalami degradasi yang intensif. Eskpresi protein rekombinan pada E. coli BL21 lebih tinggi dibandingkan pada E. coli DH5α. Hal ini dapat disebabkan oleh fusi dengan GST. Maeng et al. (2001) melakukan ekspresi gen virus hepatitis B secara parsial yang diikuti dengan menggabungkan gen tersebut (fusi) dengan gen penyandi enzim GST untuk meningkatkan ekspresi dan
kelarutan antigen permukaan hepatitis B pre-S2 pada E. coli menunjukkan terjadi peningkatan tingkat ekspresi antigen yang digabung dengan GST.
Cara produksinya protein 1. isolasi gen sisipan
jdi kan tadi sudah dapat di kloning gennya yang caranya diatas tadi 2. penyisipan ke vektor kloning (perbanyakn DNA / gen )
3. sub kloning ke vektor ekspresi = memindahkan gen dari vektor kloning ke vektor ekspresi
komponen vketor seleksi lebih kompleks dibandingkan dengan vektor kloning , karena ada komponen transkripsi yg berisikan (baca catatan), dan komponen translasinya berisi (baca catatan)
4. transformasi (jdi gen sisipannya telah dimasukkan ke dalam vektor ekspresi ) ke dalam sel inang (E.coli BL21 == selanjutnya rekombinan diproduksi di dalam sel (transkripsi, translasi), sehingga menghasilkan protein rekombinan yang telah dihasilkan oleh sel inang. Nanti selanjutnya dilakukan seleksi dan skrining seperti pada vektor kloning. Setelah yakin lalu proteinnya di isolasi
5. isolasi protein rekombinan (intrasel) tahapannya yaitu:
➢ sentrifugasi (pellet (bagian padatnya) sel diambil )
➢ pemecahan sel (lisis sel) menggunakan teknik sonikasi yaitu memecah sel bakteri berdasarkan gelombang suara
➢ sentrifugasi (supernatannya yang diambil, terdapat protein)
➢ pemekatan protein (biasanya protein masi encer karena masi bergabung dengan media pertumbuhan sehingga perlu pemekatan protein) dengan menggunakan garam amonium sulfat (9.08%
ammonium persulfate) dengan prinsip sallting in (saat kadar garamnya rendah maka protein menarik air sehingga protein larut sedangkan sallting out (jika ditambahkan garamnya maka nanti
garamnya akan berikatan dengan air sehingganya protein mengendap)
➢ penghilangan garam (yang mungkin masih ada di dalam protein ) = menggunakan teknik dialisis
6. pemurnian / purifikasi protein rekombinan tujuannya untuk memisahkan protein target dari protein yang lainnya
Pemurnian antigen rekombinan dilakukan dengan kolum GSTrap yang disambung dengan kolum HiTrap (Amersham, USA) 1 ml. Kolum tersebut dibilas 5 kali dengan binding buffer (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, dan 1.8 mM KH2PO4 pH 7.3). Setelah itu, sampel dimasukkan ke dalam kolum dan kolum tersebut ditempatkan di tempat yang lebih tinggi pada suhu 4 oC, sehingga memungkinkan menetesnya buffer maupun protein rekombinan dari dalam kolum. Kolum dibilas dengan elution buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced gluthatione, pH 8.0) untuk melepas protein rekombinan. Protein rekombinan akan terlepas dari kolum dan terlarut bersama elution buffer. Pengecekan terhadap supernatan yang keluar dari kolum dengan SDS-PAGE bertujuan untuk memastikan bahwa hanya protein rekombinan tersebut yang berhasil diikat oleh kolum. Adanya pita tunggal menunjukkan bahwa antigen yang dihasilkan adalah protein rekombinan (antigen permukaan hepatitis B-GST)
Inti dari isolasinya yaitu:
1) Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom
2) Protein rekombinan akan terlepas saat kolom dibilas dengan elution buffer. Protein rekombinan akan terlepas dari kolum dan terlarut bersama elution buffer.
3) Pengecekan terhadap supernatan yang keluar dari kolum dengan SDS-PAGE bertujuan untuk memastikan bahwa hanya protein rekombinan tersebut yang berhasil diikat oleh kolum. Adanya pita
tunggal menunjukkan bahwa antigen yang dihasilkan adalah protein rekombinan (antigen permukaan hepatitis B-GST)
