THE EFFECT OF THE COMBINATION EXTRACTS ON HEPAR &
RENAL FEATURES IN SUBCHRONIC TOXICITY TEST
EFEK EKSTRAK KOMBINASI TERHADAP GINJAL & HEPAR PADA UJI TOKSISITAS SUBKRONIS
Studi Eksperimental Ekstrak Kombinasi Daun Katuk dan Kelor
Kamilia Dwi Utami1, , Qorry Amanda2, Ulfah Dian Indrayani3, Fadithya Rizki Nasafly4, Cyntia Andriana Ilahi5, Rizal Luthfi Prasetyo6
1,2,,3 Dosen Bagian Ilmu Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan
Agung Semarang
4,5,6Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan
Agung Semarang;
*Korespondensi : Ulfah Dian Indrayani, Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung, Jl Kaligawe KM 4 Semarang 50012 Telp (+6224) 6583584 Fax (+6224) 6594366, email :
ABSTRAK
Latar belakang: Daun katuk dan kelor memiliki efek antianemia yang dapat digunakan sebagai obat herbal terstandar yang harus melalui uji toksisitas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek kombinasi ekstrak daun katuk dan daun kelor terhadap fungsi hepar, ginjal dan hematologi.
Metode: Penelitian eksperimental post test only control group design. Subjek uji 72 ekor tikus galur wistar dibagi secara acak dalam enam kelompok dan masing-masing kelompok jantan:betina. KI dan KV merupakan kelompok kontrol dan kelompok kontrol satelit, KII, KIII, dan KIV merupakan kelompok perlakuan kombinasi daun katuk dan kelor secara berurutan kelompok dosis kecil, sedang, dan tinggi, serta kelompok VI merupakan kelompok dosis tinggi satelit. Pengambilan sampel untuk KI-KIV dilakukan pada hari ke-28, sedangkan KV dan KVI pada hari ke-42.
Hasil: Hasil uji Mann Whitney kadar SGPT tikus jantan menunjukkan adanya perbedaan bermakna diantara semua kelompok, kecuali kelompok 1& 5. Hasil analisis kadar SGPT tikus betina menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada semua kelompok kecuali pada
kelompok 2 dengan 3 dan kelompok 1 dengan 5. Semua nilai SGPT masih dalam rentang normal.
Kesimpulan: Pengaruh ekstrak kombinasi daun katuk dan kelor uji toksisitas subkronis.adalah aman pada rentang dosis terapi, akan tetapi meningkatkan ketoksikan pada dosis tinggi dan berpotensi menyebabkan ketoksikan yang tertunda setelah penghentian.
Kata kunci: Kombinasi ekstrak daun katuk dan kelor, fungsi hepar dan ginjal dan hematologi, uji toksisitas subkronis.
PENDAHULUAN
Pemanfaatan kombinasi kedua ekstrak daun katuk (Sauropous androgynous) dan kelor (Moringa oleifera) sebagai anti anemia memerlukan proses standarisasi farmasitikal sehingga dapat menghasilkan produk obat tradisional yang aman, berkualitas, berkhasiat dan bisa dipertanggungjawabkan (Indrayani et al., 2019).
Salah satu proses standarisasi farmasitikial yaitu dilakukannya uji toksisitas (Yuslianti, 2016).
Ekstrak daun kelor kering memiliki kandungan senyawa tembaga, mangan, nikel, kromium, timbal dan cadmium, dimana apabila terakumulasi dalam tubuh, dapat merusak organ ekskresi, sistem kardiovaskular serta kanker (Karthivashan et al., 2016). Toksisitas terkait ekstrak dapat juga diukur dengan parameter hematologis, pemeriksaan uji fungsi ginjal, dan hepar (Nigatu, 2012).
METODE PENELITIAN
Jenis penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan post test only control group. Subjek uji menggunakan tikus jantan dan betina Galur Wistar berjumlah 72 ekor dengan berat 150 – 250 gram. Tikus dibagi menjadi 6 kelompok secara acak, semua kelompok mendapatkan diet standar.
Kelompok II, III, IV, dan VI mendapat perlakuan selama 28 hari, selanjutnya kelompok I dan VI sebagai kelompok satelit tidak diberikan perlakuan hanya
diet standar sampai 42 hari. Kelompok II, III, IV dan VI diberikan ekstrak kombinasi daun katuk dan kelor satu hari sekali. Kelompok II mendapatkan dosis 75 mg/kg BB daun katuk dan 20 mg/kgBB daun kelor, kelompok III dosis 150 mg/kgBB daun katuk dan 40 mg/kgBB daun kelor, kelompok IV dan VI dosis 300 mg/kgBB daun katuk dan 80 mg/kgBB daun kelor. Kelompok I sampai IV diambil darahnya pada hari ke 28 diambil darah kemudian diterminasi untuk diambil jaringannya pada hari ke-28 sedangkan Kelompok V dan VI pada hari ke-42. Pemeriksaan kadar ureum, kreatinin, dan paramter hematologi menggunakan spektrofotometri. Pengamatan histopatologi ginjal dan hepar dilakukan dengan menggunakan mikroskop perbesaran 400x sebanyak 5 lapang pandang. Gambaran histopatologi ginjal dinilai dari rerata kerusakan tubulus proksimal ginjal menggunakan metode penilaian kerusakan berdasarakan skoring Miyaji. Gambaran hepar menggunakan ditentukan berdasarkan skor Manja-Roenigk yang dihitung rata – rata nya. Setelah data diambil dilakukan analisis data.
HASIL PENELITIAN
a. Kadar kreatinin
Gambar 1. Grafik rerata kadar kreatinin (a) tikus jantan dan (b) tikus betina Hasil uji One-Way-Anova pada kelompok tikus-jantan dan-betina didapatkan- nilai p sebesar 0,000 (p<0,05), dilanjutkan uji Post Hoc LSD=menunjukan=perbedaan=bermakna (p<0,05) pada setiap kelompok kecuali antara KI dan KII (p>0,05). Kelompok tikus betina menunjukan perbedaan
bermakna (p<0,05) pada setiap kelompok.
b. Histopatologi ginjal
Gambar 1.1 Rerata persentase kerusakan tubulus proksimal tikus jantan dan betina analisis efek toksik pada dosis betingkat
Hasil uji one way anova pada masing-masing tikus jantan dan betina yaitu sebesar 0,182 dan 0,402 , keduanya menunjukkan nilai p>0,05 yang berarti tidak terdapat perbedaan signifikan rerata persentase kerusakan tubulus proksimal antara kelompok I, II, III, dan IV secara signifikan baik pada tikus jantan maupun tikus betina.
Gambar 1.2 Gambaran Histologi Tubulus Kontortus Proksimal Tikus Jantan Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) dengan Perbesaran 400 X.
S : Swelling, DV : Degenerasi Vakuolar D : Deskuamasi, N : Nekrosis
Keterangan :
A : Kelompok I, B : Kelompok II, C : Kelompok III, D : Kelompok IV, E : Kelompok V, F : Kelompok V
KETERANGAN : A : Kelompok Kontrol B : Kelompok Uji 1 C : Kelompok Uji 2 D : Kelompok Uji 3 E : Kelompok Satelit Kontrol F : Kelompok Satelit Uji 3
A B
E F
C D
DV
D DV
D
S
N D
D DV
DV
D N
Gambar 1.3 Gambaran Histologi Tubulus Kontortus Proksimal Tikus Betina Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) dengan Perbesaran 400 X.
S : Swelling, DV : Degenerasi Vakuolar D : Deskuamasi, N : Nekrosis
Keterangan :
A : Kelompok I, B : Kelompok II, C : Kelompok III, D : Kelompok IV, E : Kelompok V, F : Kelompok V
KETERANGAN : A : Kelompok Kontrol B : Kelompok Uji 1 C : Kelompok Uji 2 D : Kelompok Uji 3 E : Kelompok Satelit Kontrol F : Kelompok Satelit Uji 3
A B
E F
C D
D
DV
D
N
D N
D
S
D
DV D S S
D
c. Histopatologi hepar
a.
b.
c.
d.
e.
Histopatologi hepar
Gambar 1. Rata-rata Skor Kerusakan Hepatosit
A : Analisis efek tikus jantan, B: Analisis efek tikus betina, C : Analisis kelompok uji dan satelit tikus jantan, D : Analisis kelompok uji dan satelit tikus jantan
Gambar 2. Gambaran Histopatologi Hepar Pewarnaan Hematoksilin- Eosin (HE) dengan Perbesaran 400 X.
DP : Degenerasi Parenkimatosa, DH : Degenerasi Hidropik DL : Degenerasi
Lemak, N : Nekrosis
Dilakukan Uji Parametrik dengan Oneway Anova pada tikus jantan didapatkan p=0.969 (p>0.05) dan Uji non parametrikpada tikus betina dengan Kruskal Wallis didapatkan p=0,061 (p>0,05).
2. Analisis Uji Reversibilitas ketoksikan a. Kreatinin
Gambar 2. Grafik rerata kadar kreatinin (a) tikus jantan dan (b) tikus betina Hasil uji Mann-Whitney pada setiap kelompok tikus jantan menunjukan- perbedaan bermakna (p<0,05) antar kelompok. Pada kelompok tikus betina yang telah dilakukan Uji Post-Hoc Tamhane-T2 menunjukan-perbedaan bermakna- (p<0,05) pada setiap kelompok betina kecuali antara KI dan KV (p>0,05).
b. Histopatologi ginjal (a) (b)
Gambar 2.1 Rerata persentase kerusakan tubulus proksimal tikus jantan dan betina analisis reversibilitas.
Hasil uji Mann-Whitney pada tikus jantan terdapat perbedaan bermakna (p
< 0,005) antara kelompok I dan kelompok VI, kelompok IV dan kelompok V, serta kelompok V dan kelompok VI. Pada tikus betina didapatkan perbedaan bermakna pada semua kelompok kecuali antara kelompok I dengan kelompok IV.
Histopatologi hepar
Pada analisis uji reversibilitas toksisitas antara kelompok uji dan satelit pada tikus jantan dan betina, dilakukan uji parametrik dengan Oneway Anova pada tikus jantan didapatkan p=0.002 (p<0.05) dengan tidak ada perbedaan antar semua kelompok uji pada Tamhane T2 dan Uji non parametrik pada tikus betina dengan Kruskal Wallis didapatkan p=0,55 (p>0,05) diartikan hasil tidak siginifikan antar kelompok pada tikus jantan dan betina pada kedua analisis uji.
PEMBAHASAN
Pada uji kelompok analisis efek tikus jantan didapatkan hasil ANOVA yaitu tidak terdapat perbedaan persentase kerusakan tubulus proksimal pada tikus jantan dan betina secara signifikan. Pada analisis efek kelompok I tikus jantan dan betina memiliki nilai rerata persentase kerusakan tubulus proksimal terendah. Kerusakan ini dapat diakibatkan karena efek pemberian eter pada saat terminasi, hal ini sejalan dengan penelitian sebelumnya bahwa terminasi yang dilakukan setelah 2 minggu aklimatisasi menggunakan eter dapat menyebabkan terjadinya distorsi cytoarchitectural sel ginjal dan terjadi peningkatan kadar ureum dan kreatinin namun hasil peningkatannya tidak signifikan (Aguwa et al., 2020). Pada kelompok II jantan dan betina terjadi peningkatan rerata kerusakan tubulus proksimal jika dibandingkan dengan kelompok I diduga akibat kandungan zat tanin pada daun katuk dan kelor yang akan bepengaruh pada penurunan Fe, kemudian berdampak pada penuruan oksigen yang mengakibatkan kondisi hipoksia, akibatnya terjadi penurunan respirasi oksidatif aerobik dan menurunkan laju transport elektron di mitokondria yang berakibat peningkatan ROS (Reactive Oxigen Spesies) dan sintesis NO (Nitrit Oxide) (Chen et al., 2018). ROS (Reactive Oxigen Spesies merupakan molekul persinyalan yang berperan dalam progresitas suatu inflamasi (Mittal et.al, 2014), adanya suatu inflamasi memicu TLRs (Toll-like receptors) pada sel epitel tubulus ginjal yang mengaktivasi sel-sel imun serta memperkuat respon inflamasi.
Proses inflamasi yang berkelanjutan dapat mengakibatkan kerusakan sel tubulus proksimal berupa pembengkakan sel, degenerasi vakuolar, nekrosis (Bonventre &
Yang, 2011).
Pada kelompok III jantan dan betina memiliki nilai rerata kerusakan tubulus proksimal lebih sedikit dibandingkan rerata kerusakan tubulus proksimal kelompok II. Kandungan flavonoid pada daun katuk dan kelor memiliki sifat sebagai antioxidan yang dapat melemahkan cisplatin yang merupakan nefrotosik agen melalui pengurangan ekspresi Nrf2, menurunkan ekspresi caspase-3 sebagai marker apoptosis, menghambat apoptosis akibat cisplatin, serta melindungi ginjal dari agen nefrotoksik (Vargas et al., 2018). Pada kelompok IV terjadi peningkatan rerata kerusakan tubulus proksimal baik pada tikus jantan maupun betina. Kandungan
tanin pada esktrak daun katuk dan kelor dengan dosis tinggi dapat berpengaruh terhadap pelepasan serta akumulasi NO. Hal ini mengakibatkan adanya kerusakan iskemik pada tubulus ginjal, ditandai dengan adanya kerusakan serta nekrosis pada sel tubulus (Bonventre & Yang, 2011).Peningkatan NO mempengaruhi penurunan ATP menyebabkan stress pada retikulum endoplasma, stress ini menyebabkan agregrasi junctional protein yang memicu peningkatan permeabilitas endotel pada tubulus sehingga dapat terjadi pembengkakan sel serta degenerasi hidropik.
Apabila menurunkan perlekatan sel tubulus pada matriks ekstraselular sehingga dapat mengakibatkan obstruksi serta deskuamasi pada tubulus proksimal (Farooqi
& Dickhout, 2016). Pada uji kelompok analisis efek rerata kerusakan tubulus proksimal ada beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat kerusakan yang terjadi pada tikus jantan maupun betina.
Peningkatan kerusakan pada tikus jantan diakibatkan karena pengaruh hormon testosterone. Hormon ini berperan dalam pengaturan enzim sitokrom P450 (CYP) di ginjal, salah satunya yaitu CYP2E1 yang bertanggung jawab untuk aktivasi metabolik beberapa polutan seperti benzene. Aktivasi metabolit polutan yang tinggi seperti benzene meningkatkan efek toksik ginjal yang lebih besar pada tikus jantan daripada tikus betina (Trevisan et.al, 2012). Selain itu pada tikus jantan memiliki ekspresi OCT2 (Organic cation transporter 2) yang lebih tinggi dibandingkan dengan tikus betina, OCT2 (Organic cation transporter 2) memodulasi terjadinya nefrotoksisitas akibat cisplatin (El-Arabey, 2015). Pada tikus betina efek estrogen dan progesterone dapat melemahkan tingkat aktivitas kaspase yang nantinya berpengaruh terhadap penurunan aktivitas cisplatin, sehingga dapat melindungi sel ginjal dari zat toksik (Grott et al., 2013).
Hasil uji Kruskal Wallis pada tikus jantan dan tikus betina (p<0,005) memiliki perbedaan rerata persentase kerusakan tubulus proksimal antar keempat kelompok analisis reversibilitas yang signifikan. Hal ini diduga adanya pengaruh penambahan selama 14 hari perlakuan yang dapat meningkatkan tingkat stress pada tikus , menurut penelitian (Zymantiene et al., 2016) bahwa semakin lama tikus ditempatkan di kandang dapat mempengaruhi tingkat kesehatan hewan uji.
Selain itu adanya interaksi dengan manusia, kondisi lingkungan kandang, serta pemberian perlakuan yang secara rutin dapat memicu respon stress pada hewan
uji. Respon stress pada penelitian ini berupa peningkatan konsentrasi glukosa dalam darah yang dinilai menjadi salah satu factor stress. Menurut (Hotamisligil, 2010) ERS (endoplasmic reticulum stress) merupakan respon selular terhadap stress, respon ini apabila berlebih dapat menginduksi ekpresi gen yang mengkode protein proapoptosis serta mengaktifkan jalur sinyal inflamasi seperti NF-κB/nuclear factor kB dan JUN N-terminal kinase (JNK) yang dapat mengakibatkan terjadinya kerusakan sel dan jaringan. Hal ini diakibatkan karena ERS (endoplasmic reticulum stress) memicu inflamasi terkait MCP-1 pada sel epitel tubulus, sel yang mengalami inflamasi menghasilkan protease, myeloperoxidase, ROS/ reactive oxygen species, dan sitokin yang dapat mengakibatkan peningkatan permeabilitas vascular, berkurangnya sel tubulus, dan penurunan integritas endotel (Bonventre & Yang, 2011).
Peningkatan rerata kerusakan tikus jantan pada kelompok I dengan kelompok V berkaitan dengan adanya hormon androgen yang berperan dalam kerusakan dan fibrosis ginjal akibat stimulasi vasokonstriksi terkait dengan produksi ET- 1/Endothelin 1 pada ginjal (Dousdampanis et al., 2014). Pada kelompok tikus betina tidak didapatkan terjadinya peningkatan rerata kerusakan tubulus akibat penambahan jangka waktu penempatan di dalam kandang, hal ini dikarenakan menurut (Grott et al., 2013) hormone estrogen dan progesteron dapat menghambat kematian sel yang diinduksi cisplatin akibat dari penekanan aktivitas caspase apoptosis yang diinduksi cisplatin.Menurut (Farooqi & Dickhout, 2016) faktor diet, stress, dan durasi paparan zat toksik dapat mempengaruhi tingkat kerusakan tubulus proksimal. Curah jantung, tekanan perfusi ginjal, serta hemodinamik glomerulus apabila mengalami gangguan dapat mengakibatkan kerusakan pada sel tubulus.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan dari penelitian ini adalah kombinasi ekstrak daun katuk dan daun kelor tidak berpengaruh terhadap gambaran histopatologi ginjal akibat tidak adanya perbedaan rata – rata persentase keruskaan tubulus proksimal ginjal yang bermakna secara statistik. Pada penelitian ini terdapat beberapa keterbatasan oleh karena itu perlu dilakukan penilaian awal kondisi kesehatan tikus secara keseluruhan sebelum perlakuan, dilakukan penelitian lanjutan
dengan menggunakan jangka waktu penelitian yang lebih lama untuk melihat dari efek reversibilitas, penelitian lanjutan yang mengamati tentang kandungan senyawa toksik dan interaksi masing-masing senyawa tersebut pada ekstrak kombinasi daun katuk dan daun kelor untuk melihat tingkat toksisitasnya terhadap ginjal
DAFTAR PUSTAKA
Aguwa, U. S., Eze, C. E., Obinwa, B. N., Okeke, S. N., Onwuelingo, S. F., Okonkwo, D. I., Ogbuokiri, D. K., Agulanna, A. E., Obiesie, I. J., &
Umezulike, A. J. (2020). Comparing the Effect of Methods of Rat Euthanasia on the Brain of Wistar Rats: Cervical Dislocation, Chloroform Inhalation, Diethyl Ether Inhalation and Formalin Inhalation. Journal of Advances in
Medicine and Medical Research, July, 8–16.
https://doi.org/10.9734/jammr/2020/v32i1730636
Bonventre, J. V., & Yang, L. (2011). Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Journal of Clinical Investigation, 121(11), 4210–4221.
https://doi.org/10.1172/JCI45161
Chen, R., Lai, U. H., Zhu, L., Singh, A., Ahmed, M., & Forsyth, N. R. (2018).
Reactive oxygen species formation in the brain at different oxygen levels: The role of hypoxia inducible factors. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 6(OCT), 1–12. https://doi.org/10.3389/fcell.2018.00132
Dousdampanis, P., Trigka, K., Fourtounas, C., & Bargman, J. M. (2014). Role of testosterone in the pathogenesis, progression, prognosis and comorbidity of men with chronic kidney disease. Therapeutic Apheresis and Dialysis, 18(3), 220–
230. https://doi.org/10.1111/1744-9987.12101
El-Arabey, A. A. (2015). Sex and age differences related to renal oct2 gene expression in cisplatin-induced nephrotoxicity. Iranian Journal of Kidney Diseases, 9(4), 335–337.
Farooqi, S., & Dickhout, J. G. (2016). Major comorbid disease processes associated with increased incidence of acute kidney injury. World Journal of Nephrology, 5(2), 139. https://doi.org/10.5527/wjn.v5.i2.139
Grott, M., Karakaya, S., Mayer, F., Baertling, F., Beyer, C., Kipp, M., & Kopp, H.
G. (2013). Progesterone and estrogen prevent cisplatin-induced apoptosis of lung cancer cells. Anticancer Research, 33(3), 791–800.
Hotamisligil, G. S. (2010). Endoplasmic Reticulum Stress and the Inflammatory Basis of Metabolic Disease. Cell, 140(6), 900–917.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.02.034
Indrayani, U. D., Sarosa, H., & , Atina Hussaana, B. W. (2019). The effects comparisons of Sauropus androgynous, Moringa oleiefera alone and in combination on iron deficiency in anemia rats. In Bangladesh Journal of Medical
Science (Vol. 18, Issue 1, pp. 136–140).
https://doi.org/10.3329/bjms.v18i1.39564
Karthivashan, G., Kura, A. U., Arulselvan, P., Isa, N. M., & Fakurazi, S. (2016).
The modulatory effect of Moringa oleifera leaf extract on endogenous antioxidant systems and inflammatory markers in an acetaminophen-induced nephrotoxic mice model. PeerJ, 7, 18. https://doi.org/10.7717/peerj.2127 Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., & Malik, A. B. (2014).
Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants and Redox Signaling, 20(7), 1126–1167. https://doi.org/10.1089/ars.2012.5149 Trevisan, A., Chiara, F., Mongillo, M., Quintieri, L., & Cristofori, P. (2012). Sex-
related differences in renal toxicodynamics in rodents. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology, 8(9), 1173–1188.
https://doi.org/10.1517/17425255.2012.698262
Vargas, F., Romecín, P., García-Guillén, A. I., Wangesteen, R., Vargas-Tendero, P., Paredes, M. D., Atucha, N. M., & García-Estañ, J. (2018). Flavonoids in kidney health and disease. Frontiers in Physiology, 9(APR), 1–12.
https://doi.org/10.3389/fphys.2018.00394
Zymantiene, J., Zelvyte, R., Oberauskas, V., & Spancerniene, U. (2016).
INFLUENCE OF METABOLIC CAGE ON WISTAR RAT Judita Zymantiene , Rasa Zelvyte , Vaidas Oberauskas , Ugne Spancerniene Department of Anatomy and Physiology , Veterinary Faculty of Lithuanian University. 39(1), 33–38.