Penulisan tesis ini diajukan untuk memenuhi persyaratan program studi S1 Fakultas Farmasi Universitas Perintis Indonesia Padang. Judul yang ditulis oleh penulis adalah ”DNA BARCODE TANAMAN GAMBIR (Uncaria gambir (Hunter) Roxb.) BERDASARKAN Internal Transcribed Spacer-1 (ITS-1) GEN. dari berbagai pihak. Gambir adalah ekstrak kering dari ranting dan daun tanaman Uncaria gambir (Hunter) Roxb.
Latar Belakang
2 Gambir juga berfungsi sebagai antibakteri sehingga diproduksi sebagai obat kumur (Rahmawati et al. 2012). Potensi hasil (berat nira kering) ketiga varietas unggul tersebut cukup tinggi mencapai 1.200 kg/ha (Denian et al. 2004). Identifikasi jenis tumbuhan awalnya menggunakan metode morfologi yang diidentifikasi dari bentuk fisiknya (bunga, daun, batang, cabang dan biji) (Kalangi et al. 2014).
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Deskripsi Tanaman Gambir
Gambir riau gadang memiliki warna daun hijau tua sedangkan pucuk berwarna hijau muda dengan permukaan daun kasar dan lancip, gambir riau gadang sari daun no 3. Gambir mancik Gambir memiliki warna daun hijau tua sedangkan pucuk berwarna hijau kuning dengan permukaan daun mengkilap dan tepi daun bergelombang, tetapi daunnya lebih kecil dari gambir riau gadang, kualitas sari daun gambir mancik no 4. Gambir Cubadak memiliki warna daun hijau muda dan pucuknya berwarna hijau kekuningan, daunnya lebih lebar dan besar, permukaan daunnya cukup kasar, tepi daunnya bergelombang.
Kandungan Kimia Tanaman Gambir
Tanaman gambir memiliki 4 varietas yaitu gambir riau gadang, gambir mancik, gambir cubadak dan gambir belalang yang memiliki perbedaan morfologi dari warna daun dan warna pucuk. Sedangkan belalang gambir memiliki warna daun hijau kemerahan dan pucuknya juga berwarna hijau kemerahan, permukaan daun belalang gambir mengkilat dan berduri, sedangkan kualitas sari daun gambir paling tinggi (Sampurno et al., 2007). Katekin (C15H14O6) merupakan ekstrak dari gambir yang berpotensi sebagai antiinflamasi, antioksidan, antibakteri, antitumor dan antivirus (Nakagawa, 2005). (EGC) dan epigallocatechinalate (EGCG) (Hilpiani, 2012).
DNA Tumbuhan .1 Pengertian DNA .1 Pengertian DNA
- Struktur DNA
- Isolasi DNA
- Komponen PCR
- Tahapan PCR
Gen-gen ini dikodekan dalam materi genetik organisme yang kita kenal sebagai molekul DNA atau RNA pada beberapa virus. DNA template (cetakan) adalah fragmen DNA yang akan diamplifikasi dan berasal dari patogen dalam sampel klinis. PCR adalah teknik sederhana yang digunakan untuk mengamplifikasi molekul DNA secara in vitro di laboratorium.
PCR adalah metode yang sangat sensitif, sehingga satu pasang molekul DNA dapat dikalikan jutaan kali setelah 30-40 siklus PCR. PCR digunakan untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan mensintesis molekul DNA baru yang melengkapi molekul DNA target menggunakan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam termocycle. Enzim yang digunakan untuk mencetak sekuens molekul DNA yang baru dikenal disebut enzim polimerase Pencetakan sekuens ini dalam teknik PCR juga membutuhkan dNTP, antara lain dATP, dCTP, dGTP dan dTTP (Muladno, 2010).
Pada akhir siklus pertama, molekul DNA beruntai ganda digandakan jumlahnya menjadi dua molekul DNA beruntai ganda. Dua molekul DNA beruntai ganda diamplifikasi pada siklus pertama menjadi DNA target dan direplikasi menjadi empat molekul DNA, kemudian empat molekul baru direplikasi lagi menjadi delapan, dan seterusnya (Muladno, 2010). Denaturasi biasanya dilakukan antara 90-95ºC selama 3 menit untuk memastikan bahwa molekul DNA yang dimaksudkan untuk menggandakan jumlahnya telah benar-benar terdenaturasi menjadi untai tunggal.
Laju penambahan nukleotida oleh enzim pada 72°C diperkirakan antara 35 dan 100 nukleotida per detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target.
Elektrofiresis
Pengertian dan Prinsip kerja elektroforesis
Jadi, untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasangan basa, 1 menit lebih dari cukup untuk langkah ekstensi primer ini. Biasanya pada akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang menjadi 5 menit, sehingga diharapkan semua produk PCR berupa DNA beruntai ganda (Muladno, 2010). Penanda DNA yang terdapat pada ruang elektroforesis berperan sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi (Thopson & Fritchman.
Letak fragmen DNA yang terbentuk sebagai pita pada elektroforesis dapat diamati secara khusus dengan menggunakan zat warna. Etidium bromida memiliki keunggulan mudah digunakan dan akan memberikan warna terang bila terkena sinar UV.
Teknik elektroforesis
Media pendukung yang biasa digunakan adalah gel agarosa, gel kanji, gel poliakrilamida dan kertas selulosa poliasetat. Metode yang umum digunakan adalah model horizontal, karena memiliki beberapa keunggulan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik.
Kegunaan elektroforesis
Barkod DNA
Pengertian Barkod DNA
Hebert et al (2003) menjelaskan bahwa DNA barcoding adalah suatu teknik untuk membedakan spesies dan mengidentifikasi suatu spesimen dengan menggunakan sekuens pendek suatu gen yang posisinya dalam genom telah dibakukan (disepakati bersama) yang disebut sebagai “Barcoding DNA”. Menurut Krees dan Erickson (2009), DNA barcoding adalah proses di mana satu atau lebih sekuens gen pendek yang diambil dari bagian genom standar suatu spesies kemudian digunakan untuk mengidentifikasi spesies tersebut. DNA barcoding adalah teknik identifikasi organisme yang menggunakan fragmen gen tertentu yang telah diuji kemampuannya untuk berdiferensiasi pada tingkat spesies.
DNA barcoding adalah sistem baru yang dirancang untuk memberikan identifikasi spesies yang cepat, akurat, dan otomatis dengan menggunakan wilayah gen standar yang pendek sebagai penanda spesies internal. Selain menugaskan spesimen ke spesies yang diketahui, kode batang DNA akan mempercepat laju penemuan spesies dengan memungkinkan taksonomi menyortir spesimen dengan cepat dan dengan menyoroti taksa berbeda yang mungkin ada. Dengan meningkatkan kemampuan mereka dengan cara ini, DNA barcoding menawarkan taksonomi kesempatan untuk memperluas dan akhirnya melengkapi inventaris global keanekaragaman hayati (Hebert et al., 2003).
Analysis Barkod DNA
Manfaat Barkod DNA
Waktu Dan Tempat Penelitian
- Bahan
- Pengambilan Sampel
- Isolasi DNA
- Elektroforesis
- PCR dan Elektroforesis
- Analisis barkod DNA
Pengambilan sampel 10 lembar daun gambir dari masing-masing varietas (riau, mancik, cubadak, udang) dilakukan di Siguntur Pesisir Selatan (Lampiran 2, Gambar 3) 3.3.2 Identifikasi Gambir. isolasi DNA gambir menggunakan metode CTAB yang dikembangkan oleh Doyle (1987) dengan sedikit modifikasi oleh (Muhammad Fadli, 2016). Isolasi DNA dari daun muda tanaman gambir Daun tanpa urat daun diambil sebanyak 10 lembar dan digerus dengan letal sampai halus, lebih cepat lebih baik.
Aduk hingga tercampur rata, lalu inkubasi pada suhu 65°C selama 30 menit, balik setiap 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung Eppendorf 1,5 ml steril baru dan ditambahkan 1/10 volume larutan natrium asetat dan 1 ml etanol 99% dingin, kemudian tabung dibalik selama 1 menit sampai benang halus terlihat. Larutan dibuang dan pelet DNA dicuci dengan 500 µl etanol 70% dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, larutan etanol dibuang.
DNA dikeringkan pada suhu kamar di atas jaringan yang disuspensikan kembali dengan buffer TE 1 x 100 µl dan disimpan sebagai larutan stok pada suhu -20°C. DNA hasil isolasi dipipet 2 µl dan 1 µl loading buffer (BPB) ke dalam masing-masing tabung eppendorf, dicampur dan dimasukkan ke dalam sumur gel, penanda berat molekul pada sumur kedua diisi dengan 3 µl standar lambda (λ) dan kemudian siap untuk diisi. Setelah primer disusun dan disintesis, dilakukan amplifikasi DNA hasil isolasi Amplifikasi menggunakan primer yang telah dirancang dilakukan dengan teknik PCR Gradient (Biometra Germany) Reaksi PCR menggunakan KOD Master Mix Blue.
Setelah reaksi PCR selesai, elektroforesis dilakukan kembali, DNA yang telah diamplifikasi dipipet hingga 3 µl ke dalam well dan penanda berat molekul pada well lainnya diisi dengan 3 µL Ladder DNA 1 kb.
Hasil
Hasil penjajaran ITS-U1 (maju) sampel primer Gambir menunjukkan perbedaan pada rantai basa DNA Gambir Cubadak 13 dan 66 bp, pada rantai basa DNA Udang Gambir 66 dan 693 bp (Tabel V) 4.2 Pembahasan. Hasil pengukuran tingkat kemurnian hasil isolasi DNA pada (Tabel III) di atas menunjukkan bahwa keempat sampel gambir (Riau gadang, mancik, cubadak, udang) menghasilkan DNA yang masih mengandung kontaminan. Menurut Fatchiyah et al., 2011, hasil isolasi DNA murni (tanpa pengotor) sekitar 1,7 - 1,8 ng/µl, namun hasil isolasi DNA yang diperoleh tidak mencapai kisaran tersebut.
Hasil isolasi DNA yang dibubuhi primer ITS-U1 dan ITS-U4 berupa larutan bening tidak berwarna (bening) yang menunjukkan tidak adanya klorofil daun yang terlarut dalam larutan buffer yang digunakan selama DNA - isolasi tidak digunakan. proses (lampiran 6, gambar 10). Setelah melihat adanya DNA pada proses elektroforesis, selanjutnya dilanjutkan dengan proses PCR untuk menggandakan DNA yang terbentuk. Tujuan dari sekuensing adalah untuk menentukan sekuens basa DNA dalam sekuens molekul DNA yang relatif pendek sehingga dimungkinkan untuk mengetahui kode genetik dari molekul DNA tersebut.
Angka-angka di bagian atas kromatogram menunjukkan panjang basa nukleotida DNA yang diperoleh. Nilai % HQ kromatogram menunjukkan nilai 100% untuk gen ITS-1 pada sampel Gambir Riau Gadang, untuk sampel Gambir mancik menunjukkan nilai HQ sebesar 98%, untuk sampel Gambir Cubadak menunjukkan nilai HQ sebesar 97 %, sedangkan untuk sampel Gambir Udang menunjukkan nilai HQ sebesar 98%. Pada hasil BLAST di NCBI sampel Gambir Uncaria dari 4 sampel di atas secara berurutan Gambir (Riau, Mancik, Cubadak dan Udang) terlihat jelas bahwa urutan barcode ITS-1 sampel Gambir Riau Gadang menghasilkan tingkat kemiripan sebesar 99 , 29% dengan Uncaria macrophylla, sampel Gambir Mancik menghasilkan tingkat kemiripan sebesar 98,89% dengan Uncaria macrophylla, sedangkan sampel Gambir Cubadak menghasilkan tingkat kemiripan sebesar 99,02%.
Hasil penjajaran sampel primer Gambir ITS-U1 5´- GGA AGK ARA AGT CGT AAC AAG G -3´ (depan) ditemukan perbedaan rantai DNA: Gambir Cubadak pada urutan 13 bp dan 66 bp dan Gambir Udang pada urutan 66 bp dan 693 bp.karna hasil perbandingan menunjukkan bahwa gen Internal Transcribed Spacer-1 (ITS-1) mampu membedakan beberapa varietas (Uncaria Gambir (Hunter) Roxb.), yaitu Cubadak Gambir dan Shrimp Gambir.
Kesimpulan
Saran
Azma Risilvia ningsih (2019) Barcoding DNA pada tanaman gambir (uncariagambir(hunter) roxb.) Berdasarkan gen matk dan rbcl. Sebagai antihiperkolesterolemia dan penstabil darah Uncaria, tikus putih jantan (Mus Musculus) Khasiat Gambir (Hyperc, Gambir Roxb.) x Kutejensis) asal Kalimantan Timur,”.
Identifikacija kvasovk z analizo RFLP gena 5,85 rRNA in dveh ribosomskih notranjih transkribiranih distančnikov. GGAAGGTAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAA GGATCATTGTCGAATCCTGCGAAACGCACGACCGCGAACCTGTGTGAA CAACCGGGCGTCGGGTGGTAGGGGAGACTAAGCCCTCCATTCCCACCC GGCGCTCCCCGCGCGCTCGTCGCGCGGAAAACGTAACTCAAACCCGGC GCGGAACGCGC CAAGGAAAACTCAATAGGACTGTCGGGCCCTCGATG CCCCGTACGCGGTGTGCTCGGGGTGCCGCGGCGCCTGTCGTAATCCAA ACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGT AGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCG AGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCC CGAAGCCATCAGGCCAAGGGCACGT CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCGCCCCCACCCGTCGTGTGGG GCGGCGGATGTTGGCCTCCCGTGCCGTTAGGCGCGGCCCGGCCTAAATG AGAGTCCTCGGCGAGGGACGTCACGACGAGTGGTGGTTGAATGCCCC GACTCGAGTTTTGTTGTGCC GGTTCCCATCGTCGTCTTCGGCTCCACGG ATGACCCTAGTGCGCGATCCGATTGCAGTCGCGCCCCGACCGCGACCC CAGGTCAGGCGGGATTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGA GGAAAAAAGAAAAC. GGAAGGAAAAAAATCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAA GGATCATTGTCGAATCCTGCGAAACGCACGACCGCGAACCTGTGTGAA CAATCGGGCGTCGGGTGGTAGGGGAGACTAAGCCCTCCATTCCCACCC GGCGCTCCCCGCGCGCTCGTCGCGCGGAAAACGTAACTCAAACCCGGC GCGGAACGCGCCA AGGAAAACTCAATAGGACTGTCGGGCCCTCGATG CCCCGTACGCGGTGTGCTCGGGGTGCCGCGGCGCCTGTCGTAATCCAA ACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGT AGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCG AGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCC GAAGCCATCAGGCCAAGGGCACGT CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCGCCCCCACCCGTCGTGTGGG GCGGCGGATGTTGGCCTCCCGTGCCGTTAGGCGCGGCCGGCCTAAATG AGAGTCCTCGGCGAGGGACGTCACGACGAGTGGTGGTTGAATGCCCC GACTCGAGTTTTGTTGTGCCCG GTTCCCATCGTCGTCTTCGGCTCCACGG ATGACCCTAGTGCGCGATCCGATTGCAGTCGCGCCCCGACCGCGANCC CCAGGTCAGGCGGGATTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGG AGGAAAAAGAAAACTA.
Sistem Pencarian dalam Bold untuk sampel gambir mancik ITS urutan Peringkat Kelas Ordo Filum Famili Genus Kesamaan Spesies. Search Bold System untuk sekuen ITS1 sampel udang gambir Rank Class Phyllum Family Order Genus Species Similarity.
